文摘
萨尔瓦多同系物1 (SAV1),据报道,作为一个肿瘤抑制在不同类型的癌症,是河马通路的关键部件之一。然而,SAV1的表达式和机制的开发和进展胃癌(GC)仍有待阐明。免疫组织化学(包含IHC)进行本研究评估SAV1的表达水平和lysine-specific demethylase 2 b (KDM2B) GC组织。SAV1生物效应的GC细胞增殖,迁移和入侵进行了研究在体外。KDM2B转录调节SAV1表达在一些GC细胞系,和分子实验调查潜在机制。SAV1的表达水平显著降低GC组织和细胞系,消极与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM阶段,积极与患者的总体生存GC。SAV1过度抑制扩散、迁移和入侵GC细胞。进一步的研究显示,KDM2B转录监管SAV1表达式,进一步规范河马信号通路。最后,目前的研究表明,KDM2B转录监管SAV1表达,促进了GC进展。
1。介绍
胃癌(GC)仍然是一个全球普遍的疾病。GC导致∼2018年783000人死亡,使其成为全世界癌症相关死亡的第三大原因。GC的发病率显著增加在亚洲东部,尤其是在日本,韩国,中国1]。在中国,每年GC排名第三的发病原因和死亡原因(2]。大多数患者晚期已经在诊断的时候,和先进的GC的5年生存率是∼5.2%;因此,早期发现GC是至关重要的3]。虽然医疗技术已有所改善,但整体诊断率仍然很低。因此,重要的是要研究的机制,促进GC和识别的开发和发展新靶点来提高治疗效果和预后。
萨尔瓦多适配器蛋白质(干腊肠),其中包含两个模块称为WW蛋白质间交互作用领域,被认为是作为支架蛋白的哺乳动物河马通路(4]。萨尔瓦多同系物1 (SAV1),也被称为WW45,就是人类的相同器官的萨尔瓦多夫妇哺乳动物Ste20-like 1和2激酶(MST1/2)到大型肿瘤抑制激酶1和2 (LATS1/2)形成了河马信号通路(5]。作为一个适配器蛋白质,SAV1 MST1/2激酶作为共激活剂,可以直接绑定到MST1/2和诱导激酶的磷酸化级联通过促进MST 1/2,背阔肌1/2,yes-associated蛋白质(笨蛋),和/或转录coactivation PDZ-binding主题(小胡子)。狂吠的磷酸化和小胡子会导致细胞质易位,泛素化和退化。细胞质易位YAP /小胡子抑制他们的下游目标致癌基因的转录,导致肿瘤抑制(6,7]。SAV1作为一个肿瘤抑制在不同类型的癌症,包括胰腺(8),结肠(9),和肺癌10]。诱发差别SAV1对这些肿瘤发生和转移密切相关,肺癌和胰腺癌的预后不良8,10]。然而,SAV1表达式和函数的作用和机制在GC仍有待澄清。
组蛋白demethylase lysine-specific demethylase 2 b (KDM2B)在许多细胞过程中起作用,包括细胞分化、衰老和干细胞的自我更新。最近透露,KDM2B表达在不同癌症类型增加,作为一个后生监管机构在癌症发展和进展。KDM2B(也称为JHDM1B、Ndy1 FBXL10)调节H3K36me2脱甲基和一系列基因的表达在转录水平。在胰腺导管腺癌(PDAC) KDM2B与KRAS-G12D促进肿瘤发生在小鼠模型11]。我们以前的研究表明,KDM2B PDAC表达增加,促进了PDAC进展通过转录调节暴徒的河马途径激酶活化剂1一个表达式(12]。另一项研究表明,KDM2B调节前列腺癌细胞的细胞粘附和迁移13]。然而,KDM2B的角色和机制在促进GC进展仍有待进一步研究。
本研究调查了角色,表情,SAV1的GC和监管机制。目前的研究显示,增加SAV1表达减少GC的生长和转移。机械的研究表明,KDM2B可以直接绑定到SAV1基因的启动子区域,导致的甲基化H3K27 SAV1转录和表达降低,进一步导致GC进展通过河马信号通路。
2。材料和方法
