文摘
免疫调节对感染性休克是至关重要的(SS),但尚未得到明确的解释。我们的目的是探索潜在的生物标记的党卫军通路和免疫相关基因的转录分析改善早期检测。GSE57065和GSE95233差异表达基因微阵列数据被用来屏幕(度)党卫军。基因本体和KEGG(京都基因和基因组的百科全书)通路富集分析度进行,和免疫细胞和通路富集成绩之间的相关性进行了分析。候选基因的预测价值评估是由接受者操作特征(ROC)曲线。GSE66099、GSE4607 GSE13904数据集用于外部验证。收集血液样本6个患者和6个控件验证中存在和免疫印迹。总的来说,550度在党卫军被确定;这些基因参与了免疫反应,炎症和感染。的几种途径和水平渗透的CD4 +中医,CD8 + T细胞,preadipocytes党卫军例之间的不同和控制。17基因被确定为潜在生物标志物的党卫军(ROC曲线下的地区> 0.9)。 The downregulation ofCD8A,CD247,CD3G,LCK,HLA-DRA在学生实验证实。我们确定了几个相关的几种生物标志物在党卫军可能改善早期疾病风险的识别。
1。介绍
脓毒性休克(SS)被定义为一个感染相关性循环功能障碍和代谢紊乱,临床上与心肌功能障碍和减少射血分数(1,2]。病人体征和症状包括发烧、快速心率、呼吸短促、虚弱和出汗,缺氧,改变精神状态(3]。肾功能衰竭、恶性肿瘤、糖尿病、慢性肺病、充血性心力衰竭,免疫抑制的风险也会增加学生(4]。目前,党卫军是住院病人死亡的主要原因,死亡率高达40% (5,6]。虽然组织灌注后可迅速恢复了SS患者积极液体复苏和有症状的治疗作用于血管的药物和抗感染药物,出院后复发的风险高(7]。此外,超过一半的幸存者身体和神经认知功能受损,情绪障碍,和穷人的生活质量(8,9]。降低死亡率,提高患者的生活质量党卫军复苏后,临床研究正在进行;但是,早期的无法治愈的multiorgan失败使得经济复苏过程很困难。因此,除了改善程序管理,增加早期识别的特异性也可以有效地提高学生的生存。
先天免疫和适应性免疫响应中发挥关键作用,党卫军。诱导炎症反应期间,单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞激活,加剧血管损伤通过产生细胞因子,蛋白酶,激酶和活性氧(10]。免疫抑制反应是活跃在SS患者(11),B细胞的凋亡和滤泡树突细胞是参与这个过程12]。T淋巴细胞明显有助于免疫系统,和T细胞异常患者中发现了党卫军(13]。此外,免疫功能紊乱,从而影响明确原发性感染的能力,增加继发感染(14,15]。Tolsma等人发现,嗜中性白血球减少症和特定的免疫缺陷是独立与SS患者死亡的风险增加(16]。然而,免疫功能紊乱的机制有助于学生的发展仍不清楚,尽管生物标记的发展的重要意义。
在这项研究中,我们分析了几种途径参与学生发展和确定候选生物标志物。首先,我们筛选差异表达基因(度)SS患者和健康对照组之间基于基因表达数据从公共数据库,紧随其后的是浓缩度的分析。免疫细胞反褶积分析和pathway-immune细胞进行了相关分析来确定关键的免疫相关基因。最后,关键基因的表达被验证定量实时聚合酶链反应和免疫印迹(存在)。研究显示在图的流程图S1。我们的发现将有助于开发个性化的SS患者的免疫治疗方案。
2。材料和方法
2.1。数据采集
两个微阵列数据集,GSE57065 GSE95233,从基因表达综合下载(地理,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[17]。GSE57065由28个病人的血液样本数据收集30分钟内,24小时,48 h后SS和25健康对照组。GSE95233包括22名健康对照组和SS患者51,采样两次入学和D2和D3。GSE57065和GSE95233样本数据集都检测到使用GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix人类基因组U133 + 2.0数组。GSE4607和GSE13904用于外部验证候选基因表达之间的健康对照组和党卫军。GSE66099,其中包括数据30全身炎症反应综合征(SIRS)和181 SS样品,用于比较党卫军样品和样品之间的表达差异具有相似或相关的疾病表型党卫军。
2.2。数据预处理和基因注释
基于这两个数据集,探测器表达矩阵归一化和log2转换后下载。此后,注释文件从检测平台得到匹配的基因符号里面探头数量;探测器不匹配的基因符号被移除。如果不同的探针被映射到相同的基因符号,探针的平均值作为最终的基因表达值。
2.3。筛查党卫军样本和控制之间的度
3.10.3 limma包版本R(18)(http://www.bioconductor.org/packages/2.9/bioc/html/limma.html)是用于分析基因表达差异党卫军样品和健康对照组。Benjamini &业务(BH)方法(19)是用于计算调整p价值。基因的调整p值< 0.05和| logfold变化(FC) | > 1被选为度。
