文摘

客观的。哮喘是定义为一个异构的疾病,通常是慢性气道炎症的特征。长非编码rna扮演了一个重要的角色在不同的生物过程包括炎症。了解lncRNAs和哮喘之间的关系,我们试图LINC00847的角色在外周血单核细胞(PBMCs)的儿童患有哮喘恶化或哮喘缓解期。方法。微阵列分析GSE143192和GSE165934数据集筛选差异表达lncRNAs (DElncRNAs)在人类之间PBMCs哮喘患者和正常对照组。LINC00847被选中的人类PBMCs DElncRNAs哮喘患者和正常对照组之间进一步调查。LINC00847被量化的表达水平PBMCs收集来自54个儿童哮喘恶化,54岁的儿童哮喘缓解期,并通过实时qPCR 54岁健康儿童。第一第二的用力呼气量预测百分比值(FEV1%)在1秒用力呼气量占用力肺活量(FEV1 / FVC)和呼气流速峰值(PEF %)为评估肺功能测试。免疫球蛋白E浓度(IgE)和嗜酸性粒细胞计数检查。interleukin-4的血清水平(il - 4)、干扰素-γ(IFN -γ),IL-17A ELISA测定的方法。结果。PBMCs LINC00847的表达水平显著高于儿童哮喘恶化PBMCs哮喘缓解儿童和健康儿童( );LINC00847的表达水平PBMCs哮喘缓解期的孩子明显高于PBMCs健康儿童( )。皮尔森相关分析显示,在PBMCs LINC00847哮喘儿童的表达水平与FEV1%负相关(r=−0.489)、FEV1 / FVC的(r=−0.436)、PEF % (r=−0.626)和干扰素-γ级别(r哮喘儿童=−0.614),但与免疫球蛋白e浓度呈正相关(r= 0.680)、嗜酸性粒细胞计数(r= 0.780),il - 4 (r= 0.524)和IL-17A (r= 0.622)的水平。当LINC00847表达式是用来区分从哮喘缓解期哮喘恶化,AUC 0.871(95%置信区间:0.805—-0.936)敏感性为79.63%,特异性为77.78%。结论。研究表明,增加LINC00847表达可能与哮喘的开发和发展,可能作为一种新的生物标志物预测从哮喘缓解期哮喘恶化。

1。介绍

哮喘是一种慢性呼吸道疾病,引起呼吸困难气道高反应性和炎症。它的特点是突发性的,可逆气喘,胸闷、气短、咳嗽,影响各个年龄层的人(1]。哮喘是一种常见的儿童疾病。哮喘的发病率和发病率密切相关时间的延长。在2016年,9.6%的第5 - 11岁的儿童和10.5%的12 - 17岁的孩子被报道患有哮喘(2]。学龄前儿童哮喘是容易恶化,但伤害是相对有限,而年龄较大的儿童和青少年有更多的疾病主要是由损伤引起的(3]。哮喘是通常在儿童早期发现。据报道,哮喘病患者与气喘等症状在出生后的第一个6年高达50%,年末,大约40%的儿童仍然气喘儿童(4]。事实上,喘息和咳嗽并不确定哮喘的主要方法。孩子没有哮喘,尤其是对0 - 2岁儿童,也有这些症状由于呼吸道感染(5]。各种因素,包括疾病史、家族史、呼吸道症状、肺量测定法,和血清测试,如免疫球蛋白E (IgE)水平和血液嗜酸性粒细胞,应该使用哮喘的诊断标准(6]。标准治疗已经成功地应用于大多数哮喘儿童,但相当数量的孩子有其他严重疾病和对这种治疗7]。超过10年的研究儿童哮喘的发展表明,0.5%的儿童有严重的哮喘10岁,和整体严重哮喘患病率为4.5% (8]。根据严重程度和临床表现、哮喘可分为哮喘恶化或哮喘缓解期。哮喘恶化的特点是咳嗽、运动不耐受,和反复发作的呼吸努力增加休息,表示条件的恶化,交替着出现临床症状的缓解(9]。患有严重哮喘的儿童更可能与毒品有关的副作用,危及生命的恶化,和生活质量受损10,11]。哮喘是一种免疫相关疾病。与成人哮喘相比,患有严重哮喘的儿童嗜酸性粒细胞数明显高于,过敏原致敏,IgE水平(12]。此外,一项研究证明,高水平的interleukin-4 (il - 4)和interleukin-17 (IL-17)和干扰素-水平下降γ(IFN -γ)与过敏性哮喘的发病机理有关13]。

