LC / MS / MS分析氨基蛋白加合物与改进的敏感性:比较选择埃德曼异硫氰酸盐试剂

文摘

这项研究提供了一种新的简单的方法基础LC / MS / MS-based氨基蛋白加合物的筛查。这个过程“FI来标示荧光素E程序”sothiocyanate (FITC)提供了卓越的敏感性由LC / MS / MS在测量加合物()亲电子化合物的修改Edman过程。FI的原则E -是加合物,n端氨基酸中选择性地分离和测定的蛋白质经过异硫氰酸derivatisation埃德曼试剂。在这项研究中,FITC 4 n, N-dimethylaminoazobenzene异硫氰酸异硫氰酸酯(DABITC)和4-dimethylamino-1-naphthyl (DNITC)被用来合成thiohydantoin分析物从缬氨酸和N-methylvaline。LC / MS / MS的灵敏度提高了三个数量级与异硫氰酸苯酯和异硫氰酸pentafluorophenyl相比更高。低背景加合物的FITC试剂将使测量的水平。综合分析物的特征是,例如,核磁共振,核磁共振、LC / MS / MS和紫外线。

1。介绍

亲电子化学品/代谢物在体内可以通过测量监控产品(加合物)与蛋白质的反应,尤其是血红蛋白(Hb) [1- - - - - -3]。为此gc - MS / MS等方法优化N-alkyl Edman-procedure开发测量的加合物氨基端缬氨酸在Hb (4]。

虽然N-alkyl Edman-procedure已成为建立方法方法有其局限性,例如,加合物的范围,并用gc - ms进行分析是有限的。小加合物,例如,环氧乙烷(5),氧化丙烯(6)和丙烯酰胺(7,8),可以量化pmol / g球蛋白水平,这是足够敏感的测量背景加合物水平(水平一般人群中发现的)。然而,极地加合物更难以分析,由于限制的GC MS检测之前分离系统。一些可以解决这些障碍,例如,通过附加derivatisation屏蔽极性基团,例如进行测量glycidamide加合物在Hb (9]。然而,derivatisation极性基团既耗时又要求开发新程序为每个特定的加合物。此外,高分子量的加合物(500质量单位,μ)和热不稳定的加合物是极其困难的分析基于使用gc - ms N-alkyl Edman-procedure。

最近修改N-alkyl Edman-procedure已经出版,而不是利用质/女士测量加合物与异硫氰酸苯酯衍生化后(PITC) [10,11]或pentafluorophenyl异硫氰酸酯(PFPITC) [12),此过程中使用的试剂。这些芬内尔等人提出的修改方法。和Ospina et al。10,12,13)有一个更高的样品处理量与GC / MS分析。这个更高的吞吐量的主要原因是清理过程进行固相萃取(SPE)列,可以容易自动化。额外的好处是,进一步衍生化步骤的特定分析物(例如,从极地加合物,如N - [2-hydroxycarbamoylethyl]缬氨酸)可以被排除在外。

尽管现有的加合物测量方法已经开发并部分自动化,球蛋白(14和最近显示红细胞15仍然必须从全血分离和分析物的净化包括几个步骤,以选择性地丰富所需的分析物。此外,很难建立一个multianalyte筛选过程与分析物有不同的极性,这通常会要求额外的纯化步骤。

旨在克服这些问题,本研究的目的是评估的作用利用异硫氰酸盐试剂对主要形成时的灵敏度分析物与LC / MS测定离子阱和LC / MS三重四极的乐器。远程目标已经提出一个更直接的和通用的方法加合物测量。利用异硫氰酸盐试剂,例如,FITC导致分析物的形成具有荧光特性的替代路线质/女士测试通过毛细管电泳分离和光谱测量。

三个新的异硫氰酸盐试剂选择和比较与先前使用的试剂在N-alkyl埃德曼过程。研究了异硫氰酸酯试剂和反应在图1。的thiohydantoin分析物和研究参考化合物在表1。选中的异硫氰酸盐试剂包含以下ionisable组、羧酸集团异硫氰酸荧光素(FITC)和叔胺4-dimethylaminoazobenzene -异硫氰酸异硫氰酸酯(DABITC)和4-dimethylamino-1-naphthyl (DNITC)。这三个试剂与缬氨酸反应或N-methylvaline,甲基化模式和正常valyl终端在Hb,形成甲基化和nonmethylated valyl thiohydantoins1- - - - - -6(见图1和2)。这些分析物的特征和相对反应测定LOD在两个不同的LC / MS / MS系统在各种分析条件。然后获得的数据与结果分析物中形成N-alkyl Edman-procedure,主要PTH-MeVal (7),但也与PFPTH-MeVal (8)和PFPTH-HOEtVal (9)。

2。实验程序

2.1。化学物质

Fluorescein-5-isothiocyanate(异构体,90%)和钠cyanoborohydride(丙烯酰胺);4 n, N-dimethylaminoazobenzene异硫氰酸异硫氰酸酯(DABITC) 4-dimethylamino-1-naphthyl (DNITC)(穿越);L-valine (Val), N- - - - - -methyl-D L-valine (MeVal)、5-isopropyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (7,PTH-MeVal)和硼氢化钠磷酸盐缓冲剂(σ);²H₃乙腈(²H₃雨,99.8%²H), (²H)氯仿(CDCl₃,99.8%的²H)、氧化氘(²H₂啊,99.9%²H),²H₄- (99.8%²H) (CIL,安多弗,MA)获得的来源。5-Isopropyl-1-methyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (7PTH-MeVal) 5-isopropyl-3-pentafluorophenyl-2-valinethiohydantoin (8,PFPTH-MeVal)和1-hydroxyethyl-5-isopropyl-3-pentafluorophenyl-2-thiohydantoin (9,PFPTH-HOEtVal)是合成如前所述16]。所有其他化学物质和溶剂均为分析纯。化合物的结构1- - - - - -9和缩写词表1。

2.2。核磁共振分析

¹H和¹³270 C NMR光谱被记录在JEOL GSX仪器在270 MHz。使用的所有溶剂完全氘;四甲基硅烷(TMS)作为参考使用添加在氯仿、乙腈(ACN)和甲醇(甲醇)作为内部标准。

2.3。薄层色谱分析

使用硅胶薄层色谱进行60 f - 254板(SiO₂,默克公司)和斑点可视化与紫外线(254海里)和长波长(378海里)。熔点测定使用Buchi 535仪器。pH值的测量进行了使用一个猎户EA 920酸碱计配备了罗斯8130玻璃电极。

