利用形态学和分子工具鉴定芒果和Soursop果实的真菌病原，并利用木瓜和Soursop叶子和种子提取物进行防治

摘要

果蔬制品在采后处理过程中容易受到真菌的侵袭。化学杀菌剂是控制真菌病害最常用的技术。然而，一种替代产品是使用植物提取物，这在体外和在活的有机体内状况。本调查的目的是使用形态学和分子工具鉴定芒果和肉豆蔻果实的主要病原体之一，以及评估体外番木瓜和糖浆叶和种子提取物的抑制作用。分离出两种病原体，通过芒果和酸汁果实的形态学和分子特征鉴定。我们使用以35kHz和160W的频率将极性（己烷，丙酮，乙醇，甲醇和水）的五种溶剂以35 kHz和160W的频率增加了胃肠和木瓜的叶片和木瓜的种子提取物。体外采用柯比-鲍尔技术对提取物进行评价。采用标准的比色法和分光光度法对抑制率最高的提取物进行了定性和定量分析。此外，还测定了总酚类、黄酮类、生物碱类、萜类、蒽醌类、香豆素类和皂苷类的含量。因此，我们将病原体鉴定为炭疽菌fructicola和丛赤壳属haematococca．含水萃取物（水作为溶剂）显示出与其他提取物相比抑制两种病原体的更高百分比。此外，木瓜叶的水性提取物是所有提取物中最有效的。水性木瓜叶提取物表现出抑制的49.86％的百分比为C. Fructicola.47.89％n haematococca．木瓜叶和种子（AqEPL和AqEPS）的水性提取物呈现（除蒽醌和香豆素）代谢物的最大量。的aqueous soursop leaf extract (AqESL) presented the greatest amount of phenols, tannins, and flavonoids (219.14 ± 8.52 mg GAE/L, 159.84 ± 10 mg GAE/g dm and 0.13 ± 1.12 × 10⁻⁴， 分别）。的aqueous soursop seed extract (AqESS) had the highest saponin content with 1.2 ± 0.1 mg QSES/g dm and the papaya leaf accusative extract (AqEPL) had the highest alkaloid content (6.413 ± 1 × 10⁻³ mg AE/g dm) compared with the other extracts. The AqESS had a lower content of secondary metabolites (sterols, alkaloids, and saponins), while AqESL showed no presence of alkaloids and coumarins.

1.介绍

水果和蔬菜的采后损失可高达50%，真菌引起的疾病占总损失的70% [1，2］．果实（特别是热带地区）易受在比萨满储存期间致病性真菌的攻击影响，例如物种刺盘孢属，镰刀，葡萄孢属，根霉，青霉菌,和Phytophthora.［3.，4］．几种真菌已被鉴定为感染索普(番荔枝属muricata水果，例如曲霉菌曲藤，Aspergillus尼日尔，Botryodiplodia theobromae，刺盘孢属sp。，腐皮镰孢霉菌，毛霉菌sp。，青霉钙骨屈氢，青霉菌sp。根霉stolonifer,其他[5］．另一方面，刺盘孢属、炭疽（炭疽病疾病），主产(黑斑病)，以及Lasiodiplodia theobromae.(茎腐病)是芒果果实采后最常见的致病菌，导致果实品质低下，造成严重的经济损失[6］．

真菌病通常用化学杀菌剂来防治。这些产品处理不当，已造成环境污染，并产生抗药性[7这导致了替代产品的出现，如使用植物提取物。这些天然产物是根据感兴趣的溶质的极性使用不同的溶剂获得的[8］．

植物提取物含有大量具有生物活性的生物活性化合物，该生物活性分为三大类：萜烯和三萜类（约25,000种），生物碱（约12,000种）和酚类化合物（约8,000种），由四条路线合成：ShikimiC酸途径，丙酸盐途径，甲瓦醛酸途径和非测量途径（MEP）[1，9］．Sathya等人[10[报道，黄酮类化合物，生物碱，类固醇，三萜，皂苷，酚类化合物和其他次级代谢物存在于植物的不同部分：叶，茎，根，花序，花，水果和种子。