2.4。功能性浓缩度的分析
大卫[6.8版本20.)(https://david-d.ncifcrf.gov/)申请基因本体论(去)21)浓缩度根据三个主要类别的分析,生物过程(BP),电池组件(CC),分子功能(MF),以及《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG) [22)通路富集分析。结果与 和基因数> 2被认为是具有统计学意义。
2.5。蛋白质相互作用网络建设(PPI)
GSE57065和GSE95233数据集之间的相交度预测PPI获得使用字符串版本10.0 (23)(http://www.string-db.org/)。在这分析,物种被设定人类,最高的信心得分被设置为0.9。Cytoscape版本3.4.0 [24)(http://chianti.ucsd.edu/cytoscape-3.4.0/)是用于可视化PPI网络,CytoNCA 2.1.6[插件版本25)(http://apps.cytoscape.org/apps/cytonca)是用于分析节点度参数设置“没有重量。”
2.6。基因集富集分析(GSEA)
的R包clusterProfiler版本3.16.0 [26)(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)是用来执行GSEA。KEGG通路基因的分子签名数据库(27)(MSigDBhttp://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)是用作背景基因集。SS样本之间的度和控制与调整 和| logFC | > 0.263被选作为输入基因和被logFC按照降序排列。黑洞最终被用来调整值,通道与调整值小于0.05被认为是具有统计学意义。
2.7。微分函数和途径的分析
通过考虑c2.cp.kegg.v7.1.symbols。在格林尼治时间MSigDB为背景基因集,R包GSVA版本1.36.2 [28)(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/GSVA.html)是用来计算KEGG通路在每个样品的浓缩的分数。得分矩阵。显著KEGG途径差异被确定使用limma包和阈值的调整值< 0.05和| logFC | > 1。
2.8。免疫和基质细胞反褶积分析
伊势亚(29日)(https://xcell.ucsf.edu/)被用来估计浓缩分数为64类型的免疫和基质细胞的阈值 。Wilcoxon测试被用来比较浓缩党卫军样本和控制之间的成绩,是和意义 。GSE57065之间共享不同浓缩免疫细胞和GSE95233获得候选人进行进一步的分析。
2.9。途径和免疫细胞之间的相关性分析
通过考虑结果的交叉GSEA GSVA,关键路径选择。斯皮尔曼相关系数之间的关系通路富集得分和免疫细胞反褶积积分计算每个样本。相交关系的调整值< 0.05和|r| > 0.4 GSE57065和GSE95233被选为重要cell-pathway交互。
2.10。评估的关键基因
的交集pathway-related基因cell-pathway交互和基因与度超过10 PPI网络被确认为关键基因。的R包0.5.0 ggstatsplot版本被用于构造小提琴块关键基因在不同的团体,虽然R包plotROC 2.2.1版本是用于生成诊断接收机运营商为每个基因特征(ROC)曲线。
2.11。血液样本集合
全血样品和白细胞样本12参与者SS和六个健康对照组患者(6)收集中存在和免疫印迹,分别。患者诊断根据标准定义的欧洲社会的重症监护医学/危重病医学的社会。SS患者血管加压的维护所需平均动脉压大于65毫米汞柱,升高血清乳酸大于2更易与L,尽管充分液体复苏(6,30.]。癌症患者、糖尿病、自身免疫性疾病或病毒感染被排除在研究之外的历史。健康体检中心的志愿者注册,和主题史的重大疾病或感染被排除在外。所有受试者被告知这项研究的目标和程序,并相应地得到签署知情同意。本研究经伦理委员会批准的甘南医科大学第一附属医院(不:llsc - 2021101302)和符合《赫尔辛基宣言》。
2.12。存在分析
核心PPI网络的基因和基因中存在较大的褶皱变化值被选中。总RNA从全血中提取样本使用试剂盒试剂(9109;豆类,Kusatsu)。反转录后,cDNA量化了实时PCR ABI 7900 ht快(应用生物系统公司)和电力SYBR绿色PCR主组合工具包(A25742;热,沃尔瑟姆,妈,美国)。GAPDH作为一个内部参考。正向和反向引物序列如表所示S1。反应条件如下:50.0°C 2分钟,10分钟95.0°C, 40周期为95.0°C 15年代和60年代的60.0°C。的相对表达水平检测一式三份,并规范化使用2−ΔΔct方法。