2.1。人体组织微阵列(tma)和包含IHC
SAV1的蛋白表达和KDM2B测试与人体组织微阵列(tma)都是从上海买超越生物科技公司(中国)。完全,TMA包含100个初级GC组织和80年邻正常胃组织。临床和人口统计信息,包括性别、年龄、TNM分期、分化、和总体生存时间的诊断,是可用的。免疫组织化学分析进行anti-SAV1 (HPA0018085 Sigma-Aldrich,稀释1:100)和anti-KDM2B (SAB2702002 Sigma-Aldrich,稀释1:300)。然后,疣状信号SAV1和KDM2B评估至少两位病理学家对临床信息也不清楚。SAV1——或者KDM2B-positive细胞的百分比分为四组:1 < 2 25%,从25%降至50%,3从50%提高到75%,4是> 75%。SAV1——或者KDM2B-positive细胞的染色强度得分分为四类:0缺席,1是弱渗透,2是温和的渗透,3是强有力的渗透。最后的得分是强度和比例相乘的结果。在统计分析、SAV1的表达和KDM2B进一步分为低SAV1或KDM2B表达式从0到4或高SAV1或KDM2B表达式从6到12。
2.2。细胞系
人类的GC细胞系,即HTB103 SNU-1, AGS和NCI-N87从美国文化集合类型。TMK-1细胞系是来自Masashi Kanai(京都大学、日本京都)和SK-GT5细胞系来自加里·k·施瓦茨(纪念斯隆凯特琳癌症中心,纽约,纽约)。
2.3。质粒和短发卡rna(成分)
的p2xFlag-CMV2 SAV1 (pSAV1)质粒从Addgene(质粒# 18970)14]。全身SAV1被放大和裂解为BamHI-EcoRI片段然后克隆到逆转录病毒表达载体(pBABEpuro)。逆转录病毒的产生和存储为之前报道12]。放大DNA片段的插入和侧翼地区的质粒测序验证了。900个基点片段包含SAV1转录起始位点(tss)放大和subcloned pGL3-basic向量(Promega) (pGL3-SAV1)。引物如下:5′AGC TGG TAC CTC有条件现金援助得到行动CAG标签gg ATC-3′(向前)和5′AGC TAA GCT TTC TTT CGG广汽AGC ATC CTT CT-3′(反向)。成分与目标序列构造SAV1序列1:5′tgc AGA AAT太极拳TGA CTG GCT柠檬酸GGT TT-3′和序列2:5′有条件现金援助GTG AAA答广汽CAC ATT CTG亚美大陆煤层气有限公司TG-3′(4],shRNA序列目标KDM2B被报道之前(14]。
2.4。Dual-Luciferase记者分析
GC细胞cotransfected表示向量或一个控制向量,pGL3-SAV1,β肌动蛋白/ Renilla荧光素酶的记者。在每一组使转染24小时后,我们使用了双荧光素酶检测系统(Promega)测试每组细胞的荧光素酶活性。
2.5。染色质免疫沉淀反应试验
染色质免疫沉淀反应(芯片)分析工具包(微孔技术、Billerica MA)被用来执行芯片分析。根据制造商的协议,2×106肿瘤细胞准备,anti-KDM2B抗体购自微孔(# 09 - 864)。由此产生的DNA样本进行了测试使用定量实时PCR。qPCR的引物如下:5′atc TGC GTC GAG CTT CCC AGA ATT-3′(向前)和5′att有条件现金援助TCT柠檬酸CGT行动太极拳CCT-3′(反向)。在qPCR, 80个基点SAV1启动子区域是放大和分析。
2.6。基因转染