2.4。LC / MS / MS分析

两个不同的LC / MS系统。LC / MS-system 14000年由一个变阻器lc泵(瑞士巴塞尔通量仪器)界面上的一个LCQ女士(美国CA ThermoQuest)。电喷雾电离(ESI)和大气pressure-chemical电离(APCI)被用于一个积极的和消极的模式。0.1%的组织,0.1%的醋酸铵和0.3 mM氨水,pH值被用作修饰符。仪器设置(ESI):权力平等主义的流动水缓冲/ ACN [200 (v / v)]μ80 L / min,剪切气流(N₂10)、辅助气体流量(N₂),喷涂电压5000和V,毛细管温度250°C,毛细管10和电压V。仪器设置(APCI):权力平等主义的流动水缓冲/ ACN [500 (v / v)]μ70 L / min,剪切气流(N₂15 (N),辅助气体流量₂),毛细管温度150^˚C,毛细管电压5对V,蒸发温度为500°C,放电电流5μ答:注射体积是5μL和分析物溶解在溶剂混合物浓度从10μ克/毫升1 ng / mL,取决于他们的反应和操作条件。决定在MS-MS模式由collision-induced离解(CID) [M + H]⁺离子。软件Xcalibur(1.1版)是用于数据采集、LOD是由信号噪声(S / N),在一式三份样本注入每个化合物和浓度。LC / MS数据提出了研究化合物(1- - - - - -9)取得了这个系统,除非另有说明。

LC / MS系统2由一个安捷伦1100系列LC系统(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)界面上的一个API365 triple-quadrupole (MS / MS)检测器与涡轮electrospray-interface (ESI)从Sciex康科德,,加拿大。一个Xterra列C18 (3.5μ1.0米,100毫米)是使用一个权力平等主义的流在50岁μ测定L / min的相对响应(LOD)。喷射阀是一个六方标准阀Valco (VICI国际、瑞士)。在正离子模式下的混合流动相是H₂O / (ACN0.1% (v / v)]酸化与三氟乙酸(组织)。在负离子模式下的流动相是水/ ACN [(v / v)]缓冲与三乙胺乙酸(TEAOAc, pH值7)。仪器设置:declustering 65与潜力V,关注潜在的300V,入口10与潜力V,碰撞细胞26.5和出口潜力V, 54和碰撞能量V,在离子源12.5和8.0厘米距离,偏差在离子源7.5和4.0厘米,喷雾器气体(N₂)在两种模式设置为15,窗帘气体(N₂在两种模式)设置为15,碰撞气体(N₂)设置为10和2、离子喷雾电压3800和V,蒸发温度在两种模式。

测量LOD的化合物2,4,6,7进行该系统使用正面和负面的离子模式。优化后的碰撞能量转化前体离子([M + H]⁺或[MH]^{- - - - - -})产品离子与最强的离子强度(100%)是用于多反应监测(MRM)模式。1.4.1软件分析师(版本)是用于数据采集、LOD是由信号噪声(S / N),和样本注入一式三份为每个化合物和浓度。

2.5。高效液相色谱紫外分析

化合物的保留时间,1- - - - - -7和确定PTH-Val日本岛津公司LC-4A(日本京都)高效液相色谱系统是与一个Kromasil LC-18列(25010毫米)和日本岛津公司SPD-2AS紫外线(D₂灯)检测器。流量为1.0毫升/分钟和移动阶段(H₂O / ACN /组织,95/5/0.1)、B (H₂O / ACN /组织,20/80/0.1)。化合物的梯度剖面5- - - - - -7和PTH-Val举行50% B 5分钟,然后在20分钟内增加100% B, B 5分钟保持在100%。化合物的梯度剖面1- - - - - -4举行100% 5分钟,然后增加到100% B在20分钟内,保持在100% B 5分钟。化合物(100μ每米)被注入到50μL循环。下面的波长被用于测量的保留时间,268 nm (1和2)、265 nm (3,4,PTH-Val,7)和260海里(5和6)。获得保留时间如下:24.5分钟(1),26.2分钟(2),20.3 (3),24.8分钟(4),18.1分钟(5),20.9分钟(6),14.0分钟(PTH-Val)和17.7分钟(7)。

2.6。毛细管电泳(CE)

分离是一个惠普的3 d CE列上执行(安捷伦、钙、美国)五频二极管阵列紫外检测器。熔融石英毛细管(身份证。50μ375米,外径。μ米),总长度为64厘米,一个有效使用56厘米的长度。分离电压是kV,导致分离的32μa .缓冲系统是由17毫米磷酸盐缓冲剂(pH值调整到7)包含20毫米SDS和注射成交1问。

2.7。荧光测量

激发和发射光谱被记录在水:乙腈解决方案()缓冲pH值1,3,5,7,9 0.1标准缓冲(确切成分提出了显示数据)用日本岛津公司RF5000荧光分光光度计。发射扫描激发波长以上从10 nm,锁定在最优波长吸光度确定从上面描述的紫外吸光度测量,600海里。激发然后扫描从200纳米到10纳米以下发射波长锁定在发射期间获取的最佳波长扫描。荧蒽作为参考。

2.8。参考化合物的合成/分析物

2.8.1发布。荧光素的合成5 - (4-isopropyl-2-thioxo-imidazolidin-5-one) (1FTH-Val)

从0.50 L-valine原液(20更易在40毫升0.25 KOH), 5.0毫升整除(2.5更易Val)被加热到45°C,然后用FITC反应(0.50更易,199毫克,溶解在6毫升二氧六环/ H₂啊,)。90分钟后的反应是打断当所有FITC已经消耗(TLC)上所见和中间,thiocarbamoyl-valinate荧光素,转化为活塞环搭FTH-Val添加1毫升(12更易)盐酸(HCl)。为了方便起见,这个反应14小时后停止在45°C。溶剂蒸发真空下,剩下的干燥固体溶解在水组成的两相溶剂体系:乙酸乙酯(层)(,总体积60毫升)。层阶段提取与H₂O(15毫升)。合并后的含水阶段然后提取层(20毫升)和结合层与第一层阶段,最后提取与H₂O (毫升)。有机相是干Na₂所以₄。经过过滤和蒸发残渣是溶解在层/甲醇(,v / v)和柱层析法纯化(SiO₂,与层/甲醇(cm)筛选了,v / v)。包含产品的分数总和,干通过蒸发和结晶从乙醇/ H₂O (,v / v)产量167毫克(68%)所需的产品。分析:一下。232.5 - -234.5°C, Rf-TLC 0.65(层/甲醇,,v / v)、紫外线(H₂O /雨,,v / v),21500年。荧光测量(0.10μ美元的薪酬。1在H₂O /雨,缓冲与v / v,酸碱7 0.1磷酸盐缓冲剂7)例如波长492 nm, em.波长515 nm (max)(见图2)。¹H NMR (²H₆丙酮),25°C)δ1.08、1.18 (d + d, 3 + 3 h,6.6赫兹,CH₃ 2.38],[m, 1 h,,6.9赫兹,CH (β),2.86 (s, 1 h,而不是分配)4.4 (d, 1 h,赫兹,CH (α),6.66 - -6.77 [6 h,最为明显的峰值为6.71 m, xanthene-H], 7.39, 7.42 (d + d, 1 h,8.2赫兹,C₇- h) 7.74, 7.77 (d + d, 1 h,8.2赫兹,C₆- h), 7.96 (d, 1 h,赫兹,C₄0 - h) 9日[s, 2 h,氧杂蒽-(哦)₂5)9日(s, 1 h, h)。¹³C NMR (²H₆丙酮/ CD₃开发部,v / v 25°C)δ17.0、18.9 (CH₃(,),32.5 (CH (β),66.3 (CH (α),103.7,113.8,125.9,126.1,130.5,154.0,161.3(氧杂蒽碳),136.5,136.9 (C₂+ C₅),169.9(首席运营官),175.2(有限公司),184.6 (CS)。五个碳原子的化学变化不是给定的(不可能独立于背景噪音)。然而,碳展示按照预测变化的化合物1在假定spiroconformation (cf希望图3)。分析LC / MS、ESI正离子模式了m / z489.2 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z487.2(米H]^{- - - - - -}。分析LC / MS / MS (ESI +,碰撞能量40 V),产品离子m / z489.2 (rel. int。29%):m / z446.1 [M + H⁺390.3 - 43 (-isPr) 16%], [M + H⁺- 99 (FITC + H⁺),100%),使用相同的离子,形成在测量LOD LC / MS / MS APCI +(碰撞能量40 V)。LC / MS / MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z487.2 (rel. int。3%): 443.2 (M^{- - - - - -} H - 44 (-isPr + H)^{- - - - - -},100%),m / z384.2 [(MH - 103)^{- - - - - -},6%),372.1 (M^{- - - - - -}-115 - H(荧光素异氰酸酯阴离子- H), 17%), 288.5 ((M^{- - - - - -} H - 202), 15%)。