2.13。免疫印迹分析
基因连接在PPI网络的最大程度被选为免疫印迹分析。抗体HLA-DRA (A11787)和LCK (A2177)获得ABclonal(武汉,中国),而GAPDH抗体(60004 - 1 - lg)是购自Proteintech(美国Rosemont, IL)。免疫印迹分析使用标准程序执行与anti-HLA-DRA(1: 1000)和anti-LCK (1: 1000)。与二次抗体2 h后孵化(anti-rabbit免疫球蛋白:111-035-045,杰克逊;anti-mouse免疫球蛋白:115-035-003,杰克逊),蛋白质乐队是通过化学发光使用微孔发射极耦合逻辑系统(美国Billerica的)。此后,乐队进行扫描并记录使用Tanon图像(Tanon、上海、中国)。
2.14。统计分析
Tanon图像被用来分析免疫印迹的灰度数据。存在和免疫印迹结果分析了使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)并使用直方图可视化。mRNA和蛋白表达水平的差异SS和对照组之间的候选基因进行了分析t测试。统计数据 , ,和 代表重要的,非常重要,非常重要。
3所示。结果
3.1。筛选学生样本和健康对照组之间的度
基于矩阵的表达式GSE57065 GSE95233,主成分分析(PCA)进行(数据1(一)和1 (b)),它揭示了SS和对照组间差异明显的数据集。没有明显的异常值,可用于进一步的分析样品。总的来说,763年和933年度得到GSE57065和GSE95233分别如图1 (c)和1 (d)。度与| logFC | > 2选择构建一个热图(数字1 (e)和1 (f));这些基因被确定为SS和对照组之间的显著差异表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。度的函数和通路富集分析
去和KEGG通路富集分析度的两个数据集进行。124年GSE57065主要是丰富度GO-BP术语中,34 GO-CC来说,30 GO-MF条款,32 KEGG通路。127年GSE95233主要是丰富度GO-BP术语中,37 GO-CC术语中,41 GO-MF术语,34 KEGG通路。基于的排名值,前十名GSE57065和GSE95233显示在数据的功能2(一个)和2 (b)。其中,MHC II级蛋白质复杂的绑定GO-MF GO-CC t细胞受体复杂,t细胞激活GO-BP显示最高的褶皱浓缩在这两个数据集。丰富KEGG通路是跨两个数据集(数据大致相符2 (c)和2 (d)),从而表明GSE57065和GSE95233良好的均匀性和可靠性。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。PPI网络的建设
度的交集GSE57065 GSE95233包括550个基因(图3(一个))。这些度被用来构造一个PPI使用字符串。共有1104个蛋白质相互作用涉及243份(图3 (b))。节点与PPI网络连接有更大的贡献。
(一)
(b)
3.4。GSEA
与GSEA 5调节和13个表达下调GSE57065途径获得,而7调节和15表达下调GSE95233途径获得。根据归一化富集得分(NES),前六调节途径,包括阿尔茨海默病、补充凝血级联,氧化磷酸化,帕金森病,和六大途径,使之抑制移植物抗宿主病、原发性免疫缺陷,和t细胞受体信号通路中选择数据集和显示在图中4。
3.5。微分通路富集分析
KEGG通路的浓缩分数为每个示例使用GSVA算法计算。基于丰富的微分分析途径,GSE57065和GSE95233 15大大下调KEGG通路。所示的热图(数字5(一个)和5 (b)),浓缩成绩这些通路不同显著SS和对照组之间。
(一)
(b)
3.6。反褶积分析的免疫和基质细胞
评估免疫细胞浓缩两组之间的差异,我们得到了浓缩分数64类型的免疫细胞和基质细胞在每个样本和SS和健康对照组相比Wilcoxon测试(数字6(一)和6 (b))。总共11和14个类型的细胞在两组之间有显著不同的浓缩的得分GSE57065 GSE95233,分别。通过考虑交叉口(图6 (c)),6种类型的细胞,包括巨核细胞、CD8 + T细胞CD4 +中药preadipocytes,成骨细胞、上皮细胞、SS样本之间的差距显著控制在两个数据集。
(一)
(b)
(c)
3.7。通路之间的相关性和免疫细胞
获得的重要途径的交集GSEA和GSVA包括12 KEGG通路。斯皮尔曼相关系数得到评估这12个关键路径和频率之间的关系在每个样品六个重要的细胞类型。因此,41岁和27 cell-pathway关系得到GSE57065 GSE95233,分别。最后,21重叠cell-pathway关系显著正相关性被确定。这些21 cell-pathway关系包含10个关键路径和3的关键细胞,包括CD8 + T细胞、CD4 + T细胞,和preadipocytes;他们的关系在GSE57065和GSE95233总结表1。