植物提取物的使用已被广泛报道体外和在活的有机体内用于果蔬制品采后处理过程中真菌的防治。Kator等人[11]测试在活的有机体内(番茄果实)辣木叶的水提取物答:flavus，青霉菌waksmanii，b . theobromae，Fusarium oxysporum， 和炭疽病asianum．这些研究人员报告说，辣木叶的水提取物具有抗真菌的潜力，可以延长保质期，并在贮藏期间保持番茄果实的质量。Ochoa等人[12)执行体外酸橙叶甲醇提取物(Shinus molle是的), chirimo雅（番荔枝cherimola), tabaquillo (粉蓝烟草）和肉桂皮（Cinnamomum Zeylanicum关于菌丝体生长和孢子病圃，Fusarium Culmorum.， 和F. Solani.，报道了肉桂和吉莫提取物对真菌菌丝抑制和产孢的影响病圃，F. Culmorum.， 和F. Solani.．同样，Butia等人[13]评估体外和在活的有机体内42种植物提取物的抗真菌活性来自叶子，芽，根茎，鳞茎，种子和水果的不同溶剂对香蕉的炭疽病（Collettrichum Musae.）.作者的结论是根茎的甲醇提取物生姜可以用作对Postharvest Banana炭疽病的控制的有效替代方案。Bautista-baños等。［14]评估体外和在活的有机体内叶、茎水提物的抑菌活性Achras sapota，Annona Reticulata.，Bromelia hemiSphaerica.，番木瓜，柠檬，Chrysophylum Cainito.，Dyospiros ebenaster，Mangifera籼，佩戴尔亚洲人，Pouteria sapota，Spondias紫竹， 和Tamarindus indecus从莫雷洛斯州，墨西哥反对c、在芒果和番木瓜果实在采后处理。作者报道了含水叶片提取物C. Limon.和p .美国完全抑制体外的发展c、．的在活的有机体内结果表明，叶和茎提取物D. ebenaster对芒果果实有杀菌作用，c .木瓜完全抑制木瓜果实的腐烂。

Akhila和Vijayalakshmi [15使用液相色谱 - 质谱（LC-MS）技术进行番木瓜水提取物的植物化学分布，鉴定21种化合物：生育酚，抗坏血酸，鲤鱼，脱氧糖，脱氧核蛋白，槲皮素，Dicoumarol，香豆素喹啉，香豆素，叶酸，胱氨酸，同型半胱氨酸，半胱氨酸硫氧化物，L-谷氨酸，p-coumaroyl醇，二甲氧基苯酚，脐纤维，发光物，苯丙氨酸，咖啡酰醇和甲基壬基酮。在番木瓜叶中的另一个更重要的组成部分是乳胶，其似乎负责由于几丁烷酶含量而导致的抗真菌​​作用，这表明了根据生物化学测定的高抗真菌活性[16］．

提取液和生物活性化合物通常是通过传统的方法获得的，如浸渍、水蒸馏法、压榨法、煎煮法、浸渍法、渗透法和索氏提取法。然而，这些方法耗时长，能量供应高，需要大量溶剂，导致产率低[17］．因此，考虑到产量和经济和环境条件，采用了更有效的提取技术。考虑到这一点，已经使用了安全无毒的植物萃取溶剂，如水、二氧化碳和乙醇[9，17］．

水是不同分离过程中最安全，最环保的溶剂[18］．在现代和可持续的技术中，超声波辅助提取(UAE)是一种绿色技术，可以有效地提取生物活性化合物[19，20.］．

UAE在短时间内进行，这有利于热敏化合物的恢复[19］．UAE工艺能够打破细胞膜和细胞壁，允许更大的溶剂渗透到基质中，结合搅拌和/或热降低溶剂消耗[20.，21］．

阿联酋的效率是由空化作用产生的，空化作用是由气泡的产生、增长和内爆引起的，当高压和温度发生时，气泡会坍塌，导致材料中的微裂缝。此外，频率、时间和酸度通常也会影响化合物的回收[22］．在此基础上，本研究的目的是利用形态学和分子手段鉴定芒果和酸草果的主要病原菌之一，并对其进行评价体外番木瓜和糖浆叶和种子提取物的抑制作用。

2。材料和方法

2．1．植物材料

番木瓜生理成熟果实和幼叶。马拉多犬在Nayarit San Blas的Ejido La Libertad(21°32′23″N, 105°17′8″W;220 mamsl)。另一方面，在21°14′n, 104°54′w;301 mamsl)。植物材料被运到纳亚里特自治大学粮食技术股的实验室。水果和叶子用蒸馏水清洗，以去除任何可能发现的外来物质的痕迹。

2.2。病原体

2.2.1。病原体的分离

病原菌在生理成熟时从酸草果和芒果果实中分离出来，没有明显的机械损伤或病害迹象。将水果清洗、消毒，28℃，HR≥90%孵育。一旦果实出现病征，取部分坏死的表皮组织和未受影响的组织，用1%次氯酸钠溶液处理3分钟，用无菌蒸馏水清洗，然后用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)放在培养皿中心。在培养皿中培养7天，每天观察颜色、质地和菌落形成[23］．进行频繁reisolations保持菌株的纯度。的pure isolates were grown in PDA, incubated at 28 ± 2°C for six days, and then stored at 4°C until further use. Eight days before the start of the bioassay, these isolates were grown in fresh PDA.