2.8.2。荧光素的合成5 - (4-isopropyl-3-methyl-2-thioxo-imidazolidin-5-one) (2FTH-MeVal)

从0.500 MeVal原液(20更易在40毫升0.25 KOH), 5.0毫升整除(2.5更易MeVal)被加热到45°C,然后用FITC反应(0.50更易,199毫克)溶解在6毫升二氧六环/ H₂O ()。这个反应被薄层色谱监测,90分钟后所有的FITC被消耗。为了提取产品形成的,解决方案包含FTH-MeVal与浓盐酸酸化(1毫升,12更易)并提取如上所述。蒸发干燥后产品通过柱色谱法纯化和结晶如上所述,收益率194毫克(77%)所需的产品。分析:一下。213.5 -217°C, Rf-TLC 0.64(层/甲醇,,v / v)、紫外线(ACN / H₂啊,,v / v)海里,17 500。荧光测量(0.10μ美元的薪酬。2在H₂O /雨,磷酸缓冲v / v, 0.1米缓冲pH值7)例如波长492 nm, em.波长515 nm (max)(见图2)。¹H NMR (²H₆丙酮,25°C)δ1.01、1.25 (d + d, 3 + 3 h,赫兹,CH₃(,2.57)],[m, 1 h,,6.9赫兹,CH (β),2.87 (s, 1 h,而不是分配)3.4 (s, 3 h, N-CH₃),4.4 (d, 1 h,赫兹,CH (α),6.65 - -6.77 [6 h,最为明显的峰值为6.71 m, xanthene-H], 7.39, 7.42 (d + d, 1 h,8.2赫兹,C₇- h) 7.72, 7.75 (d + d, 1 h,8.2赫兹,C₆- h), 7.93 (d, 1 h,赫兹,C₄0 - h) 9日[s, 2 h,氧杂蒽-(哦)₂]。¹³C NMR(丙酮、25°C)16.3、17.5 (CH₃(,),30.3 (CH (β33.1)],[N-CH₃),69.3 (CH (α),103.5,113.5,125.4,125.7,130.2,153.4,153.8,160.5(碳氧杂蒽)136.6 (C₂或C₅),168.7(首席运营官),172.7(有限公司),182.7 (CS)。六个碳原子的化学变化不是给定的(不可能独立于背景噪声);然而,变化展示根据化合物的预测变化2在假定spiro-conformation (cf希望图3)。分析LC / MS、ESI正离子模式了m / z503.3 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z501.2(米H]^{- - - - - -}。分析LC / MS / MS (ESI +,碰撞能量40 V),产品离子m / z503.3 (rel. int。47%):m / z460.1 [M + H⁺390.3 - 43 (-isPr), 100%], [M + H⁺ (FITC + H⁺),19%)。LC / MS / MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z501.2 (rel. int。0%):m / z457.3(米^{- - - - - -} H - 44 (-isPr + H), 100%)。LC / MS / MS (APCI +,碰撞能量40 V),产品离子m / z503.2 (rel. int。10%):m / z460.1 [M + H⁺390.3 - 43 (-isPr), 100%], [M + H⁺ (FITC + H)⁺,30%]。LC / MS / MS (APCI -,碰撞能量V)、产品离子m / z501.2 (rel. int。10%):m / z457.3(米^{- - - - - -} H - 44 (-isPr - H), 100%)。

2.8.3。合成3 - [4 - (4-dimethylamino-phenylazo)苯基]5-isopropyl-2-thioxo-imidazolidin-4-one (3DABTH-Val)

从0.500 L-valine原液(20更易在40毫升0.25 KOH), 5.0毫升整除(2.5更易Val)加热到60°C和混合0.10 DABITC(5.0毫升,0.50更易)在二氧六环。为了获得一个齐次解,一个额外的3.5毫升二氧六环和2.5毫升H₂O是补充道。是由薄层色谱监测反应(层/甲醇,,v / v)和30分钟试剂后,DABITC,已经被吃掉了。12更易与浓盐酸(1.0毫升,是为了把4 n, N-dimethylaminoazobenzene-thiocarbamoyl-valine形成相应的活塞环搭DABTH-Val (3)。这个反应也进行TLC(甲苯/层,,v / v;点开发的紫外线和长波长光),发现30分钟后完成60°C。解决方案与氯仿提取(25毫升)和H₂O(25毫升),水相从而获得KHCO中和之₃,产品从这个阶段与氯仿提取(2×25毫升)。这与H氯仿相随后被提取₂O(25毫升),然后用Na干₂所以₄。过滤和蒸发后,获得的橘红色的固体结晶从二氯甲烷/正己烷()来描述产品的产量132毫克(69%)。分析:一下。225°C, Rf-TLC 0.73(层/甲醇,,v / v)、紫外线(ACN / H₂啊,,v / v)海里,28 000。¹H NMR (CDCl₃25°C)δ1.06、1.15 (d + d, 3 + 3 h,7.1赫兹,CH₃(,2.39)],[m, 1 h,,6.9,7.1赫兹,CH (β),3.09(年代,6 h, N (CH₃)₂)4.18 (d, 1 h,CH (α),6.75,6.77 (d + d, 2 h,偶氮苯C₆- h, C₇- h) 7.39, 7.41 (d + d, 2 h,偶氮苯C₅- h, C₈- h) 7.88, 7.90, 7.94, 7.96 (4 d, 4 h,偶氮苯C₁汇丰银行₄- h)。分析LC / MS、ESI正离子模式了m / z382.2 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z380.2(米H]^{- - - - - -}。分析LC / MS / MS (ESI +,碰撞能量40 V),产品离子m / z382.2 (rel. int。2%):m / z339.1 [(M + H⁺- 43 (-isPr), 2%), 283.1 ((M + H - 99, DABITC + H)⁺19%,232.9],[(M + H⁺- 149 (-PhNMe₂),25%),205.0 ((M + H⁺- 177),100%)、LC / MS / MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z380.2 (rel. int。2%):m / z337.0(米^{- - - - - -} H - 43 (-isPr), 4%), 264.3 [M^{- - - - - -} H - 116, 100%)。