3.8。关键基因的预测性能
十字路口的基因参与10 PPI网络的关键途径和基因(度> 10),和17个关键基因(CD8A,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1,HLA-DQB1,HLA-DRA,ZAP70,MAPK14,CD247,CD3D,CD3E,CD3G,LCK,PRKCQ,ITK,纬度,菲英岛),如表所示2。这些17基因之间的差异学生样本和控制GSE57065 GSE95233进行分析,和ROC曲线进行比较探讨他们在党卫军的诊断价值。所有17个基因差异表达显著的两个数据集( )。其中,16个基因表达下调MAPK14在党卫军调节。此外,基于这两个数据集的ROC曲线表明,这些候选基因为党卫军高级诊断值,与曲线下的面积(AUC)值大于0.9。小提琴的阴谋和ROC曲线LCK和HLA-DRA曾在PPI网络的连接度最高,如图7(一)和7 (b)。
(一)
(b)
3.9。验证与外部数据集
验证表达式的差异之间的17个候选基因健康控制和SS样本,GSE4607和GSE13904数据集用于外部验证。在GSE4607数据集(图8(一个)),所有显示显著差异表达基因在两组之间,只有MAPK14是调节在党卫军GSE13904数据集(图8 (b)),MAPK14仍在党卫军,另15个基因明显下调的党卫军样本,除了吗HLA−DQA1。GSE66099数据集包括后来来验证这些基因是否表达特异性党卫军,使其区别于其他类型的炎症。表达水平的CD3E,CD3G,菲英岛,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DRA在众位和SS(图中明显不同9),这表明这六个基因可能导致党卫军炎症。
(一)
(b)
3.10。实验验证表达式
总共12全血样品(6例和6控制)收集验证关键基因的表达。在17个关键基因,这些在PPI网络的连接度最高的(LCK和HLA-DRA)和褶皱最高的基因变化值在GSE57065或GSE95233数据集(CD8A,CD247,CD3G)被选为验证中存在。如图10 ()这五个基因的信使rna表达水平显著降低SS样品比对照组。由西方墨点法(图10 (b)),LCK的蛋白表达水平和HLA-DRA SS患者明显低于健康对照组。
(一)
(b)
4所示。讨论
败血症和党卫军是危及生命的疾病特异表达的免疫反应引起的感染,可能导致组织和器官损伤甚至死亡(31日,32]。目前还没有有效的治疗SS。因此,疾病负担只能减少早期检测,复苏,促使政府适当的抗生素(9]。与脓毒症不同,党卫军导致失控和加剧炎症反应,但具体时间触发这个过程是难以捉摸的,这强调了党卫军识别基因表达差异的重要性和正常对照组,而非脓毒症早期诊断的患者在疾病进展33]。相比,因此,这项研究mRNA表达谱之间的SS和正常样本,然后确定17的几种基因党卫军的生物信息学分析的进展。这些基因也可能识别党卫军验证群体发展的风险。五个(包括17个基因CD8A,CD247,CD3G,LCK,HLA-DRA)实验验证表达式,考虑他们的PPI网络中的核心作用和在党卫军差别一致对这些样本最后确认。小说的重要生物标志物在本研究提出改善急性发作的早期识别和管理,减少败血病的死亡和残疾。有几个类似的文章,报道了党卫军诊断生物标记(34,35),但我们的研究不同,我们更关注基因参与SS-related免疫调节。因此,我们提出了三个关键免疫细胞CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,preadipocytes这可能是由几种候选基因和参与学生的疾病进展。这些潜在的免疫调节机制是重要的线索了解候选基因的作用在疾病诊断和开发新药物来防止党卫军。
在这项研究中,SS样本之间的度和控制主要是富含生物功能和通路相关的免疫和炎症反应。使用GSVA算法,显著差异的几种功能和途径也发现他们之间,包括t细胞受体信号通路、自身免疫性疾病和原发性免疫缺陷等。支持我们的研究结果和相关生物信息学分析表明,度在党卫军参与免疫反应,chemokine-mediated信号、嗜中性粒细胞趋化作用,趋化因子活动(36]。此外,免疫缺陷通常被观察到在严重脓毒症患者和SS与短期死亡率的风险增加有关16]。