2.2.2。形态学鉴定

形态学鉴定是通过使用二分键进行的[24］．用载玻片上的PDA培养基进行5 ~ 10个微培养，28±2℃(RH >95%)孵育6天，然后用Motic模型BA310显微镜(Motic, British Columbia, Canada) 40倍观察，记录病原菌结构。

2.2.3。分子鉴定

(1)基因组DNA提取，PCR扩增，和测序．将纯化的菌丝菌丝体置于20ml肉汤 - 马铃薯 - 右旋糖介质中。在室温下在150rpm下在150rpm下孵育病原体在150rpm的机械振荡器（轨道振动器OS-200）上孵育。使用allers和lichten报告的技术从菌丝中提取基因组DNA [25］．

磁珠和700μ.将L的CTAB提取缓冲液加入菌丝体中，在55℃下在AccuNCOOM（Labnet®，USA）中孵育1小时，然后在涡旋中搅拌10分钟。随后，700 μ.加入L氯仿 - 辛醇（24：1V / v），搅拌30秒，并使用迷你旋转离心机（Eppendorf®，德国）以16,000×g离心10分钟。将CTAB缓冲液加入1：10与上清液中的比例加入30秒，然后加入等体积的氯仿 - 辛醇溶液。接下来，加入等体积的冷异丙醇（浓缩丙醇（±20℃）并在4℃下以16,000×g离心15分钟。除去上清液，用750洗涤沉淀物 μ.75%乙醇L，倒置混合，16000 × g离心3 min。最后，DNA用50重悬μ.无菌的Mili-Q水。用分光光度计(Biotek®，美国)测定DNA浓度，吸光度比为A260/A280 nm和A260/A230 nm。

进行分子检测以鉴定病原体。利用引物ITS1 (5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ')和ITS4 (5 ' -CCTCCGCTTATTGATATGC-3 ')对rDNA ITS-5.8S区进行PCR扩增[26，27］．PCR进行t - 100 thermocycler(美国加州Bio-Rad)在下列条件:初始变性在5分钟94°C,紧随其后的是35周期在94°C的变性40年代,退火50°C 1分钟,1分钟72°C,最终扩展为72°C 10分钟。扩增产物在80 V下用1%琼脂糖凝胶电泳分离1小时。凝胶在透射台式UV中可见，使用PhotoDoc-it系统捕捉图像(Laboratory Equipment, California, USA)。PCR产物由Macrogen Humanizing Genomics(首尔，韩国)测序。利用BLAST工具将核苷酸序列与NCBI(国家生物技术信息中心)数据库进行比较。然后，利用MEGA 7.0软件构建系统发生树，采用Neighbor-Joining方法，Bootstrap分析1000个重复。

2.3。来自Soursop和芒果的植物提取物

植物材料(种子和叶子)在−80℃下储存在Thermo Scientific冷冻库，型号为ULT 1.3-86-3-A41, LLC(美国)，然后在LABCONCO Free zone 2.5(堪萨斯城，美国)中，在−45℃/0.020 mBar下冷冻干燥24和40 h，叶片和种子。之后，用克虏伯GX4100型(德国)的钢叶片将植物材料碾碎。生成的粉末保存在−20°C，直到进一步使用。将正己烷、丙酮、乙醇、甲醇、水各增极性溶剂100 mL与20 g植物原料(索索、木瓜叶、种子)混合得到提取物。随后，混合物在Luzerner®型号CD-4820超声波浴中以35 kHz和160 W超声14分钟。超声采样后，上清液在真空(20托)下使用Whatman No. 1纸过滤。然后，在温度≤35℃，110 rpm, 20 Torr真空条件下，将溶剂放入旋转蒸发器(IKA RV 10)中去除[26］．

将提取物沉积在琥珀色瓶中，并在低于35℃的温度下沉积在琥珀色瓶中，以蒸发72小时，以蒸发溶剂残留物，然后储存在-20℃直至进一步使用。在Hermle®离心机型Z326K（Wehingen，Germany）中，在-4℃下以9000rpm离心番木瓜和酸叶和种子的水提取物15分钟，然后通过Whatman滤纸。1和5。将含水提取物储存在-80℃，然后在Labconco自由区中冻干，在-45℃/ 0.420°Mbar。用于鉴定植物提取物的命名法如下。

第一个字母是指提取溶剂(H =己烷=丙酮,E =乙醇,M =甲醇和Aq =水),第二个字母意味着是一种提取(E),第三个字母表示源的提取得到(P =木瓜和S =刺果番荔枝),最后一个字母表示提取提取物的植物部位(L =叶片，S =种子)。据此，以正己烷为溶剂从木瓜叶中提取的提取物命名为HEPL。