2.8.4。合成3 - [4 - (4-dimethylamino-phenylazo)苯基]5-isopropyl-1-methyl-2-thioxo-imidazolidin-4-one (4DABTH-MeVal)

从0.50 MeVal原液(20更易在40毫升0.25 KOH), 5.0毫升整除(2.5更易MeVal)加热到60°C和混合0.10 DABITC(5.0毫升,0.50更易)在二氧六环。为了获得一个齐次解另一个3.5毫升二氧六环和2.5毫升H₂O被添加。这个反应混合物变得不均匀混合物Val相比,表明DABTH-MeVal形成沉淀。是由薄层色谱监测反应(SiO₂甲苯/层,v / v;点开发的紫外线和长波长光),30分钟后DABITC被消耗。后续的提取进行如上所述。产品结晶从二氯甲烷/正己烷(,v / v)产量189毫克(99%)所需的产品。分析:一下。164.5 -169°C, Rf-TLC 0.73 (SiO₂;层/甲醇,,v / v)、紫外线(ACN / H₂O,v / v)海里,000年26岁,¹H NMR (CDCl₃25°C):δ1.05、1.25 (d + d, 3 + 3 h,7.1赫兹,CH₃(,2.47)],[m, 1 h,,6.9,7.1赫兹,CH (β),3.09(年代,6 h, N (CH₃)₂]3.4 [3 h, N-CH₃),4.4 (d, 1 h,赫兹,CH (α),6.74,6.77 (d + d, 2 h,偶氮苯C₆- h, C₇- h) 7.37, 7.40 (d + d, 2 h,偶氮苯C₅- h, C₈- h) 7.87, 7.90, 7.92, 7.95 (4 d, 4 h,偶氮苯C₁汇丰银行₄- h)。分析LC / MS、ESI正离子模式了m / z396.2 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z394.3 (mh)^{- - - - - -}。分析LC / MS / MS (ESI +,碰撞能量40 V),产品离子m / z396.2 (rel. int。3%):m / z353.1 [M + H⁺246.9 - 43 (-isPr), 7%], [M + H⁺- 149 (DABITC + H⁺),35%,219.0],[M + H⁺- 177 (-PhNMe₂),100%)。使用相同的离子,形成在测量LOD LC / MS / MS APCI +(碰撞能量38 V)。178.1 [(M + H⁺- 218)⁺,8%]LC / MS / MS (ESI -碰撞能量V)、产品离子m / z394.3 (rel. int。2%):m / z379.3(米^{- - - - - -} H - 15(加),100%),366.2 [M^{- - - - - -} H - 28(有限公司),6%),239.2 [M^{- - - - - -} H(N、N-dimethyl-4-azodianiline - H)^{- - - - - -},26%]。

2.8.5。合成3 - (4-dimethylamino-naphthalene-1-yl) 5-isopropyl-2-thioxo-imidazolidin-4-one (5DNTH-Val)

L-Valine(804毫克= 6.86更易)碱性与KOH(3.43更易),溶解在0.5 KHCO₃(3毫升)和二氧六环(3毫升)。这个解决方案是激烈的通过磁力搅拌和DNITC(88毫克,0.38更易)溶解在二氧六环(2毫升)被添加到悬架。是由薄层色谱监测反应(SiO₂;层/甲醇,,v / v;纯甲苯,甲苯/层,,v / v)使用引用没有缬氨酸。60分钟反应完成后,因为没有DNITC可以检测到TLC和carbamoylated产品形成,即N - [4 - (N-dimethylamino) 1-naphthalenyl] -thiocarbamoyl --valinate给在长波长荧光紫外灯下(视为尾矿在TLC筛选了层/甲醇,,v / v)。反应混合物与3毫升浓盐酸酸化(36更易)。2个小时后通过添加固体KHCO,反应混合物中和₃直到没有更多的二氧化碳被释放了。反应混合物与水稀释(100毫升)和CHCl产品纯化提取₃(125毫升)。有机相是干Na₂所以₄和过滤,溶剂被蒸发产生126毫克(96%)所需产品的白色固体。分析:一下。107.5 -110°C, Rf-TLC 0.73(层/甲醇,,v / v)、紫外线(ACN / H₂啊,,v / v)海里,000年21,¹H NMR (²H₆丙酮,25°C)δ1.10、1.25 (d + d, 3 + 3 h,7.1赫兹,CH₃(,)分配给thiohydantoin], 1.17 - -1.21 (d + d, 3 + 3 h,赫兹,CH₃(,2.40)分配给thiocarbamoyl], [m, 1 h,,6.9赫兹,CH (β),2.92(年代,6 h, N (CH₃)₂)4.45,4.56 (d + d, 1 h,,3.85赫兹,CH (α17-8)],7日,32 (m, 6 h, naphthalene-H)。¹³C NMR (²H₆丙酮,25°C)δ16.8、17.4;18.7、19.0 (2 x CH₃(,),31.66;32.0 (2 x CH (β),45.4 (N - (CH₃)₂),65.7;66.1 (2 x CH (α),114 - 153(萘),174.9(有限公司),185.8;185.9 (2 x CS)。这种分子被发现部分水解相应ring-opened thiocarbamoyl化合物。获得的所有变化,而不是分配给单个化合物。分析LC / MS、ESI正离子模式了m / z328.2 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z326.3(米H]^{- - - - - -}。分析LC / MS / MS (ESI +,碰撞能量35 V),产品离子m / z328.2 (rel. int。1%):m / z313.0 [M + H⁺229.0 - 15(加),100%],[M + H⁺- 99 (DNITC + H⁺),13%)。LC / MS / MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z326.1 (rel. int。2%)m / z267.3(米^{- - - - - -} H - 59岁的100%)。

2.8.6。合成3 - (4-dimethylamino-naphthalene-1-yl) 5-isopropyl-1-methyl-2-thioxo-imidazolidin-4-one (6DNTH-MeVal)

