文摘

客观的。本研究旨在确定环状RNA RNA (circRNAs)通过高通量测序和区分差异表达(DE) circRNAs之间稳定和不稳定的斑块。方法。RNA序列进行不稳定和稳定的颈动脉斑块样本来自颈动脉狭窄患者。DE circRNAs筛选,六德circRNAs验证使用定量实时PCR(存在)。DE circRNAs的功能评价是通过基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集分析。结果。我们筛选344 DE circRNAs在不稳定斑块,由342年调节和2 circRNAs使之抑制。去分析表明,宿主基因的调节circRNAs与ER高尔基运输囊泡膜,内吞作用的囊泡膜,,跑GTPase绑定。KEGG分析表明,宿主基因的调节circRNAs主要是与蛋白质在内质网处理,赖氨酸退化,同源重组,上皮细胞信号幽门螺杆菌感染,感染鼠疫的。的结果中存在验证三个调节DE circRNAs和两个表达下调DE circRNAs在不稳定的斑块。结论。hsa -中国保监会0001523,hsa -中国保监会0008950,hsa -中国保监会0000571 -中国保监会0001946,hsa -中国保监会0000745可能参与调节动脉粥样硬化斑块的稳定性和作为治疗目标不稳定的斑块。

1。介绍

动脉粥样硬化是一种慢性全身性炎性疾病的动脉壁和最重要的原因之一是全球心血管疾病的发病率和死亡率。这种疾病的特点是动脉粥样硬化斑块的形成,是由于脂质积累,炎性细胞浸润,细胞凋亡,细胞外基质分泌增加(1]。不同于稳定的斑块,脆弱/不稳定斑块有一个活跃的炎症反应,导致变薄的纤维帽和斑块破裂,这是一个致命的心血管疾病的主要原因2,3]。研究表明,基因的失调,扮演关键角色在动脉粥样硬化斑块的稳定性影响他们破裂和血栓形成4,5]。因此,确定积极分子的失调影响斑块的不稳定是重要的诊断、治疗和预后不稳定的动脉粥样硬化斑块。

圆形rna (circRNAs)独特的共价闭合循环的特征,组成一个新的家庭内生非编码rna (ncRNAs)。由于他们的监管活动在许多生物过程,circRNAs最近被认为是潜在的诊断和治疗各种疾病的目标(6,7]。在文献中报道,生物活性与动脉粥样硬化斑块的存在有关,包括炎症、细胞凋亡,和脂质代谢,激活或不激活circRNAs [8,9]。更直接的证据表明,circRNAs与动脉粥样硬化有关中风(10,11和影响动脉粥样硬化斑块稳定性5]。然而,缺乏全面了解circRNAs在斑块稳定性的影响。

在这项研究中,circRNAs表达模式在人类使用RNA序列,分析了稳定和不稳定斑块和差异表达(DE) circRNAs和其潜在功能不稳定斑块的进一步探索。我们的研究结果显示circRNA表达模式的全面了解与动脉粥样硬化斑块的不稳定。

2。材料和方法

2.1。颈动脉狭窄患者样本

动脉粥样硬化斑块收集从颈动脉狭窄患者接受颈动脉内膜切除手术在我们医院。斑块分类基于标准来自美国心脏协会(12由两个独立的调查人员)。在类型I-VIII归类为稳定斑块,斑块类型IV-VI不稳定。在这项研究中,三个不稳定斑块患者注册,和三个稳定的斑块患者登记,与他们的临床信息,如表所示1。总共三个稳定动脉粥样硬化斑块样本和三个不稳定动脉粥样硬化斑块样本获得的,立即在液态氮。斑块是存储在一个冰箱−80°C到RNA序列和定量实时PCR(存在)进行了测定。我们的研究协议已经得到上海浦东医院的伦理委员会批准。研究过程开始之前所有参与者提供知情同意。

2.2。总RNA提取和图书馆建设

美国试剂盒试剂(热)是用来从稳定和不稳定组织中提取总RNA。RNA样本严格控制在三个方面:即RNA的完整性和存在污染用琼脂糖凝胶电泳检测DNA;二世。RNA纯度检测使用NanoDrop分光光度计(美国热科学);三世。准确检测的RNA完整性通过安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技)。