2.4。在体外测试

我们执行一个体外试验评价20种提取物对病原菌的抑菌作用。实验在改良的Kirby-Bauer琼脂上进行。28］．将0.3g提取物重新悬浮在1ml DMSO（二甲基硫氧化物）ACS Fermont [29]并在涡旋中搅拌1分钟。我们在具有PDA的90毫米聚苯乙烯培养皿中进行了四个直径为6毫米直径的井（培养皿中央，剩余的三个孔在板上等距地位于板上）。在中央井中，放置了6毫米的病原体菌丝体，并在井的其余部分，100 μ.在DMSO中分别放置粗提物和溶解提物的L。阳性对照采用厂家推荐的浓度(625 g·100·l)⁻¹对于梨）具有以下活性成分的商业杀菌剂：硫酸链霉素，盐酸盐酸盐和氯化铜，DMSO对照（试剂级）和阴性对照（无提取物和无杀菌剂）。

播种48 h后8 d，测定病原菌菌丝生长情况。每24小时测量一次，处理在28±2°C孵育。在植物提取物周围形成的清晰区域被认为是提取物抗真菌活性的指示。由Ozgonen和Gulcu提出的配方得到提取物对菌丝的抑制率[30.]： 在哪里我=抑制百分比，GR1 =控制径向菌丝生长，GR2 =处理径向菌丝生长。

同样，对于病原体在最初、中间和最后阶段的菌丝生长的报告，基本的数学公式(式(2)表示不规则图形，以毫米表示²： 在哪里D = diameter of mycelial growth of the pathogen.

在提取物上对病原​​体抑制抑制的提取物进行定性和定量的植物化学分析。

2．5．次生代谢物的定性化学分析

将0.3g冻干植物材料（木瓜和酸叶和种子的水性提取物）在1ml去离子水（储备）中稀释。折算为300μ.以木瓜、酸参叶、籽等提取物为原料。使用Sofowara进行酚类、单宁类和黄酮类(三氯化铁)、生物碱(Mayer试剂)、类固醇(lieberman - burchard试剂)、皂苷类(泡沫生产)、蒽醌类和香豆素的标准化检测[31]，HARBORNE [32，埃文斯[33)方法。为了描述试验，杂交系统被用来确定叶片和种子中次生代谢物的存在或不存在。这些分析有三个重复。

2.6。二次代谢产物的定量化学分析

将0.1 g冻干的植物材料(木瓜和soursop叶子和种子的水提取物)溶解在2ml蒸馏水(原液)中。次级代谢物(总酚、非单宁酚、类黄酮、总皂苷和生物碱)的定量采用标准化分光光度技术，使用ThermoFisher Scientific™Multiskan™GO模型1510微板reader (Ov, Vantaa Finland)。这些分析有三个重复。

2.6.1。总酚类化合物

总酚的定量采用Maksimović等人提出的方法[34使用福林-乔卡图试剂。测量最终溶液在725 nm处的吸光度。没食子酸用于校准曲线(Sigma-Aldrich，中国)。结果以mg GAE·g表达⁻¹dm。

2.6.2。总单宁

含量根据Maksimović等描述的Folin-Ciocalteu方法测定[34］．为了完成这个实验，我们测量了最终溶液在725 nm处的吸光度。用没食子酸(Sigma-Aldrich，中国)进行校准曲线。结果以mg GAE·g表达⁻¹dm。总单宁含量计算如下:

2.6.3。类黄酮

提出Maksimović等人的方法。［34]反应的基础是三氯化铝(AlCl_3.）使用存在于碱性介质中的黄酮类化合物。吸光度在430nm处记录。黄酮类化合物表达为常规当量，其标准常规溶液的校准曲线表示为Mg Re·G.⁻¹dm。

2.6.4。总皂甙

通过Hernández等人提出的方法进行分析。［35使用DNS测试(3.5二硝基水杨酸)。将样品水解后置于水浴中，待温度达到60-70℃。然后，加入3 mL HCl，在此条件下保存15分钟。我们用冰浴停止反应，然后把pH调到6.5-7.2。接下来,是调整一卷10毫升蒸馏水(示例)。同样的步骤是重复而不添加盐酸从样本(样本B)。a和B, 0.5毫升的整除拍摄和0.5毫升的DNS被添加到每一个,然后受到在100°C水浴5分钟。用冷水浴停止反应，同时加入5 mL蒸馏水。样品放置至室温。折算为300μ.取每个样品的L等分，用Miller(1959)提出的DNS法测定吸光度和糖含量[35］．在540 nm处读取吸光度，结果以mg QSES·g表示⁻¹dm。使用Quillaja saponaria．