MeVal(93.0毫克,0.708更易)与1 M KOH(400碱性μ0.4 L,更易)和溶解在0.5 KHCO₃(3毫升)和二氧六环(2毫升)。这个解决方案是激烈的在磁力搅拌和4-dimethylnaphthylisothiocyanate(91.3毫克,DNITC 0.40更易)溶解在二氧六环(2毫升)补充道。是由薄层色谱监测反应(SiO₂;甲苯,甲苯/层,,v / v)没有MeVal使用引用。60分钟后,试剂DNITC被消耗,与甲苯/层,薄层色谱洗脱后形成的分析物可以通过其荧光可视化长波长在紫外灯下。甲苯的反应混合物提取和纯化柱层析法(SiO₂)筛选了甲苯/层(,v / v)产量130毫克(96%)所需的产品。这个产品从乙醇结晶/ H₂O ()产生白色晶体(100毫克,73%)具有以下特点:一下。157 - 159°C, Rf-TLC 0.72(层:甲醇,,v / v)、紫外线(ACN / H₂O,v / v)海里,000年21,¹H NMR (²H₆丙酮,25°C)δ1.04、1.16 (d + d, 3 + 3 h,7.1赫兹,分配给thiohydantoin), 1.24, 1.28 (d + d, 3 + 3 h,赫兹,CH₃ 分配给thiocarbamoyl], 2.59 [m, 1 h,,6.9,7.1赫兹,CH (β),2.92(年代,6 h, N (CH₃)₂3.41],[d、3 h,赫兹,N-CH₃)4.38,4.50 (d + d, 1 h,,3.3赫兹,CH (α)7 - 8,31 (m, 6 h, naphthalene-H)。¹³C NMR (²H₆丙酮,25°C)δ16.3、17.1;17.5、17.8 (2 x CH₃ ),30.3 (CH (β),33.0;33.1 [2 x N-CH₃),45.4 (N - (CH₃)₂),δ69.1;69.4 (2 x CH (α),114 - 153 (2 x萘),173.5(有限公司),184.3;184.4 (2 x CS)。这种分子被发现部分水解到相应ring-opened thiocarbamoyl化合物。获得的所有变化,而不是分配给单个化合物。分析质ESI,正离子模式m / z342.2 [M + H]⁺,ESI负离子模式了m / z340.2(米H]^{- - - - - -}。质/ MS的分析(ESI +,碰撞能量35 V),产品离子m / z342.2 (rel. int。2%):m / z327.1 [M + H⁺229.2 - 15(加),100%],[M + H⁺- 99 (DNITC + H⁺),66%)。的过渡m / z 在测量使用LOD质/女士APCI +(碰撞能量32 V)。质/ MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z340.2 (rel. int。17%):m / z325.2(米^{- - - - - -} H - 15(加),100%]。

2.9。质表征5-isopropyl-1-methyl-3-phenyl-2-thiohydantoin (PTH-MeVal7),5-isopropyl-3-pentafluorophenyl-2-thiohydantoin (PFPTH-MeVal,8)和1-hydroxyethyl-5-isopropyl-3-pentafluorophenyl-2-thiohydantoin (PFPTH-HOEtVal,9)

分析质ESI(正离子模式)m / z249.1 (M + H⁺)进行比较。7,m / z349.1,m / z339年薪酬。8,m / z369.1薪酬。9。质ESI负离子模式了m / z247 (^{- - - - - -} 对comp H)。7,m / z337.0(米^{- - - - - -} 对comp H)。8,m / z367.1(米^{- - - - - -} 对comp H)。9。比较分析。7质/女士(ESI +,碰撞能量35 V),产品离子m / z249.1 (rel. int。2.5%):m / z207.1 [M + H⁺176.1 - 42 (-IsPr-H), 100%], [M + H⁺ (-CSNMe + H)⁺55%),但是有的/女士(ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z247.1 (rel. int。0%):m / z232.1(米^{- - - - - -} H - 15(加),100%)。事务m / z在测量时使用249.1→207.2 LOD质/女士APCI + 33(碰撞能量V)。比较分析。8质/女士(APCI +碰撞能量40 V),产品离子m / z339.2 (rel. int。6%):m / z311.0 [mh⁺- 28(有限公司),100%),266.0 (mh⁺- 73 (-CSNMe), 95%]。质/ MS (APCI -,碰撞能量V)、产品离子m / z337.0 (rel. int。10%):m / z317.2(米^{- - - - - -} H - 20(高频),100%),289.1 [M^{- - - - - -} H - 48 (cs), 50%]。比较分析。9质/女士(ESI +)离子从没有产品m / z369.1。质/ MS (ESI -,碰撞能量V)、产品离子m / z367.1 (rel. int。1%):m / z347.1(米^{- - - - - -} H - 20(高频),和100%m / z287.2(米^{- - - - - -} H - 80, 5%)。质/ MS (APCI +碰撞能量28 V),产品离子m / z369.1 (rel. int。10%):m / z351.0(米H⁺- 18 (- h₂O), 70%), 223.1 [MH⁺- 46 (ch₂CH₂哦+ H), 100%)。质/ MS (APCI -,碰撞能量V)、产品离子m / z367.1 (rel. int。2%):m / z347.1(米^{- - - - - -} H - 20(高频),100%]。

3所示。结果

3.1。一般的实验装置

为了研究如果原始N-alkyl Edman-procedure可以更好的用于测量LC-based分析系统、荧光和异硫氰酸ionisable试剂进行了探讨。选择的试剂与N-methylvaline反应和缬氨酸甲基化模式和正常valyl终端在Hb,形成相应的甲基化和nonmethylated valyl thiohydantoin(化合物1- - - - - -6、表1)。这些化合物被净化,而至于LOD LC / MS / MS的phenylthiohydantoin methylvaline (PTH-MeVal,7),在一些实验中,与pentafluorophenylthiohydantoins methylvaline和2-hydroxyethylvaline (PFPTH-MeVal,8PFPTH-HOEtVal,9、职责)。复合7是由苯基异硫氰酸酯(PITC)和化合物8和9形成从pentafluorophenyl异硫氰酸酯(PFPITC);试剂都是利用在N-alkyl Edman-procedure(见表1)。

分析物的分析¹H NMR(化合物1- - - - - -6),¹³C NMR (1,2,5,6)、LC / MS / MS (1- - - - - -9),CE-DAD (1- - - - - -2),UV / vis光谱(1- - - - - -7)。化合物1- - - - - -2荧光光谱的特征。一般来说,所有这些测量和决心,pH值低于或高于pKa ionisable组的每个各自的分析物(1- - - - - -6)。