哮喘的患病率与遗传和环境因素有关(14,15]。许多研究报道,小分子核糖核酸(microrna)和长非编码rna (lncRNAs)参与多种生物学过程(16,17]。LncRNAs microrna海绵,抑制目标通过绑定到特定的microrna microrna的函数,以调节下游靶基因的表达(18]。lncRNAs被广泛的功能显示在许多疾病,如冠状动脉疾病(19],乳腺癌[20.),和神经系统疾病21]。一些研究肺癌、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺结核、和间质性肺疾病证明lncRNAs取得了进展在呼吸道疾病的发病机制22- - - - - -24]。

近年来,超表达的新发现lncRNAs LINC00847与癌症的发生有关25,26]。然而,功能和表达LINC00847哮喘的发展已经很少报道。本研究有助于证明LINC00847是一个高度表达lncRNA在儿童哮喘临床和探索LINC00847和肺功能之间的相关性,以及免疫力。

2。材料和方法

2.1。微阵列数据集和微分表达式分析做准备

我们下载GSE143192(提交日期:2020年1月6日;最后更新日期:2021年7月31日)和GSE165934(提交日期:2021年2月1日)从基因表达综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)。生成GSE143192 GPL22120平台,包含外周血单核细胞(PBMCs) 4哮喘患者和健康对照组。生成GSE165934 GPL23126平台上,包括PBMCs从10支气管哮喘患者和健康对照组。差异表达lncRNAs (DElncRNAs)在人类PBMCs哮喘患者和正常对照组之间通过分析原始数据排序GSE143192和使用affy GSE165934 limma包从R / Bioconductor软件日志(FC) | |褶皱变化≥1.2和调整 截止值小于0.05。维恩相交函数是用来描述重叠lncRNAs GSE143192和GSE165934数据集之间的微分表达式后分析。

2.2。研究对象

这项研究包括54儿童哮喘恶化和54名儿童哮喘缓解期住进我们医院2019年6月到2021年6月,它们实现了两个入选标准:诊断哮喘恶化或哮喘缓解期根据指南诊断、预防和治疗儿童支气管哮喘的(2016)和年龄从5到14年。人呼吸道感染和全身感染、免疫抑制药物用于最近的一个月,是复杂与过敏性鼻炎或湿疹、哮喘家族史,或经历了手术被排除在研究之外。54名儿童患有哮喘恶化,有28岁男性儿童和26个女性儿童,7.63±2.29岁。54岁儿童哮喘缓解期,30岁男性儿童和24女性孩子,7.39±2.11岁。正常对照组是那些被确认为健康的儿童身体检查在我们医院2019年6月到2021年6月,由30个男性儿童和24女性儿童,7.50±2.16岁。孩子们在三组年龄和准确性。书面知情同意之前病人或其法定监护人提供的数据收集。这项研究是我们医院伦理委员会批准。

2.3。肺功能测试

MS-IOS肺功能测试进行的数字仪表(Erich Jager AG)、维尔茨堡、德国),包括在第一第二的用力呼气量预测百分比值(FEV1%)在1秒用力呼气量占用力肺活量(FEV1 / FVC)和呼气流速峰值(PEF %)。

2.4。血液样本集合

空腹静脉血(4毫升)收集在早上哮喘儿童和健康的孩子。每个血液样本的一部分放入1200 r / m离心管,并进行了15分钟的4°C。血清是孤立和储存在−80°C。另一部分的血液样本被放置到EDTA-contained管。PBMCs孤立使用聚蔗糖密度梯度离心法和存储在−80°C。