2.6.5。生物碱

通过Shamsa等人提出的方法进行总生物碱测定。［36]，基于生物碱的反应与溴甲酚绿（BCG），在最大吸收470nm时读数。将提取物溶于2N HCl（1：1V / V）中，然后用氯仿进行三次洗涤，并将样品调节至中立。接下来，加入5ml BCG和5mL具有pH为4.7的磷酸盐缓冲液。搅拌混合物，将生物碱配合物用1,2,3和4mL氯仿萃取。回收黄色复合物，加入氯仿直至最终体积为10mL。等分试样200 μ.取L值，然后测定吸光度。结果以mg AE·g表示⁻¹用标准阿托品溶液进行标定曲线。

2.7。统计分析

的体外试验采用完全随机设计，4 × 5 × 2析因设计，包括对照组(含杀菌剂、不含杀菌剂、不含提取物和DMSO试剂)。采用Tukey检验对所得数据进行方差分析(ANOVA)α.= 0.05。使用SAS统计软件包9.2版本进行分析。

3。结果与讨论

3．1.病原真菌的鉴定

3.1.1。形态学鉴定

(1)刺盘孢属fructicola．病原体呈现出圆形形状，同心环，丰富的棉花质地，在宏观水平上同心浮雕。在培养的鸟瞰图中，在中心的浮雕和周边的白色音调中观察到白灰色音调。在培养皿的背面，有人看来，菌落在中心的乳脂状白色有乳脂状白色，周边上有一个同心的灰色和白色环。这种孤立表现出快速增长，涵盖八天内的培养皿（图1(一)和1 (b)）.C. Fructicola.呈现细长的分类，圆角平均大小为11.29 μ.m×3.41 μ.m（n= 50)，如图所示1 (c)(A).我们还在小组中发现了卵圆形附着体(图1 (c)（b）），setae（图1（e））Acervuli和Conidiophore的形成（图1（f）和1（g））.形态学特征与Fuentes-Aragón等人观察到的一致[37]在鳄梨从墨西哥的中央部分水果。在另一方面，利马等人。［38研究了五种刺盘孢属感染了巴西的芒果这些作者指出C. Fructicola.显示没有分类，而在本研究中则观察到这些结构。

Prihastuti et al. [39]报道C. Fructicola.在泰国孤立的咖啡樱桃（Coffea属）和花生叶斑病（arachis.）.在巴西，病原体C. Fructicola.在Viera等人的芒果中还报道。［40]，也有报道在亚洲，非洲，美洲的各个主机的炭疽病[原因41］．同样地，Fuentes的-阿拉贡等。［37)确认,C. Fructicola.以前报告为c、然后它被重新分类了。不止一种刺盘孢属可以影响单一的植物，只有基于病原体的形态变成了由于物种之间的高形态相似性而成为一个问题C.暹罗和C. Fructicola.，已密切相关，形态相似的物种。因此，分子特性的重要性刺盘孢属物种 [42］．

(2)丛赤壳属haematococca．该病原体呈现出圆形形状，棉花的同心环和在宏观水平处具有丰富的纹理。在培养皿的前面，在48小时的生长后观察到一个红紫色的中心，在第三天之后改变为白棕色的色调和棉状眼的棉状音调。在培养皿的后面，我们在培养皿的中心观察到培养皿中心的深棕色，周边是黄色橙色的音调;培养基变成了黄色橙色音调。与...相比，这种病原体呈现出低的增长率C. Fructicola.，在8天内覆盖90%的培养皿(图2（a）和2（b））.

此外,n haematococca呈现广泛的菌丝体酱（图2（c）)，新月形大孢子，隔平均约为3.69μ.米×0.98μ.m（n=(图25)2（d）），圆形到长圆形结束的微生物结束（图2（e）)和分生孢子梗(图2（f））在微观水平。通过翰林[描述的形态特征43]以及Nalim等人描述的那些。［44]，与关于分枝体，麦克科菌，微核苷酸和菌丝体的描述的那些研究。

n haematococca(也称为Haematonectria Haematoccca.)通常被称为无性名称F. Solani.．在被称为“复杂物种”的物种中，它是被研究最多的物种腐皮镰孢霉菌，其中包括约50个物种[45，46］．这个属的物种可以殖民许多具有经济重要性的宿主，如谷物、观赏植物和蔬菜，造成茎和根腐病、突然死亡综合症和萎蔫以及大约100个不同植物属的各种疾病[47，48］．