执行库测序,核糖体RNA被撤的总RNA使用Ribo-Zero磁工具包(震中,北京)。随机生成的RNA被打断,然后用于图书馆准备的Illumina公司Truseq™RNA样本准备装备与Ribo-Zero(美国Illumina公司)。合成第一链cDNA的使用上标二世逆转录酶,催化和两样东西互补脱氧核糖核酸的合成是通过DNA聚合酶催化我和核糖核酸酶h .生成的互补脱氧腺苷酸和结扎3′端使用Illumina公司PE适配器寡核苷酸。图书馆通过15个周期使用DNA片段得到丰富与Illumina公司PCR引物PCR的鸡尾酒。

2.3。RNA序列

所有的样品都通过sequencing-by-synthesis测序技术NovaSeq 6000平台。FASTQ格式的原始数据产生受到定性筛选除去劣质读取(读取包含N的10%;小片段长度小于25个基点后质量剪辑)使用Cutadapt (v1.15)软件。生成的干净数据映射到参考基因组(GRCh38) HISAT2 v2.0.5软件,使用CIRI2软件和circRNAs注释。

2.4。DE circRNA识别

intersample皮尔森相关基因表达水平进行了分析评估样本选择的合理性。DE circRNA分析,阅读数circRNAs (back-spliced结读)规范化,以及由此产生的值调整控制错误发现率(罗斯福)。DE circRNAs之间的稳定和不稳定斑块组织进行了分析使用DESeq2基于|日志的筛选标准₂褶皱变化|≥1和罗斯福< 0.05 (13]。

2.5。基因本体论(去)基因和基因组的条款和《京都议定书》百科全书(KEGG)通路的调节circRNAs分析

在不稳定斑块的潜在功能调节circRNAs被去术语的注释和分析建立KEGG通路使用clusterProfiler R包。有三个类别去丰富宿主基因,即生物过程(BP),电池组件(CC)和分子功能(MF) [14]。值< 0.05为代表的意义丰富术语或KEGG通路。

2.6。中存在

六德circRNAs,即。,four upregulated circRNAs and two downregulated circRNAs, were selected for qRT-PCR verification (n为每个组= 3)。简而言之,总RNA从三个稳定和三个不稳定的均质斑块组织使用RNAiso +(豆类9190;豆类生物医学科技(北京)有限公司,中国)。纯化RNA沉淀溶解在DEPC H₂啊,用分光光度计测量总RNA分离的纯度和浓度。随后,总RNA (1000 ng)是反向转录成互补脱氧核糖核酸(10μL)反应系统的使用PrimeScript RT主混合(豆类RR036A;豆类生物医学科技(北京)有限公司,中国)。生成的cDNA使用荧光放大中存在使用电力SYBR绿色PCR反应混合液(热4367659;之后,美国制造商的协议。放大条件95.0°C 10分钟,其次是40周期95.0°C 15年代和60年代的60.0°C。使用引物的序列表中列出2。的相对表达水平相关DE circRNAs测定使用2^−ΔΔCT方法,以GAPDH为内部控制。

2.7。统计分析

数据平均值±标准偏差。两组之间的比较是通过学生的进行的t测试在Graphpad棱镜5软件(美国)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。circRNA概要文件在斑块DE circRNAs的RNA序列和识别

总共有2450 circRNAs被RNA序列注释3稳定斑块和不稳定的斑块。基于|日志₂FC |≥1和罗斯福< 0.05标准和比较稳定和不稳定斑块,我们确定了344 DE circRNAs不稳定斑块,由342年调节和2 DE circRNAs表达下调(图1(一))。最明显的DE circRNAs火山情节在图所示1 (b)。表3显示了前15名调节circRNAs斑块的不稳定。