在瞬时转染,GC细胞被镀成six-well或twenty-four-well盘子。Lipofectamine第(表达载体)和Lipofectamine 2000 CD(英杰公司)被用来使转染质粒或成分。48小时后,功能进行了分析。逆转录病毒转导,GC细胞被镀成six-well板24小时,confluency约50%。逆转录病毒和hexadimethrine溴铵的混合物(聚凝胺;5μg / mL)被用来感染GC细胞,和嘌呤霉素浓度为2μg / mL被用来选择稳定的人群。
2.7。实时定量rt - pcr
的RNA表达水平SAV1使用实时定量rt - pcr分析。SYBR绿色试剂ABI棱镜7000 ht序列检测系统(应用生物系统公司)使用。PCR引物的序列如下:SAV1, 5′gca GGG棉酚GTA CGT棉酚GA-3′(向前)和5′gca TTA GGG CTT棉酚TCT GG-3′(反向);β肌动蛋白,5′agc CGG GCT CTT GCC AAT-3′(向前)和5′agt标签公司治理文化CCA亚美大陆煤层气有限公司广汽CA-3′(反向)12]。
2.8。免疫印迹分析
总细胞溶解产物提取。西方墨点法进行使用总细胞溶解产物。主要的抗体在免疫印迹anti-SAV1 (HPA0018085σ),anti-YAP(# 12395,细胞信号技术),anti-KDM2B (SAB2702002σ),anti-pYAP (# 13008, Ser127细胞信号技术),anti-H3K27me3(# 9733,细胞信号技术)和anti-CTGF(# 86641,细胞信号技术)。Anti-actin(兔子;圣克鲁斯生物技术)作为平等protein-sample加载。Anti-mouse免疫球蛋白抗体,免疫球蛋白或anti-rabbit免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术)被用作二次抗体。数量一个分析软件是用来量化乐队(版本4.6;Bio-Rad)。
2.9。集落形成和球体集落形成试验
24-well盘子被播种与从每组二百个细胞。两周的细胞被允许生长的媒介改变了每周两次。两周后,4%多聚甲醛用于修复细胞和0.1%结晶紫溶液用于染色细胞10分钟。显微镜在40 x放大被用来计数殖民地(> 20细胞)。的百分比控制测试的结果。
GC细胞感染pBABE-SAV1 pBABEpuro和维护在DMEM / F12培养基补充bFGF (20 ng / ml)和表皮生长因子(20 ng / ml)和B27补充剂(表达载体),和球状体。所有的实验进行了一式三份,重复两次。
2.10。细胞迁移和入侵
细胞迁移和入侵检测进行了使用改性24-well Boyden钱伯斯是购自BD生物科学和被用来测试GC细胞的迁移和入侵的能力。短暂,细胞从不同群体被视为表示24小时。然后,细胞在DMEM停牌8×10的浓度4/毫升。细胞在500年准备μl DMEM和加载在上井。中含有20%的边后卫,用作化学引诱物刺激下井。的细胞迁移的底部表面过滤与圆)固定和染色。迁移后的细胞,在三个随机选择的字段,在显微镜下计数在200倍的放大。
2.11。统计分析
的表达的相关性SAV1和KDM2B TMA使用斯皮尔曼等级相关系数进行了分析。协变量的意义之间的差异与小动物——一张长有TMA决心X2测试或Fisher精确检验。kaplan meier方法被用来估计系统,和生存率较被用来比较的差异。多变量分析是用来分析独立预后的重要变量。所有的在体外至少进行两次实验,一个代表两个或三个实验的结果提出了类似的结果。的结果的重要性在体外与学生的实验进行了分析学习任务(双尾)或单向方差分析。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。通过SPSS统计分析软件(版本13.0;IBM公司)。
3所示。结果
3.1。SAV1表达式与GC的病理特征直接相关