3.1.2。分子鉴定

我们扩增了562 bp和530 bp的DNA片段，如图所示3.．PCR产品的爆炸分析显示了92.75％的身份C. Fructicola.和95.38％的身份N. haematoccca，分别。我们使用的序列进行系统发育树C. Fructicola.和n haematococca观察与爆炸发现的其他物种相似度（图4和5）.在这个意义上，我们发现与微生物的距离最近刺盘孢属和丛赤壳属属。此外，该分析证实了先前鉴定的物种。由不同物种引起的疾病刺盘孢属它可能感染广泛的主体是由于病原体寿命的复杂性。这些循环受到通过在宿主 - 病原接口中产生的特定酶和次级代谢物的特定基因和生物化学相互作用的信息进行高度调节。49］．另一方面，F. Solani.可以适应不同的环境，反映了物种的遗传塑性和代谢多样性。该物种代表了与机会性真菌感染相关的最重要病原体之一[47，48］．

各种植物疗法属Botryosphaeria，Dioporthe，Mycosphaerella，Fusarium， 和刺盘孢属仅根据形态分类学特征的分类是很难识别的[42，50，因此有必要进行分子鉴定。

3.1.3。在体外测试

数据6和7提取提取物对抑制百分比的影响C. Fructicola.和n haematococca孵化八天后。

含水提取物显示出两种病原体的抑制率最高。

（1）C. Fructicola．植物提取物的抑制作用表明形成了四种统计基团。在第1组中，对照（用杀菌剂，没有杀菌剂，与DMSO试剂）和己烷提取物（HESL，HEPL和HESS）呈现出0％的抑制。

在第二组中，提取物HEPS，AESL，AEPL，EESL，EEPL，EES，MESL，MEPL，CASS和MEPS与控件相比没有显着的统计差异（ ）但显示出较高的抑制率，范围为11.41（EESL和MESL）至16.78％（EEPL）。

提取抑制培养基百分比的提取物位于第3组（AESS，AEPS EEPS和混乱）。AEPS（27.57％）显示了该组的最高抑制率。在第四组内，有含水提取物AQESL，AQEPL，AQ患团和AQEPS，具有重要的抑制作用，突出显示49.86％的抑制作用（ ）.

关于对照，观察到病原体对商业杀菌剂没有敏感性，这可能是因为评估的菌株已经为杀真菌剂的活性成分开发了耐受性，而DMSO不会抑制真菌。因此，DMSO溶剂不会干扰病原体的菌丝生长（图6）.

(2) n haematococca．结果显示，形成了三个统计上不同的组。20种植物提取物中n haematococca，只有部分抑制作用(HEPS、AEPL、AEPS、EESL、EESS、EEPS、MESL、MEPS)，其余刺激病原菌菌丝生长(图)7）.

提取物HESL，HEPL，HESS，AESL，AESS，EEPL，MEPL和MESL刺激了呈现与商业杀菌剂和DMSO试剂的对照的病原体的菌丝体生长。在本集团中，HEPL表现出对病原体的最高生长刺激。关于提取物，AEPL，AEP，EESL，eess，EEPS，MES1和MEPs的组，它们对阴性对照表达了类似的行为，抑制百分比从1.5〜6.4％的提取物AEPL，AEP，EESL，eess，EEPs和MESL，而该组抑制最高的提取物是HEPS，14.5％（ ）.figure4结果表明，水提物AqESL、AqEPL、AqESS和AqEPS的抑制作用较其他部位明显。AqEPL抗真菌活性最高(47.89%)n haematococca(图7）.

本研究中进行的生物测定表明C. Fructicola.是对AQEPL最高易感性的病原体。根据Vásquez等。［50，这种行为可以解释为提取物中的化学成分和生物活性化合物的浓度差异，这导致了病原菌反应的差异。

Chavez-Quintal等人[16]评估体外副产品乙醇萃取物的抗真菌活性c .木瓜l .简历。马拉多尔（番木瓜叶子和成熟和未成熟的水果种子）反对匍枝R.，镰刀SPP。和c、结果表明，木瓜叶提取物抑制效果最好镰刀种虫害和c、与木瓜种子提取物相比。同样，他们报告了抑制的百分比24.2％镰刀21.8％C. gloooosporioides。此外，这些作者报道了0%的抑制根霉。这些结果来自于本次调查得到的不同，因为在这项研究中的抑制率是49.86和47.89％C. Fructicola.和N. haematoccca，分别。巴斯克斯等人。［50报道，病原体对植物提取物的差异响应是由于电阻机制（酶，结构，膜渗透性的变化），其允许病原体利用或解毒植物提取物中存在的一些存在的化合物。他们还提到，病原体对植物提取物的易感性主要取决于真菌的物种和致病性以及有机体受到的治疗的浓度。Alberto和Otanes [51]确定三种植物疗法真菌的敏感性（c、，C. acutatum， 和f . chlamydosporum结果表明，以氢氧化铜为活性成分的杀菌剂对三种植物病原真菌的抑制率均为0%。

