文摘
原发性醛固酮增多症是最常见的继发性高血压,和aldosteronoma占很大一部分的原发性醛固酮增多症病例。醛固酮增多症相关的腺瘤Aldosteronoma也被称为(APA)。尽管有许多研究关于APA,这种疾病的发病机制尚未完全清楚。在这项研究中,我们旨在找出APA之间的基因表达模式的差异和非功能性肾上腺皮质腺瘤(NFAA)使用加权coexpression网络(WGCNA)和基因差异表达基因(度)分析;只有达到相应标准的基因的两种方法被定义为真正的中心基因然后用于进一步分析。29真正中心基因被发现,其中大多数是富含磷脂的代谢过程。WISP2,S100A10,SSTR5-AS1,SLC29A1,APOC1,SLITRK4是真正六中心基因相同的基因表达模式之间的结合和验证数据集,其中三个间接或直接参与脂类代谢包括WISP2,S100A10,APOC1。根据度的基因表达模式,我们推测与APA的潜在治疗价值五个候选药物,其中一个是环己酰亚胺,磷脂生物合成的抑制剂。所有的证据表明磷脂代谢可能是一个重要的病理生理机制。我们的研究提供了一个新的视角关于APA的病理生理机制,并提供了一些小分子,可能是对APA有效药物。
1。介绍
原发性醛固酮增多症(PA)是现在被广泛公认为高血压的常见病原体情况下,特别是对于难治性高血压(1]。原发性高血压相比,爸爸会增加心血管疾病的风险,如中风、冠心病、心房纤颤、心脏衰竭(2]。目前公认的流行率的PA是高血压患者中5 - 10%,但实际的患病率可能目前应该率(3 - 5倍3]。PA主要是由醛固酮增多症相关的腺瘤(APA) (4),一个过度分泌醛固酮的肾上腺肿瘤,导致高血压和血钾过高。某些肾上腺皮质腺瘤,称为非功能性肾上腺皮质腺瘤(NFAA),不分泌激素,只是表现为一个小肿块上杆的肾脏。在日本全国多中心研究显示,50.8%的总肾上腺位NFAA,而只有5.1%是APA (5]。本研究旨在找出之间的基因表达模式的差异这些状态可以让我们进一步了解APA的发病机理。先前的研究已经确定了钾通道基因的体细胞突变KCNJ5和钙通道基因CACNA1D,这有助于在肾上腺醛固酮生产和细胞增殖球状带(6,7]。我们的研究主要集中在基因表达水平的APA和NFAA。已经承认的单边形式的PA可以治疗肾上腺切除术,而两国可以治疗疾病只基于盐皮质激素受体拮抗剂的药物治疗(8]。由于肾上腺切除术是不适合双边APA和盐皮质激素受体拮抗剂与各种sex-steroid-related副作用,主要是乳房胀痛,月经异常,性欲减退,阳痿,尤其是在高剂量使用,开发新的药物治疗APA是必要的(9]。根据一项最新的研究中,盐皮质激素受体拮抗剂可能降低利率的积极筛查原发性醛固酮增多症(10]。在这项研究中,我们会发现一些替代药物治疗APA根据其基因表达模式。因此,研究差异表达模式APA的患者和那些NFAA可以提高我们对这种疾病的发病机制的理解,为APA的治疗提供新的线索。研究工作流图所示1。
2。材料和方法
2.1。微阵列数据信息和数据预处理
原始微阵列数据(GSE33371、GSE28476 GSE10927) Affymetrix平台(GPL570)从GEO数据库下载(11- - - - - -13]。28肾上腺皮质腺瘤样本GSE33371和GSE28476整体作为一个联合数据集进行进一步的分析,包括APA的10个样本,12个样本cortisol-producing肾上腺皮质腺瘤(CPA),和6 NFAA样品。十三肾上腺皮质腺瘤样本GSE10927被用作验证数据集。所有分析R软件(版本4.0.0)。探针集注释使用getGEO GEOquery包的函数。差异基因表达分析和加权之前基因coexpression网络分析(WGCNA),探测器匹配多个基因被删除,和多个探测器匹配一个基因被用于计算平均表达式的值。
2.2。的识别度