确定角色的SAV1 GC发病机理,本研究首先分析了SAV1表达式在GC组织包含IHC数组。TMA的临床病理的特点如表所示S1。SAV1-positive细胞质染色主要是观察到的邻近正常胃组织和一些癌症组织GC。SAV1表达式在癌症组织远远低于tumor-adjacent正常胃组织(数字1(一)和1 (b))。减少SAV1表达与肿瘤浸润深度呈正相关(T阶段;表S1),淋巴结转移(N阶段;表S1(表)和TNM阶段S1)。SAV1和古典的预后价值临床病理的特点对病人的生存取决于kaplan meier分析和生存率较。单变量分析表明,SAV1表达与患者的OS GC ( ;图1 (j)和表S3)。单变量分析还表明,年龄( ;图1 (e)和表S3),T阶段( ;图1 (f)和表S3),N阶段( ;图1 (g)和表S3)、TNM分期( ;图1 (h)和表S3),肿瘤分化( ;图1(我)和表S3)与病人相关操作系统。此外,多变量分析表明,年龄( ;表S3)、肿瘤分化( ;表S3)和TNM分期( ;表S3GC)患者生存的独立预后因素。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
本研究进一步评估SAV1表达式通过免疫印迹GC细胞系。SAV1水平明显下降在大多数癌症细胞系(图1 (c))。本研究分析了的mRNA水平SAV1从12配对使用qPCR GC和相邻的正常胃组织。结果表明,SAV1的mRNA水平显著降低GC组织与邻近正常组织相比 ;图1 (d)可能参与差别),这表明SAV1对这些基因GC发病机理。
3.2。GC SAV1抑制细胞增殖、迁移和入侵在体外
调查的生物角色SAV1 GC, AGS和NCI-N87细胞(表达低水平的内源性SAV1)转染或感染SAV1表达向量(AGS / NCI-N87-pSAV1和AGS / NCI-N87-pBABE-SAV1)。空表达向量被用作控制(AGS / NCI-N87-Control和AGS / NCI-N87-pBABEpuro)。感染细胞选择使用嘌呤霉素,发现联合耐药细胞明显升高(图SAV1表达式2(一个))。HTB103细胞(表达高水平的内源性SAV1)与shSAV1-1转染,shSAV1-2和控制向量。SAV1在这些细胞的蛋白质含量测定采用免疫印迹(图2(一个))。免疫印迹显示SAV1水平明显在AGS和NCI-N87细胞。shSAV1-2导致显著降低SAV1而shSAV1-1的表情。因此,shSAV1-2被选为shSAV1为后续实验。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
调查的角色恢复SAV1表达GC细胞增殖,AGS和NCI-N87细胞集落形成试验。如数据所示2(b)和2(c),恢复SAV1表达显著抑制在AGS细胞集落形成,但在HTB103 SAV1击倒提升集落形成细胞。此外,SAV1在GC细胞球体形成评估。恢复SAV1表达显著降低球体的数量和大小在第一和第二代AGS和NCI-N87细胞(数字2 (d)和2 (e))。这些结果揭示了在GC SAV1细胞增殖的抑制作用。
进一步评估的影响恢复SAV1表情GC细胞的迁移和入侵,AGS和HTB103细胞转染pSAV1或shSAV1,分别。同样,恢复SAV1表达抑制AGS细胞的迁移和入侵,但SAV1击倒提升HTB103细胞的迁移和入侵(数字3(一个)和3 (b))。总的来说,这些数据表明,SAV1作为肿瘤抑制通过抑制增殖,迁移和入侵GC细胞。
(一)
(b)
3.3。KDM2B转录抑制SAV1表达式