上述结果与本研究结果一致，因为所评估的病原体(C. Fructicola.和n haematococca）与含杀真菌剂氯氧化铜作为活性成分进行了对比，获得在两种病原体0％抑制。所提到的研究人员认为，杀真菌剂的有效性将取决于针对病原体的作用方式和杀菌剂的频谱。Gharieb等。［52]进行一项研究，他们研究了氧基氯化铜的杀菌剂耐受真菌的活性，并且涉及耐受性的可能机制，观察用铜制剂的杀菌剂溶于水差，其抗真菌活性将取决于它们的溶解和能力铜⁺²离子。此外，这些研究人员提到了真菌开发的主要铜耐受机制是由于能够防止铜进入细胞或减少细胞中铜的积累。此外，它们提到，由于细胞吸收的铜量的降低，培养基的pH降低导致培养基的铜对真菌的毒性降低。

关于生长刺激n haematococca与提取物HESL，HEPL，HESS，AESL，AESS，EEPL，MEPL，和MESL和用杀真菌剂，Oliva的等。［53的抗真菌活性太阳之graveolensL.提取物对7种真菌有抑制作用，报道一些提取物刺激了病原菌的生长。作者将这种行为归因于低水平的潜在有毒物质，这种现象被称为“激效”。

表格1显示了水提物的抑制作用C. Fructicola.和n haematococca在孵化不同的日子之后。

３．２．植物化学定性和定量分析

对木瓜和soursop的叶片和种子的水提取物进行了定性和定量的植物化学分析，因为水提取物对两种病原菌有较强的抑制作用。酸草籽提取物的次生代谢物(甾醇、生物碱和皂苷)含量较低，而酸草叶提取物对生物碱和香豆素呈负(-)反应。而抗真菌活性最高的叶片提取物和木瓜籽中除蒽醌类和香豆素外，其余大部分次生代谢产物均为正(+)。值得注意的是，香豆素只存在于木瓜叶提取物中2）.Sankarganesh等人[54研究发现，木瓜叶含有有效的次级代谢产物，如生物碱、酚类化合物、类黄酮、皂苷、单宁、苷等化合物。16[发现番木瓜叶提取物的生物活性化合物几乎是众所周知的，而是具有抗真菌性质的次级代谢物的潜在来源，因为存在生物碱，黄酮类化合物，三萜酸盐中的葡萄糖提取物中的生物碱，黄酮类化合物，三萜。

另一方面，香豆素（苯丙烷型途径中产生的次级代谢产物）是一种在植物中植物防御植物成熟期间植物成熟期间的植物的一种植物脂蛋素，其具有密切关系植物对真菌疾病[7，55］．Madinah等人[56]提出了木瓜籽水提取物的植物化学分析结果，显示酚类化合物、类黄酮、单宁和生物碱含量较高。Gavamukulya等人[57]报道生物碱，萜类，植物甾醇类，酚类，黄酮类化合物，单宁酸，皂甙，和蒽醌类的在刺番荔枝叶的水提取物，将其内容不同于该研究的结果由于不存在生物碱和香豆素。科里亚-特列斯等。［58]报道了酸参中212种生物活性化合物;其中，酚类、生物碱类和乙酰丙酮类化合物最为丰富。

Rodríguez等[59表明黄酮类化合物等次生代谢产物具有较高的生物活性，包括抗菌活性。此外，单宁酸负责抑制细胞中的蛋白质合成，而酚通过氧化化合物产生酶抑制。生物碱在微生物中的抑制作用是由于能够插入DNA、停止蛋白质合成、诱导凋亡和抑制碳水化合物代谢酶。生物碱如饮碱、巴马汀和桑椹苷是有毒的异喹啉生物碱，可抑制细菌、真菌和病毒的生长。这些生物碱与作为受体和酶的氨基酸的阴离子和亲核基团反应，抑制它们的功能[60]，而Terpenes的作用机制尚未完全阐明。然而，建议它们可以通过亲脂化合物引起膜析。皂苷是非挥发性化合物，其关于真菌的主要作用类似于抗生素的效果，导致孔隙形成和膜完整性的损失[61，62］．

3.2.1之上。酚类

酸草叶提取物(219.14±8.52 mg GAE/L)和木瓜叶提取物(122.39±6.56 mg GAE/L)的酚含量均高于酸草叶和木瓜籽，而木瓜籽提取物的酚含量最低(92.96±5.63 mg GAE/L)3.）.据Gavamukulya等人报道。［57]，索索叶水提物和乙醇提物总可溶性酚含量为683.69μ.g / ml gae和372.92 μ.分别g / mL GAE。这些数值低于本调查报告的数值。Adefegha等人[63]，分析了果皮、果肉和酸草籽提取物的酚含量和抗氧化性能。在这项研究中，他们得到了酸草果各分析部位之间的酚含量差异，发现果皮中的酚含量大于种子和果肉。这是归因于这样一个事实:果皮暴露在阳光的紫外线等环境压力,导致强烈的合成酚类化合物的植物,种子时保护的食用水果的一部分,因此,不暴露在压力因素。Adefegha等人提出的结果[63与本研究结果有相似之处，因为木瓜和酸草叶中酚类物质的含量大于木瓜和酸草籽中酚类物质的含量。