2.5。酶联免疫吸附试验

IgE的浓度是IMMAGE800自动检测到的特定蛋白分析仪(美国贝克曼库尔特)。嗜酸性粒细胞计数检查了LH500血液学分析仪(贝克曼库尔特)。血清il - 4水平,干扰素-γ,IL-17A ELISA方法测定使用商用设备(英国Abcam)。

2.6。RNA提取和实时qPCR (RT-qPCR)

总RNA提取的意思是PBMCs试剂盒(美国表达载体)和合格的NanoDrop 2000 c分光光度计(美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)。PrimeScript RT试剂盒(豆类,大连,中国)是用于生成cDNA从提取的总RNA。合成cDNA放大在ABI7500实时PCR仪器使用SYBR(美国应用生物系统公司)®预混料交货Taq™II (RNaseH + Tli)工具包(豆类)。反应系统由2μL cDNA、10μL实时掌握混合,和每个1正向和反向引物μL,补充了RNAase-free DEPC。qPCR反应是根据以下循环条件:95°C 10分钟紧随其后40周期为15秒95°C, 1分钟60°C, 72°C 30年代。引物序列如下:LINC00847-forward (5′-AACGCTGCCTCTGTGGAAGTCTC-3′)和反向(5′-CGCTCTGCTCTCCCGCCATC-3′);GAPDH-forward (5′-TATAAATTGAGCCCGCAGCC-3′)和反向(5′-TACGACCAAATCCGTTGACTC-3′)。LINC00847的表达水平提出了相关褶皱变化GAPDH基于2−∆∆Ct方法。

2.7。统计分析

在这项研究中包括枚举数据和测量数据。枚举数据计算了频率分析,两组由卡方检验进行比较。提出了测量数据均值±标准差和未配对的测试或分析的方差分析/事后。之间的关系表达LINC00847、FEV1% FEV1 / FVC, PEF %, IgE,嗜酸性粒细胞计数,il - 4,干扰素γ皮尔森相关分析,IL-17A进行评估。的接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)被用作衡量工作表现的表达LINC00847预测从哮喘缓解期哮喘恶化。统计上显著的差异反映的价值 。

3所示。结果

3.1。识别在PBMCs DElncRNAs哮喘和正常儿童

GSE143192微分表达式分析数据集后,共有1631 lncRNAs实现日志| FC |≥1.2和调整 和突出在PBMCs DElncRNAs哮喘和正常儿童,其中包括863调节DElncRNAs和768年下调DElncRNAs(图1(一))。GSE165934微分表达式分析数据集后,共有13434个基因实现日志| FC |≥1.2和调整 和突出差异表达基因在PBMCs哮喘和正常儿童,其中包括7130调节DElncRNAs和6304下调DElncRNAs(图1 (b))。维恩相交函数是用来描述重叠lncRNAs DElncRNAs 1631年和13434年之间差异表达基因。发现常见的52个表达下调DElncRNAs和37调节DElncRNAs站(图1 (c))。因此,我们选择LINC00847作进一步调查。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
识别在PBMCs DElncRNAs哮喘和正常儿童。(a)火山情节显示共有1631 DElncRNAs在哮喘和正常儿童之间PBMCs GSE143192微分表达式分析数据集。(b)火山情节显示共有13434个差异表达基因在哮喘和正常儿童之间PBMCs GSE165934微分表达式分析数据集。(c)维恩图显示重叠的52个表达下调DElncRNAs和37调节之间的PBMCs DElncRNAs哮喘和正常儿童通过分析GSE143192和GSE165934数据集。
3.2。的表达水平增加LINC00847 PBMCs哮喘的孩子

的表达水平LINC00847 PBMCs哮喘恶化的孩子,健康儿童哮喘缓解期的孩子,由RT-qPCR决定。LINC00847的表达水平是4.48±0.99,2.36±0.51,1.43±0.23 PBMCs哮喘恶化的孩子,哮喘缓解期的孩子,和健康的孩子。发现的表达水平LINC00847 PBMCs哮喘恶化的儿童明显高于PBMCs哮喘缓解儿童和健康儿童( );LINC00847的表达水平PBMCs哮喘缓解期的孩子明显高于PBMCs健康儿童( ,图2)。