SAV1表达式是调制PDAC[甲基化8]。然而,在GC SAV1表达降低的机理还没有被证明。TSS Tzatsos等人报道,KDM2B结合,导致H3K27me2减少和抑制一系列基因的表达参与开发(11]。然后本研究评估是否KDM2B监管SAV1表达式。KDM2B shKDM2B-1撞倒了,shKDM2B-2 AGS和NCI-N87细胞。shKDM2B-1和shKDM2B-2能有效地打倒KDM2B shKDM2B-2显示更有效击倒(图4(一))。shKDM2B-2当时用作shKDM2B在后续实验。免疫印迹显示KDM2B击倒导致减少H3K27me3水平(图4(一))。此外,KDM2B击倒SAV1信使rna和蛋白质含量增加(数据4(一)和4 (b))。芯片显示KDM2B直接绑定到TSS地区SAV1 AGS细胞(数字4 (c))。SAV1子记者(pLuc-SAV1)生成,含有TSS的周围的基地。荧光素酶的测定结果表明,KDM2B击倒SAV1启动子的转录活性显著升高引起的记者(图4 (d))。上述数据表明,SAV1 KDM2B的直接下游目标,KDM2B转录监管SAV1表达式。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
SAV1的核心组件是河马信号通路,抑制致癌转录模块,YAP函数作为转录辅活化因子,促进GC进展(6,7]。KDM2B击倒导致SAV1的蛋白质含量增加,YAP磷酸化和蛋白质含量下降YAP及其典型的下游目标CTGF(图4 (e))。这些结果表明,通过转录调节SAV1 KDM2B监管河马通路。
3.4。KDM2B表达式与GC与SAV1呈负相关的病理特征
本研究提供的证据表明,KDM2B转录抑制SAV1表达式。进一步确认结果,蛋白质含量的KDM2B串行GC使用包含IHC组织一系列SAV1进行了分析。KDM2B主要是积极核染色的癌组织和癌组织中高度表达的比在tumor-adjacent正常胃组织(数字5(一个)和5 (b))。此外,KDM2B表达呈正相关T阶段( ;表S2),淋巴结转移( ;表S2),和更高的TNM阶段( ;表S2)。KDM2B表情GC病人的预后价值生存测试使用kaplan meier分析和log-rank测试。单变量分析表明,KDM2B消极与操作系统相关的患者GC ( ;图5 (c)和表S3)。然而,多变量分析表明,GC KDM2B不是一个独立的预后因子( ;表S3)。本研究进一步分析了相关性SAV1和KDM2B表达式在同一队列。如数据所示5 (d)和5 (e)SAV1之间的直接负相关,KDM2B表达式被发现在GC组织(r=−0.535; )。这些数据进一步证实KDM2B SAV1负监管机构。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
SAV1是河马的关键组件之一的信号通路和作为共激活剂MST1/2激酶通过直接绑定到MST 1/2和促进磷酸化的MST 1/2, LATS1/2,狂吠,小胡子。据报道,河马信号通路发挥重要作用在癌症的发展和发展,被认为是一个潜在的治疗目标15]。因此,SAV1癌症的角色已经得到了越来越多的关注。据报道,SAV1压抑的结肠直肠癌和胰腺癌的生长(9]。在胶质母细胞瘤,压抑SAV1表达促进了胶质母细胞瘤细胞的干细胞表型(16]。在另一项研究中,删除PTEN和SAV1肝癌小鼠的肝脏促进了发展(17]。此外,SAV1中发挥着重要作用的化学敏感性卵巢癌细胞对顺铂(18]。然而,在GC SAV1的角色还没有被确认。本研究四行提供的证据证明在GC干腊肠的肿瘤抑制作用。首先,目前的结果表明,SAV1表达减少GC细胞系和组织。第二,SAV1表达消极与肿瘤浸润深度有关,淋巴结转移、TNM分期和患者的生存。第三,恢复表达SAV1抑制增殖和细胞球体GC的形成在体外。此外,SAV1击倒提升集落形成和细胞球体GC细胞的形成。第四,SAV1 GC过度抑制细胞迁移和入侵在体外,但SAV1击倒促进了GC的迁移和入侵细胞。总的来说,这些发现表明,SAV1抑制增殖、迁移,细胞入侵GC和GC中也充当一个肿瘤抑制。