3.2。耦合和Cyclisation反应

薄层色谱鉴别的耦合反应(化合物1- - - - - -6)。概括地说,耦合/ cyclisation反应是在15分钟内完成FITC反应时,DABITC, DNITC N-methylvaline (2,4,6),而cyclisation反应nonmethylated缬氨酸分析物(1,3,5)发生额外的酸化后的第一步。这是按照传统埃德曼降解过程(17)和以前的研究(15,17]。耦合/ cyclisation反应也研究了使用模型肽,N-methylvalylleucylanilide, ValLeuSer derivatised FITC。结果是根据研究模型氨基酸;FTH-MeVal成立期间直接耦合反应(pH值的条件8)而FTH-Val成立一个额外的酸化后的第一步。所有反应很容易跟随在薄层色谱斑点是肉眼可见的。中间体和产品由FITC、DABITC DNITC也可以可视化的波长366 - 245纳米,分别。

3.3。核磁共振

¹H NMR是用于结构测定和研究分析物的纯度(1- - - - - -6)。它还可以建立分析物(1- - - - - -6)循环,thiohydantoin,构象,被分离的分配到质子转移甲基(dd)缬氨酸旋转的残渣。对于ring-open分析物,thiocarbamoyl构象,甲基只是稍微分开(出口的。18])。

3.4。LC分离的标准

完整基线分离的甲基化和nonmodified tiohydantoins(化合物1- - - - - -7和PTH-Val)实现了反相C18柱,使用渐变的水和乙腈酸化组织为0.1%。

3.5。ms分析、比较的相对响应(LOD)

研究分析物的质谱用于识别和测量它们的相对反应在选定的条件下优化灵敏度。测量LOD的LC / MS / MS进行为了比较之间的相对灵敏度分析物形成的五个异硫氰酸盐试剂,与MeVal反应。除了N-methylated分析物(2,4,6- - - - - -8)FTH-Val (1),还包括为了研究可能的差异LOD相应正常(未被取代的)缬氨酸的分析物FTH-MeVal相比。LOD研究是由LC / MS系统1后锥电压和碰撞能量的优化分析物在每个给定的条件。这个系统被证实的结果和进一步提高LC / MS / MS系统。2。在这项研究中所有仪器参数完全优化的普遍增加了敏感性的25倍,当,例如,比较FTH-MeVal的LOD的LC / MS系统1 LOD的LC / MS / MS系统2(获得值表中给出2和3)。一个例子的LC / MS / MS分离分析FTH-Val FTH-MeVal呈现在图4,显示的展开图质(TIC)标准的色谱图1和2和一个质/ MS谱m / z= 503 (FTH-MeVal)。

FTH-MeVal (2)给最高的反应在两个系统相比,所有其他n -分析物(4,6、7)在一个条件与一个轻微的例外(DABTH-MeVal、修改的条件、应急服务国际公司)(见表2和3)。使用LC / MS系统所没有的条件。1 LOD最低的是2.6 nM FTH-MeVal在最优条件下和0.5纳米测量时的分类法2 (ESI -离子、氨)。

LOD FTH-Val和FTH-MeVal之间的差异测量N-methylated为了看到区别分析物(2正常缬氨酸)和分析物(1)(见表2)。这种差异是相对较小,例如,比五异硫氰酸盐试剂之间的更大差异测试,进一步研究正常缬氨酸分析物被排除在外。

最初的钟表FTH-Val测量和比较,FTH-MeVal, DABTH-MeVal DNTH-MeVal, PTH-MeVal (1,2,4,6,7)。从这些研究结果给出了表2和3。当很明显,PTH-MeVal (7)给更低的相对响应由LC / MS (ESI积极和消极离子模式)比其他化合物(1,2,4,6),两个额外的分析物,PFPTH-MeVal (8)和PFPTH-HOEtVal (9),也包括在这项研究中几个比较测量。化合物的结果8和9给出了一个更低的相对响应比PTH-MeVal (7);也就是说,PFPTH-MeVal (8显示77000 nM的LOD测量时应急服务国际公司(负离子,无缓冲的溶剂系统)。测量正离子的企图失败产品离子m / z311年和m / z266身体太虚弱,不能被测量。然而,复合8可以测量与大气压化学电离(APCI)电离时,给82600海里的LOD(0.1%组织,H₂O / ACN,v / v,负离子测量),只是相比,复合低十倍以上9(LOD = 950000海里)在这个特定的条件。当比较之间的相对敏感性化合物1,2,4,6(见表2与化合物)7- - - - - -9在同等条件下,相对差异非常大,也就是说,LOD复合低2200倍2与7LOD低18000倍2相比9低,210000倍LOD2相比8。PFPTH-HOEtVal (9)还与APCI测量与NH(缓冲₄OAc,负离子测量),给出了LOD的4400海里可以比作790海里的LOD化合物2在这种情况下。

3.6。荧光

的荧光性质FTH-Val (1)和FTH-MeVal (2)被记录激发和发射光谱测量。测量的二阶阴离子1和2(图3),得到pH值5以上,也就是说,在pH值7和9日给了最大激发波长为492 nm和最大发射在515海里几乎相同的光谱1和2;参见图2在pH记录7。这意味着加合物,FTH-MeVal甲基,不会影响光谱性质。相对荧光强度的二阶阴离子1和2相比高出360倍左右荧蒽的引用。

3.7。毛细管电泳(CE)

FTH-MeVal分离从数组使用毛细管electrophoresis-diode FTH-Val检测(CE-DAD)系统评估,以评估确定n端加合物的可能性使用LC之外分离技术以及能够使用和受益于毛细管electrophoresis-laser-induced荧光检测等敏感技术(CE-LIF)。这种分离进行了使用17毫米磷酸盐缓冲剂(pH值调整到7)包含20毫米SDS。一个完整的得到基线分离;FTH-Val筛选了7.44分钟后FTH MeVal 8.91分钟后,两个与狭窄的定义良好的峰值(见图5)。

4所示。讨论

4.1。

介绍了自N-alkyl Edman-procedure 25年前(19]只小修改的最初过程介绍了。最初,由供应者是利用埃德曼试剂。有些后来PFPITC介绍,使更高的灵敏度在测量的GC / MS分析物的负离子化学电离(德国礼褀公司)模式(20.]。的N-alkyl Edman-procedure使用由供应者或PFPITC最近被改编为了执行分析LC / MS / MS (10- - - - - -14]。然而,迄今为止,这些修改不包括研究不同埃德曼试剂LC / MS分析的优化方法。GC / MS LC / MS的变化有重要意义对有关分离原则和方法分析物的离子化。

采用异硫氰酸盐试剂包含ionisable组(即。,FITC,DABITC,DNITC)was demonstrated to be a valuable approach which gave several improvements, for example, increased solubility in blood at biological pH (regards FITC), and enhanced sensitivity when measuring by LC/MS/MS as compared to the PITC and PFPITC reagents (regards all three reagents). The ionic group and fluorescent properties of the analyte also provides new alternatives such as CE separation and spectroscopic detection, for example, with sensitive fluorescence detection. Ireland et al. showed, for example, that they could measure FTH-amino acids with a limit of detection on a low zeptomol (10^-21年)水平/注射用CE分离与激光诱导荧光检测(21]。