图2
表达水平的LINC00847 PBMCs哮喘恶化的孩子,哮喘缓解期的孩子,健康的孩子。
3.3。LINC00847的表达水平与哮喘儿童肺功能有关

FEV1%、FEV1 / FVC和肺功能PEF %进行评估来反映哮喘恶化的孩子,哮喘缓解期的孩子,和健康的孩子。下表1、FEV1% FEV1 / FVC, PEF %哮喘恶化孩子们低于哮喘缓解儿童和健康儿童( );FEV1%、FEV1 / FVC和PEF %哮喘缓解儿童低于健康儿童( )。由皮尔森相关分析显示的表达水平LINC00847 PBMCs哮喘的孩子们与FEV1%负相关,FEV1 / FVC, PEF %的哮喘儿童(图3)。

表1
FEV1%、FEV1 / FVC和PEF %哮喘恶化的孩子,哮喘缓解期的孩子,和健康的孩子。

图3
皮尔森相关分析LINC00847的表达水平与哮喘儿童的肺功能。
3.4。LINC00847的表达水平与哮喘儿童的免疫功能有关

哮喘儿童和健康儿童的免疫功能是通过检测评估IgE浓度、嗜酸性粒细胞计数,il - 4, IL-17A。儿童哮喘恶化表现出更高的免疫球蛋白e浓度,嗜酸性粒细胞计数,il - 4, IL-17A水平比儿童和健康的儿童哮喘缓解期( );儿童哮喘缓解期免疫球蛋白e浓度较高,嗜酸性粒细胞计数,il - 4, IL-17A水平比健康儿童( ,表2)。干扰素-更低的水平γ指出在哮喘恶化的孩子比儿童和健康的儿童哮喘缓解期( );儿童哮喘缓解期干扰素-显示一个较低的水平γ比健康儿童( )。皮尔森相关分析后,据透露,在PBMCs LINC00847哮喘儿童的表达水平与免疫球蛋白e浓度呈正相关,嗜酸性粒细胞计数,il - 4,和IL-17A水平,但与干扰素-负相关γ哮喘儿童(图4)。

表2
嗜酸性粒细胞计数,免疫球蛋白e浓度il - 4,干扰素-γ,IL-17A哮喘恶化的孩子哮喘缓解期的孩子,和健康的孩子。

图4
皮尔森相关分析与免疫球蛋白e浓度LINC00847的表达水平,嗜酸性粒细胞计数,il - 4,干扰素γ,IL-17A哮喘的孩子。
3.5。预测从哮喘缓解期哮喘恶化LINC00847表达式

LINC00847 AUC是用作衡量工作表现的表达式在预测从哮喘缓解期哮喘恶化。如图5,当LINC00847表达式是用来区分从哮喘缓解期哮喘恶化,AUC 0.871(95%置信区间:0.805—-0.936)敏感性为79.63%,特异性为77.78%。


图5
LINC00847表达式的AUC作为衡量工作表现的预测从哮喘缓解期哮喘恶化。

4所示。讨论

哮喘是一种复杂的异构儿童中发病率高的疾病。研究全球儿童哮喘症状的发生率和严重程度表明,严重哮喘的发生在亚太地区,北部和东部欧洲和北美是3.8%和11.3%,分别为(27]。低到中等剂量吸入激素的95%已成功用于治疗哮喘的孩子;然而,这样的治疗无效的近45%的哮喘患儿有时,他们经历过至少一次控制不佳的哮喘发作(28,29日]。严重哮喘不仅强加了一个严重的医疗负担,也给孩子带来的不良后果,包括与毒品有关的副作用,降低生活质量,甚至危及生命的恶化造成的可怜的控制(30.,31日]。哮喘是由一系列基因和环境因素之间的相互作用。大量证据证明lncRNAs参与免疫反应,炎症和免疫相关疾病如哮喘的进展(16,32]。