3.2。去条款和KEGG通路调节DE circRNAs的浓缩

鉴于大多数DE circRNAs调节,我们预测的功能调节DE circRNAs基于GO和KEGG数据库。去富集分析集中在三类(英国石油(BP)、CC和MF)。根据丰富的宿主基因调节circRNAs,我们排名前20名的三类图2。值得注意的是,最丰富的在每个方面的三类同形像切换免疫球蛋白g同形像,线粒体钙吸收,抗原处理和表示在英国石油公司(图2(一个)),内吞作用的泡,高尔基运输囊泡膜ER, MHC II级蛋白质复合体在CC(图2 (b)),以及vinculin绑定,跑GTPase绑定,钾通道在曼氏金融监管机构活动(数据2 (c))。此外,KEGG通路富集分析表明,宿主基因的识别DE circRNAs主要是内质网相关蛋白处理,其他多糖降解,赖氨酸退化,同源重组,上皮细胞信号幽门螺杆菌感染,生成信号通路,核苷酸的生物合成糖,氨酰生物合成,内吞作用,鼠疫感染(图3(一个))。基于pathway-related基因的数量,这些途径分类内吞作用,内质网蛋白处理,鼠疫感染,生成信号通路,上皮细胞信号幽门螺旋杆菌感染、赖氨酸退化、氨酰生物合成,同源重组,核苷酸的生物合成糖等多糖降解(图3 (b))。

3.3。验证使用中存在的RNA序列

使用中存在化验,RNA测序结果验证四个调节DE circRNAs (hsa -中国保监会0001523,hsa -中国保监会0008950,hsa -中国保监会0000571和hsa -中国保监会- 008267)和两个表达下调DE circRNAs (hsa -中国保监会0001946和hsa -中国保监会0000745)。结果表明,较稳定的斑块,hsa -中国保监会0001523的表达水平,hsa -中国保监会0008950和hsa -中国保监会0000571在不稳定斑块显著增加 ,而hsa -中国保监会0001946的表达水平和hsa -中国保监会0000745明显下降( ,图4),符合测序的表达模式。hsa -中国保监会0008267,没有显著差异的表达式之间的稳定和不稳定斑块( ,图4)。结果表明,存在的和合率结果和测序数据大约是83.33%,这意味着RNA序列的相对较高的可靠性。

4所示。讨论

RNA序列由生化浓缩策略和深入的生物信息学方法允许ncRNAs综合研究疾病的发病机理(6]。的失调ncRNA表达谱中发现了动脉粥样硬化进展的不同阶段(15]。然而,全面了解circRNAs在不稳定斑块的表达和功能缺乏。本研究确定了DE circRNAs之间不稳定的和稳定的斑块,发现344 DE circRNAs不稳定的斑块。最终,德的失调circRNAs验证不稳定斑块的存在。

CircRNAs吸引了越来越多的关注,他们的角色和功能操作的多个代谢和信号通路在疾病的发病机制通过影响多种生理功能,如小分子核糖核酸或蛋白质的吸光度和蛋白质功能的直接控制16]。circRNAs守恒的表达式的特点及其对基因表达的影响表明,circRNAs扮演重要的角色失调的生理和病理变化。先前的研究证明的价值作一综述circRNAs作为动脉粥样硬化的诊断标志物和治疗靶点[17]。玉等人的一个研究表明,circRNAs扮演一个角色在保护动脉粥样硬化斑块稳定性(5]。circRNAs对斑块稳定性的影响表明一个有前途的方向斑块破裂的管理。这使我们探索异常表达在不稳定斑块circRNAs相比,在稳定的斑块。我们的RNA序列显示,总共2450注释circRNAs,有342调节circRNAs和2表达下调circRNAs;这是一个大量的数据关于DE circRNAs不稳定的斑块。RT-qPCR结果还显示,hsa -中国保监会0001523,hsa -中国保监会0008950和hsa -中国保监会0000571调节,而hsa -中国保监会0001946和hsa -中国保监会0001946中表达下调不稳定的斑块。据报道,一些DE circRNAs参与动脉粥样硬化疾病很重要。例如,hsa -中国保监会0001946被发现在外周血中,展示一段亲密关系与冠状动脉粥样硬化性心脏病(18]。病例对照研究太阳等人发现的相关性hsa_circ_0001946冠心病独立于其他常见环境危险因素(19]。这些数据表明hsa_circ_0001946血管病理改变的重要作用;然而,行动的机制在很大程度上是未知的,需要进一步探索。hsa_circ_0001946之外,其他DE circRNAs不功能理解,尤其是在动脉粥样硬化及斑块稳定性的进展。然而,我们的发现是令人鼓舞的,但是那些circRNAs特异表达的功能需要进一步的解释。