虽然与其他分析方法检测时可能利用试剂如FITC, MS / MS程序通常首选由于灵敏度高、选择性、和准确性。这个基本工作是为了完成开发一个LC / MS / MS程序能够提供高灵敏度、吞吐量和方法限制较少关于加合物可测量的类型。

4.2。耦合和分离的反应

这个过程成功的一个关键问题是,如果耦合反应以及分离反应(分析物的形成已经在偶联反应)会受到比使用笨重的试剂的引入。当使用FITC,最大埃德曼试剂测试,这是显示(例如,在TLC) n -缬氨酸或n - Val-Leu-anilides反应容易形成FTH-MeVal条件耦合(pH)。DABITC形成DABTH-MeVal得到相同的结果,和DNITC DNTH-MeVal形成。当thiocarbamoylating正常缬氨酸或用FITC ValLeuSer, DABITC DNITC没有rinclosure按预期发生。将这些产品转化为thiohydantoin分析物的酸化一步要求,与早期的研究一致由供应者和PFPITC [15,17]。

FITC的奖金,DABITC, DNITC是分析物形成的。所有步骤可以很容易被肉眼实时跟随,这是有益的在整个开发工作的过程以及制备合成标准。

4.3。LC-Separation前分析

所有对分析物,FTH-Val FTH-MeVal,3,4,5和6可以很容易地分离完整基线分离通过水/乙腈梯度标准的反相高效液相色谱柱。当pH值使用volatile修饰符如组织0.1%,溶剂系统兼容LC / MS / MS。

4.4。LC / MS / MS分析

为了研究和比较的相对灵敏度分析物(化合物1,2,4,6,7)在选定的条件下,正面和负面的离子被ESI测量,在酸性、中性和碱性pH值H₂O: ACN ((v / v)]。这种实验设置了pH值上方和下方分析物形成的FITC、DABITC DNITC。当时惊讶地发现,相对灵敏度最高的FTH分析物(1和2)所有的测试条件下,只有一个例外(DABTH-MeVal,没有缓冲,ESI +)(比较表2和3)。这么高的相对响应得到FTH分析物1和2解释是青睐的容易ionisable团体(如酚组)的荧光素的身体,既可以形成正面和负面的离子。另一个因素,这也提高了信噪比,是FTH-analytes分子量最高,这是有益的化学背景噪音随更高m / z。研究分析物的相对灵敏度是最低(LOD);FTH-MeVal ~ FTH-Val > DABTH-MeVal > DNTH-MeVal > PTH-MeVal > PFPTH-HOEtVal (9)> PFPTH-MeVal (8)。有趣的钟表9是一个因素10低于8必须分配给羟基吗9具有较高的离子亲和力和更容易被电离,给予较低的LOD。这个结果表明一个特定的分析物的相对灵敏度变化更当由供应者或PFPITC用作derivatisation试剂相比,例如,FITC。由供应者/ PFPITC试剂加合物的离子亲和力将决定离子亲和力与异硫氰酸ionisable试剂更容易被电离。试剂如FITC因此会给少获得相对灵敏度差只要异硫氰酸离子加合物的亲和力是低于身体(调查)。

尤其是FITC试剂的灵敏度得到应该足够背景加合物水平的测量,例如,30 pmol / g球蛋白,常见的环氧乙烷。从一个示例包含50毫克球蛋白会有1.5 pmol环氧乙烷加合物。如果这是定量分离、纯化和浓缩到100一卷μL我们将有一个最终的浓度在定量限15海里大约10倍。自然会有损失分析链和低敏感性与实际样品由于,例如,离子抑制,但仍将有良好的边缘测量低背景加合物的水平。这个边际也将足够使用组织作为pH值修改器分离后提供更好的记忆力和尖锐的峰值在C₁₈LC列作为分析物然后是中性的,更亲脂性的。研究真实的样品正在和将很快出版。

这项研究是在两个不同的MS / MS系统进行验证,而激烈的之间的敏感性差异埃德曼试剂在使用系统排名第一。比较获得的相对灵敏度(钟表)研究分析物了,而恒定的比率在2给钟表25倍低于系统1(比较表3与表2)。预期,系统2在mrm三重四重仪器操作模式应该给钟表低于LCQ iontrap仪器(系统1)。这两个系统之间的相对差别实际上可以在更高的系统1是用于直接分析物的注射,给予任何稀释,而系统2与一个小一个LC列使用身份证。操作在50毫米)μL / min,明确稀释分析物相比直接注射。然而,优化系统2努力最大化的敏感性。更现代和精密仪器我们将期待更低的钟表,我们也期望之间的相对差异分析物将常数根据这项研究。最后,三重四重工具,如系统2在MRM模式运营模式选择的仪器选择性和灵敏度的定量测量。

4.5。毛细管电泳和荧光

爱尔兰et al。21)表明,氨基酸在蛋白质测序和FITC埃德曼试剂和测量通过CE-LIF杰出的敏感性。为了测试原理是相同的加合物测量无需访问CE-LIF系统我们使用CE-DAD研究分离FTH-Val FTH-MeVal和单独测量的荧光性质。本研究的结论和爱尔兰FTH-amino酸是CE-LIF应该足够高的敏感性低加合物水平测量。CE和荧光测量的一个可能的缺点是总是在巨大的过剩形成副产品在分析实际样品。尽管CE分离能力高,副产品可能干扰常见的加合物含量低(pmol / g球蛋白水平),对应于每1 - 10一加合物百万正常缬氨酸(22]。然而,当测量加合物的水平发生在更高层次如醛、CE分离与某种荧光测量可能是一个有价值的选择质/ MS分析。例证,Kautiainen et al。23]记录更高水平的1000倍2-hydroxyethylvaline(第13 - nmol / g球蛋白)降低球蛋白样本(可能来源是减少席夫碱从乙醛)之间的水平相比16-23 pmol / g球蛋白未还原的样品(直接从环氧乙烷加合物形成)。最后,结合强大的分离技术(持续改善),用荧光测量和MS / MS分析未来工作可能是一个有趣的替代。如图所示在这项研究中,光谱特性没有加合物的影响。因此荧光性质可以用来量化和MS / MS的结构描述。这种技术的结合将是强大的今天未知的加合物进行分析。

5。结论

本研究证明了N-alkyl Edman-procedure可成功改编对信用证条件通过交换ionisable试剂如FITC的异硫氰酸盐试剂,DABITC或DNITC。FITC优越与其他试剂进行测试。FITC作为试剂的使用开辟了新的可能性的血红蛋白加合物的分析。目前的研究提供了一个加合物FI的发展的基础RE程序(24)促进Hb加合物测量在实验和流行病学研究中的应用。