3.2.2。单宁

Soursop叶片中存在的单宁（159.84±10mg gae / g dm）高于其余水提取物中获得的单宁。木瓜叶的水性提取物（75.64±4.79 gae / g dm）具有最低的单宁含量。单宁是在植物液泡表面中发现的酚类化合物，并通过氢或共价键与蛋白质氨基酸组的非特异性地结合到蛋白质[64］．

3.2.3。类黄酮

黄酮类化合物是酚类化合物，具有多种生物功能的抗氧化性能，包括抗菌和细胞毒性[64］．黄酮类化合物属于一大群多酚化合物，存在于植物的任何部分[65］．结果如表所示3.其中，草酸叶黄酮含量最高，为0.13±1.12 × 10⁻⁴RE/g dm含量次之，为0.14±9.41 × 10⁻⁵RE / G DM，番木瓜种子和糖浆叶的水性提取物显示出较低的黄酮含量。

3.2.4。皂苷

皂苷含量最高的是酸草籽(1.2±0.1 mg QSES/g dm)，其次是木瓜叶(1±1.64 × 10)^-14毫克qs / g dm)。在定性分析中，两种提取物的泡沫含量稳定一致，而木瓜籽和soursop叶提取物的泡沫含量很少且不一致。皂苷是甾体类或三萜类的次级代谢物，这些甾体类或三萜类负责植物抵御病原体和昆虫[66］．皂苷对不同生物的毒性与生物膜的相互作用有关，也可能与皂苷的皂化特性有关[66］．

3.2.5。生物碱

在四种水提物中，木瓜叶的生物碱含量最高(6.413±1 × 10)⁻³ mg EA/g dm) while in papaya seed, soursop seed, and leaf extracts, the values obtained were 6.25 ± 5.7 × 10⁻⁴， 6.25±1.15 × 10⁻³， 6.25±5.7 × 10⁻⁴分别。

Alexander等人[67]进行了一项调查，以评价植物的化学物质和抗菌活性c .木瓜土地Psidium guajava(尼日利亚使用的两种药用植物)用索氏提取器提取生物活性成分。结果显示，木瓜叶提取物中生物碱的含量为0.16±0.01 mg/100 g dm，与本研究的结果有所不同，这可能与提取方法和溶剂有关。木瓜叶中的生物碱以carpain, pseudocarpain, piperidine macro环，hydrocarpain I, hydrocarpathin II和尼古丁的形式存在[54］．松浦和费特 - 内托[68提到植物中生物碱和其他次生代谢物的存在通过提高植物对生物因素和非生物胁迫的防御能力来提高生殖率。这些研究人员指出，植物中存在的生物碱之所以更重要，是因为它们具有抵御食草动物的作用，因为有些生物碱具有苦味，一旦被摄入和代谢，就会破坏蛋白质的功能，还会改变神经系统。

植物能产生大量各种各样的生物活性化合物;然而，植物提取物的质量将取决于使用的植物部分和用于提取这些化合物的技术。提取物的效果将取决于植物材料的性质、来源、加工程度、湿度、粒径以及提取方法(包括提取类型、时间和温度)的变化[69］．

同样，影响提取物中次级代谢物组成和数量的另一个参数是用于萃取的溶剂的性质及其极性[8］．Ncube和Afolayan [69]表示的化学物质中存在的提取物的量将取决于萃取，植物，作物和植物的性别年龄的方法。

4.结论

我们把病原体鉴定为C. Fructicola.和n haematococca根据它们的形态和分子特性（芒果和刺果番荔枝，分别地）。木瓜和刺果番荔枝叶和种子的水提取物（水作为溶剂）呈现抑制两种病原体的最高百分比。此外，木瓜叶的水性提取物是所有提取物中最有效的。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者同样贡献给手稿的写作并批准了最终版本。

致谢

这项工作得到了Fondo Sectorial deInvestigaciónen MateriasAgrícola，Pecuaria，Acuacultura，Agrobiotecnologíayrecursosfitogenéticos（Sagarpa-Conacyt，México）和Fongo Sectorial deInvestigación（Sep-Conacyt，Méxict））授予不。242718.第一作者感谢全国科学技术委员会（Conacyt）的奖学金。

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