我们进一步分析了342年的潜在影响对斑块稳定性调节circRNAs术语宿主基因的分析,得出结论,宿主基因的调节circRNAs,在基本的病理过程中,不可缺少的斑块的稳定性。值得注意的是,调节circRNAs的角度丰富大多数生物过程和分子功能是珥高尔基运输囊泡膜,跑GTPase绑定。高尔基体是生物合成的分泌途径的中心,并利用囊泡运输将物质特定的一部分细胞或质膜(20.]。高尔基负责修改新生的极低密度脂蛋白(VLDL)和囊泡运输VLDL的低密度脂蛋白(LDL)的前体,等离子体膜(21]。高浓度的血浆低密度脂蛋白胆固醇的重要风险因素之一,加速动脉粥样硬化的进展。高尔基体小泡运输在胆固醇流出过程中发挥作用,由细胞和细胞的出口过剩胆固醇,高尔基体小泡运输质膜增加双重的(22]。在密集的低密度脂蛋白胆固醇分数影响颈动脉斑块的细胞成分(23),低密度脂蛋白胆固醇低伴随着发病率显著降低斑块破裂的24]。另一个丰富词跑GTPase绑定,是一个贡献者GTPase激活。激活GTPase通常参与动脉粥样硬化的病理过程25,26]。因此,我们推断出circRNAs可能参与控制斑块稳定性影响胆固醇流出和GTPase激活。

空斑形成的机制和不稳定是一个复杂的过程,涉及多个代谢和信号通路27]。我们进一步执行KEGG分析揭示了明显的宿主基因调节circRNA-related KEGG途径,发现这些circRNAs特异表达丰富的蛋白质加工在内质网和上皮细胞信号幽门螺旋杆菌感染。内质网是一种真核生物膜系统,提供了一个场所一些蛋白质和脂质合成处理。蛋白质的功能和功能障碍处理在内质网中扮演重要角色斑块稳定性(28,29日]。幽门螺旋杆菌感染激活多种信号转导途径,促进炎症反应不当,导致病理变化在脂质代谢和上皮细胞增殖,生存和功能(30.]。这些事件联系在一起幽门螺旋杆菌斑块形成和稳定密切相关(31日,32]。总的来说,功能分析去KEGG注释显示调节的重要角色circRNAs调节菌斑动脉壁的稳定性。尽管如此,进一步的研究是必要的来确认那些在不稳定斑块circRNAs特异表达的功能。

尽管有这些发现,这项研究有一些局限性。首先,样本量太小,我们的研究需要进一步确认与一个更大的样本量。此外,特定的角色和确定circRNAs特异表达的机制不稳定斑块的进展应该进一步调查在体外和在活的有机体内。

总之,本研究确定了circRNA表达谱在稳定和不稳定斑块和确定plaque-stability-associated circRNAs特异表达的不稳定的斑块。我们的研究结果提供了一个全面了解circRNAs参与斑块稳定性的颈动脉狭窄并提供一个理论依据circRNAs(如hsa -中国保监会0001523,hsa -中国保监会0008950,hsa -中国保监会0000571,hsa -中国保监会0001946和hsa -中国保监会0000745)作为潜在的目标,以防止或斑块破裂诊断颈动脉狭窄患者在临床的设置。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

附加分

(1)内有344 circRNAs特异表达不稳定的斑块。(2)最重要的是丰富了高尔基体小泡运输条款,在液泡膜和GTPase活化剂。(3)KEGG分析表明DE circRNAs主要是与蛋白质在内质网处理。

信息披露

Xueguang林和邓应是co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了浦东新区临床高原项目(没有纪律。PWYgy2021-03),上海浦东新区的新和跨学科建设健康委员会(没有。PWXx2020-01),特殊的医学创新研究项目上海科委(20 y11909700)和坏心情的影响在颈动脉狭窄患者围手术期脑缺血(没有。KP7202109)。