考虑到免疫缺陷在学生发展中的作用,我们进行了反褶积和相关性分析来确定在SS免疫细胞的影响。我们的研究结果的基础上,三个关键免疫细胞类型,即。、CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,和preadipocytes党卫军之间显著不同样本和控制。适应性免疫,sepsis-induced细胞凋亡导致淋巴细胞减少症患者的党卫军,这过程包括所有类型的T细胞,包括T监管细胞、CD4 + T细胞、CD8 + T细胞和自然杀伤细胞,有利于免疫抑制(14]。免疫抑制是一个补偿抗炎反应,解释了短期的SS患者死亡,而幸存者可能经历一个长期免疫抑制状态,可以重新激活的致病性感染(37]。在党卫军,免疫抑制t细胞功能的丧失与减少抗SS患者继发感染(38]。此外,降低细胞毒性分子的表达减弱CD8 + T细胞的溶解性活动(39]。在这项研究中,浓缩分数的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞被发现显著降低SS情况下比在控制。罗杰等人进一步支持我们的研究结果和建议的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞凋亡在控制[SS患者高于40]。以上证据表明度确定在本研究可能会触发免疫抑制,导致学生通过显示CD4 + T细胞和CD8 + T细胞水平。此外,我们还提出了一个preadipocytes和免疫缺陷和t细胞受体相关通路之间的关系。preadipocytes几个因素分泌的促炎和抗炎作用,会引起疾病与免疫系统功能障碍(41]。一些免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂抑制preadipocyte分化,促进脂肪细胞死亡(42]。在这项研究中,我们发现多个基因参与t细胞受体的信号通路,其中菲英岛是表达人类preadipocytes和诱导分化开始后(43]。因此,我们假设preadipocytes党卫军开发期间参与的几种途径的激活诱导的表达菲英岛;然而,仍然需要进一步的调查。
此外,17个关键基因识别的几种cell-pathway对,和核心PPI网络选择的基因表达验证。相关结果表明,信使rna表达水平CD8A,CD247,CD3G在SS样本中表达下调,而LCK和HLA-DRA在信使核糖核酸和蛋白质含量下降。Src的激酶家族成员,LCK参与活动的变化CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在T细胞发育44]。LCK在t细胞分化中扮演着关键角色,生存,和激活(45];然而,的贡献LCK学生的发展还没有探索。关于HLA-DRA研究发现,减少的表达HLA-DR信使rna SS(后与死亡率增加相关46]。温克勒等人报道HLA-DR表达式是减少脓毒症(47),减少了HLA-DR感染性单核细胞的表达可能是一个特征(14]。此外,HLA-DRA基因表达的动态变化和辅助T细胞亚群患者脓毒症具有象征意义的免疫抑制48]。结合研究结果,我们推测LCK的丧失和HLA-DRA表达可能导致T细胞分化的失败和辅助T细胞亚群的动态变化,从而导致免疫抑制和SS的发病。
本研究的主要局限是自身免疫性疾病患者被排除在独立临床验证队列,这在某种程度上影响结果的外推。此外,我们只进行了初步探索这些基因在疾病的潜在的角色。这些候选基因的调节机制导致免疫抑制在党卫军并不明确。在未来的研究中,将使用生物信息学分析预测上游调节机制,和实验方法也将进行确认候选基因的监管效果。此外,由于样本量有限,我们没有进一步的屏幕最健壮的生物标志物从17日确认关键基因的套索回归和/或多变量Cox分析。在未来,最有价值的预测签名应开发基于更有说服力的方法和更大的样本量。
总之,我们发现党卫军例之间的度和控制主要是富含免疫和炎症相关的函数和途径。此外,CD4 + T细胞、CD8 + T细胞,和提出了preadipocytes关键免疫细胞参与学生进步。这些免疫细胞也与17个关键免疫相关基因,其中的差别,对这些基因CD8A,CD247,CD3G,LCK,HLA-DRA党卫军样本进一步实验验证。我们的研究结果揭示一些新颖的生物标志物的党卫军的早期识别。
数据可用性
微阵列数据集包括GSE57065 GSE95233、GSE4607 GSE13904, GSE66099用于这项研究可以从GEO数据库下载http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/。的原始数据中存在和免疫印迹https://doi.org/10.4121/19074482。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
JW贡献概念和设计的研究;JC和赫兹获得数据;LY和CH进行数据的分析和解释;XZ进行统计分析;赫兹起草的手稿;CH和JW执行修订手稿的重要知识内容。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
这项工作是支持的科技项目的甘南医科大学第一附属医院(批准号YJYB202131)。
补充材料
图S1。研究流程图。表S1。使用的引物序列中存在。(补充材料)