在这项研究中,我们收集的数据微分表达式lncRNAs人类外周血单核细胞(PBMCs)哮喘患者和健康组之间使用基因数据库平台和确定小说的微分表达式lncRNAs LINC00847哮喘病人。为了进一步分析儿童LINC00847和哮喘之间的关系,儿童哮喘恶化、儿童哮喘缓解期,健康的儿童被选为本研究的主题。LINC00847是一种新发现的lncRNA位于5 q35.3,显示组织表达模式(33]。越来越多的研究证实,改变lncRNA LINC00847表达影响癌症的进展,可能是作为一个潜在的细胞凋亡生物标志物在肾细胞癌25),肝细胞癌(34],nonsmall细胞肺癌(26]。本研究确定LINC00847表达RT-qPCR PBMCs所有学习的孩子。结果显示,高表达LINC00847被发现在儿童哮喘恶化哮喘缓解儿童和健康的孩子。表达LINC00847增加哮喘的严重程度。这些发现是类似于另一个温等人的研究发现调节三项lncRNAs的表达,包括LINC00847 MIR22HG,和LNC_00027 microcystin-LR-mediated肝损伤(35]。

哮喘是一种慢性呼吸道疾病。肺功能的测量是非常重要的评估哮喘患者的肺损伤。FEV1%测量是一种常见的方法来评估哮喘和慢性阻塞性肺疾病(36]。呼气流量主要是由腹部肌肉活动,最大限度地减少感染的风险由肺部排出异物(37]。目前的研究发现,儿童哮喘恶化的价值低得多FEV1%, FEV1 / FVC, PEF %相比,哮喘缓解儿童和健康的孩子。这些测量的水平是最高的健康儿童。这个结果是间接证实了研究气道疾病,展示与生理盐水雾化有助于改善残,FVC,及PEF儿童有轻度呼吸道疾病(38]。不足和过度免疫反应的基础是各种各样的疾病,如严重的感染,转移性恶性肿瘤,和哮喘39]。观察到,在这项研究中,免疫球蛋白e浓度更高,嗜酸性粒细胞计数,il - 4,和IL-17A水平揭示哮喘恶化的孩子比其余的孩子;更重要的是,这些水平增加哮喘的严重程度。剩下的孩子相比,哮喘恶化孩子显示低水平的干扰素-γ。干扰素的最高水平γ是表示健康的儿童。服部年宏等人指出持续表达干扰素-γ全身的免疫改变和改善小鼠过敏性皮肤炎(40]。伊尔在炎症的发病机制中扮演着不可或缺的角色。甘地等人探讨分泌的促炎细胞因子和抗炎细胞因子il - 4 IL-17,气道炎症的生物标志物可能控制哮喘症状(41]。报告严重嗜酸性哮喘表明,嗜酸性粒细胞计数,而不是增加血清免疫球蛋白e浓度升高增加了病人的恶化风险(42]。结果有点不同于我们的分析,由于不同类型的哮喘和病人的年龄。Mummadi等人发现变化影响的IgE浓度严重哮喘患者治疗剂量;因此,重复血清IgE决定为特定的病人是必要的(43]。

本研究进行皮尔逊相关分析找出LINC00847之间的相关性和肺功能和免疫功能。分析FEV1%指示值,FEV1 / FVC, PEF % LINC00847的表达呈负相关。此外,LINC00847表达呈正相关,血清免疫球蛋白e浓度、嗜酸性粒细胞计数,il - 4,和IL-17A水平,但与干扰素-负相关γ的水平。本研究证实LINC00847表达式的作用在预测哮喘缓解期通过AUC哮喘恶化。这些发现表明,LINC00847参与哮喘的发生,影响免疫反应的规定,气道炎症等病理过程与哮喘有关。

总之,lncRNAs LINC00847参与儿童哮喘的发生和发展,调节细胞间的沟通和密切相关免疫,炎症反应和细胞凋亡。这是一个新的分子观察治疗儿童哮喘。在不久的将来,之间的交互lncRNAs LINC00847和microrna在哮喘可以进一步分析确定目标基因在儿童哮喘的具体机制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

嘉荫胡锦涛和Zhike王本研究同样起到了推波助澜的作用。