确认

副教授Ulrika尼尔森,分析化学,Siv Osterman-Golkar的遗传学、微生物学和毒理学和诞生Tornqvist,环境化学部门,感激地承认对他们的支持和有价值的观点。这项研究是由癌症和过敏基金会(CAF)和欧盟一体化项目NewGeneris第六框架计划,优先级5:食品质量与安全(合同编号。食品- ct - 2005 - 016320)。NewGeneris是项目的缩写“新生儿和基因毒性暴露风险,”http://www.newgeneris.org。

引用

1. k·d·l·ehrenber Hiesche,奥斯特曼专业集团党,和i Wennberg”评价的遗传风险的烷化剂:组织剂量与环氧乙烷鼠标从空气污染,”突变的研究,24卷,不。2、83 - 103年,1974页。视图:谷歌学术搜索
2. 奥斯特曼专业集团党,l . Ehrenberg d . Segerback i·海尔萨姆,烷基化的遗传风险评估代理。二世。血红蛋白是一个剂量监测。”突变的研究,34卷,不。1、1 - 10,1976页。视图:谷歌学术搜索
3. p . l .队长和s . r .坦南鲍姆,双重“蛋白加合物分子剂量测定法的化学致癌物质,”致癌作用,11卷,不。4、507 - 518年,1990页。视图:谷歌学术搜索
4. m . Tornqvist j .毛尔s . Jensen和l . Ehrenberg”监测环境癌症发起者通过修改血红蛋白加合物埃德曼降解方法,”分析生物化学,卷154,不。1,第266 - 255页,1986。视图:谷歌学术搜索
5. p . b .农民,e·贝利,s m . Gorf et al .,“监测人体接触环氧乙烷的使用气相色谱分析-质谱法测定血红蛋白加合物,”致癌作用,7卷,不。4、637 - 640年,1986页。视图:谷歌学术搜索
6. m . Tornqvist a . Kautiainen r . n .积累性和l . Ehrenberg”血红蛋白加合物在动物暴露于汽油和柴油尾气。我:烯烃。”应用毒理学杂志,8卷,不。3、159 - 170年,1988页。视图:谷歌学术搜索
7. e . Bergmark c . j . Calleman和l·g·科斯塔”环氧丙烯酰胺的血红蛋白加合物的形成及其代谢物glycidamide老鼠,”毒理学和药理学应用,卷111,不。2、352 - 363年,1991页。视图:谷歌学术搜索
8. e . Tareke·里德伯Karlsson p, s .埃里克森和m . Tornqvist“丙烯酰胺:烹饪致癌物?”化学毒物学研究,13卷,不。6,517 - 522年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. b . Paulsson i Athanassiadis、p·里德伯和m . Tornqvist”从glycidamide血红蛋白加合物:acetonization亲水性基团的可再生的气相色谱/串联质谱分析,“质谱快速通信,17卷,不。16,1859 - 1865年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. t·r·芬内尔,s . c·j·萨姆纳·r·w·斯奈德et al .,“新陈代谢和血红蛋白加合物的形成丙烯酰胺对人类,”毒物学的科学,卷85,不。1,第459 - 447页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. s . Chevolleau c·雅克·c . Canlet j . Tulliez和l . Debrauwer”分析血红蛋白加合物的丙烯酰胺和glycidamide液体chromatography-electrospray电离串联质谱,作为法国人口暴露生物标志物,”杂志的色谱,卷1167,不。2、125 - 134年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. m . Ospina h .黄昏,t·迈耶斯et al .,“液体chromatography-tandem质谱方法分析丙烯酰胺暴露的生物标志物,”化学和食品中丙烯酰胺的安全m·弗里德曼和d . Mottram Eds。卷,85智慧生态和环境事务施普林格,页187 - 194年,纽约,纽约,美国,2005年。视图:谷歌学术搜索
13. t·r·芬内尔,j . p . MacNeela r·w·莫里斯·m·沃森,c·l·汤普森和d·a·贝尔”血红蛋白加合物从丙烯腈和环氧乙烷在吸烟者:谷胱甘肽的影响s-transferase T1-null M1-null基因型,”癌症流行病学生物标记和预防9卷,第712 - 705页,2000年。视图:谷歌学术搜索
14. h·w·薄暮,m . Ospina t·迈耶斯et al .,“自动测量方法球蛋白加合物丙烯酰胺和glycidamide埃德曼反应条件进行了优化,“质谱快速通信,20卷,不。6,959 - 964年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. h·w·薄暮,j . t . Bernert m . Ospina et al .,“评估吸烟和生物标志物的生物标志物的关系接触丙烯酰胺对人体,”癌症流行病学生物标记和预防,16卷,不。11日,第2478 - 2471页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. p•里德伯lun, c . a . Wachtmeister和m . Tornqvist”合成和表征n -缬氨酸和苯,pentafluorophenyl-thiohydantoins”Acta Chemica Scandinavica47卷,第817 - 813页,1993年。视图:谷歌学术搜索
17. p•埃德曼“逐步退化肽通过phenylthiohydantoins”Acta Chemica Scandinavica7卷,第701 - 700页,1953年。视图:谷歌学术搜索
18. p•里德伯lun, c . a . Wachtmeister l·埃里克森和m . Tornqvist”的适用性修改埃德曼程序测量蛋白加合物:phenylthiohydantoins形成和退化的机制,”化学毒物学研究15卷,第581 - 570页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 詹森,m . Tornqvist, l . Ehrenberg”血红蛋白作为烷基化剂的剂量监测:氨基端缬氨酸的测定烷基化产品,”在人类个体易感性基因特工f . j . de serre和r·w·佩罗。,pp. 315–320, Plenum Press, New York, NY, USA, 1984.视图:谷歌学术搜索
20. m . Tornqvist监控和癌症风险评估的致癌物质,特别是城市空气的烯烃、博士学位论文、放射生物学、斯德哥尔摩大学,斯德哥尔摩,瑞典,1989年。
21. 拿身份证爱尔兰,d·f·刘易斯,李x f . et al .,“双耦合埃德曼化学高灵敏度自动蛋白质测序,”蛋白质化学杂志,16卷,不。5,491 - 493年,1997页。视图:谷歌学术搜索
22. m . Tornqvist c . Fred j . Haglund h . Helleberg b . Paulsson p·里德伯,“蛋白加合物:定量和定性方面的形成、分析和应用,“色谱法B杂志,卷778,不。1 - 2、279 - 308年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. a . Kautiainen m . Tornqvist k·斯文森,s . Osterman-Golkar“加合物Mmalonaldehyde和其他一些醛血红蛋白,”Carcenogenisis,10卷,不。11日,第2130 - 2123页,1989年。视图:谷歌学术搜索
24. p•里德伯”方法分析氨基蛋白加合物用异硫氰酸盐试剂,”专利,老板加合物分析AB,瑞典。我们/ 2005/101020;加合物分析AB也是商标加合物FI的所有者RE${\text{过程}}^{\text{TM}}$。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2009里德伯等。这是一个开放分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。