SAV1表达减少报道是不同类型的癌症,包括结肠癌、肺癌、肾细胞、肝脏和胰脏癌(8,9,19- - - - - -21]。据报道,微rna (microRNA) -21年,microRNA - 181 c, mir - 149 - 5 - p, microRNA - 130 b,长非编码热空气,基因启动子区域的甲基化调制SAV1[的表达8,9,16,18,22,23]。在另一项研究中,MST2被发现与SAV1 coexpressed,磷酸化SAV1 Thr-26, Ser-27, Ser-36,和ser - 269,并加速细胞死亡24]。然而,抑制SAV1表达式的机制需要进一步研究。在胰腺癌的一项研究显示,KDM2B绑定到TSS, H3K27me3的水平下降,和管理的一系列基因的表达,和ChIP-sequencing结果表明SAV1 KDM2B[的潜在目标基因之一11]。本研究进一步确定KDM2B调制SAV1表达式。结果表明,KDM2B击倒SAV1信使rna和蛋白质含量的增加、芯片和荧光素酶化验显示KDM2B直接绑定到SAV1 TSS地区和监管SAV1 GC细胞表达在转录水平。KDM2B的蛋白质含量和SAV1在串行GC组织数组使用包含IHC进行分析。结果表明,KDM2B表达式与SAV1直接负相关。这些数据表明,SAV1直接下游KDM2B的目标。
SAV1的核心组件是河马通路,抑制致癌转录模块(YAP) [7]。失去SAV1诱导STAT3阻力指标纤维化(也许可以激活和促进25]。在肺癌,SAV1可以绑定到锌指蛋白Gli1和负调控刺猬信号通路19]。YAP表达增加GC,河马信号通路中起关键作用的GC开发和进展(6]。因此,本研究进一步分析了影响KDM2B河马信号通路在GC。结果表明,KDM2B击倒导致SAV1蛋白质含量的增加和狂吠和减少蛋白质的磷酸化水平的总YAP及其下游典型目标CTGF。这些数据表明,通过SAV1 KDM2B监管河马通路。然而,是否通过SAV1 KDM2B进一步调节其他信号通路可能在未来进一步研究。
总之,目前的研究提供了临床和机械的证据,确定监管KDM2B SAV1表达在转录水平和提升GC进展。本研究不仅确定KDM2B监管SAV1表达但还发现了一个有前途的分子目标为GC新的治疗策略。
数据可用性
所有生成的数据或分析在本研究中包括这篇文章。
伦理批准
人体组织实验是由上海东方医院伦理委员会批准。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
李宁和Haifei歌同样导致了这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金委明全(81972280),上海自然科学基金(19 zr1441800明全),学术带头人培训项目的上海浦东新区卫生局(PWRd2022−02明全),和顶级临床学科项目的上海浦东(PWYgf2021−07)。
补充材料
补充1。补充表1。补充2。临床病理特征之间的相关性和SAV1表达式(n= 100)。补充3。减少SAV1表达与肿瘤浸润深度呈正相关(T阶段),淋巴结转移(N阶段),TNM阶段。补充4。补充表2。补充5。临床病理特征之间的相关性和KDM2B表达式(n= 100)。补充6。KDM2B表达呈正相关T阶段、淋巴结转移、TNM分期越高。补充7。补充表3。补充8。总结kaplan meier和多变量Cox回归分析的总体生存时间PADC组织。补充9。的预后价值SAV1 / KDM2B和古典临床病理的特点对病人的生存取决于kaplan meier分析和生存率较。单变量分析表明,SAV1表达呈正相关的操作系统患者GC, KDM2B表达与操作系统相关的负面的GC患者。多变量分析表明,年龄、肿瘤分化和TNM分期是GC患者生存的独立预后因素。(补充材料)