联合和验证数据集进行了基因的差异表达分析(度)。健壮的Multiarray平均算法被用来正常化的原始数据(14]。上海广电包的战斗功能用于消除一批影响GSE33371和GSE28476[之间15]。主成分分析(PCA)是用于显示注册会计师之间的基因表达模式,APA, NFAA合并后的数据集。度分析进行APA与NFAA使用limma包和经验贝叶斯方法,这些基因与调整值< 0.05和| log2(褶皱变化)|≥1被定义为显著度。P值调整使用Benjamini-Hochberg错误发现率(罗斯福)。
2.3。WGCNA网络建设
合并后的数据集用于WGCNA网络建设。coexpression网络建成使用“WGCNA”,为加权相关网络分析(R包16]。软阈值功率计算使用pickSoftThreshold WGCNA包的函数。产生一个无标度网络中,我们使用一个β值= 6。一步网络施工方法被用来确定coexpression模块使用blockwiseModules函数。plotDendroAndColors WGCNA的函数包用于可视化coexpression模块。
2.4。Module-Clinical特征关系的建设
coexpression模块被确定后,模块eigengene(我)使用的第一主成分计算基因表达水平在相应的模块。Module-clinical特征之间的关系进行评估使用相关性MEs和有趣的临床特征包括APA,会计师,NFAA,肾上腺皮质腺瘤β连环蛋白突变和野生型肾上腺皮质腺瘤。模块成员(毫米)和基因的意义(GS)的两个重要指标用于确定一个基因是否每个模块的关键。基因与| |毫米≥0.8和| GS |≥0.2对应模块的基因被定义为中心。布朗模块包含与APA中心相关系数最高的基因,而谭模块包含中心基因与APA(图相关系数最低的2 (c))。
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2.5。基因的鉴定和功能富集分析真正的中心
真正的基因被定义为中心的共同度之间的基因数据集相结合,中心布朗模块和中心的基因基因的谭模块。真正的中心基因整合网络构造使用Cytoscape(3.8.0版)(17在WGCNA],基于他们的相互关系网络。进行功能富集分析真正的中心基因使用clusterProfiler包和Metascape数据库(18]。铀浓缩项目和调整值< 0.05被认为是具有统计学意义。
2.6。基因集富集分析(GSEA)
我们使用GSEA,以知识为基础的方法来解释全基因组表达谱,分析基因表达模式的联合数据集19]。两组进行:APA和NFAA。只有基因本体论(去)或《京都议定书》全书的基因和基因组注释(KEGG)名义 被用于进一步分析。
2.7。验证使用其他数据集
十三肾上腺皮质腺瘤样本GSE10927被用作验证数据集。这些样品,6个表现出高醛甾酮症,剩下的七个表现为肾上腺群众,没有高醛甾酮症或库欣综合症。真正的中心基因的表达模式验证数据集也发现使用度分析。当度进行分析验证,样品表现出高醛甾酮症被定义为APA组和样品表现为肾上腺群众被定义为NFAA组。真正的中心基因的表达模式验证数据集比较与合并后的数据集来确定基因表达模式在两个相同的数据集。结果提出了视觉使用GraphPad棱镜8软件。
2.8。识别潜在的候选药物的治疗
假定的小分子药物利用连通性预测地图构建02(城市规划机构(CMap)版本https://portals.broadinstitute.org/cmap/),从培养的人类细胞基因表达谱数据库,文件处理生物活性小分子,可以用来发现疾病之间的联系与特定基因表达模式和小分子药物可以抵消的疾病基因表达水平(20.]。度的组合数据集被用来查询数据库提出。浓缩分数代表了相似(从−1 - 1)基因表达模式的APA和培养的人类细胞之间用相应的药物治疗,药物诱导类似的基因表达模式与APA将得到一个积极的得分,而药物产生相反的模式将得到一个负面得分。因此,药物与消极的浓缩分数被认为是公认的治疗药物。
3所示。结果
3.1。结合数据集的识别度
数据预处理后,利用PCA分析合并后的数据集的基因表达模式。APA的基因表达模式显然是不同于NFAA, APA的点在空间上远离NFAA(图3(一个))。八十九度被确定使用截止准则:调整值< 0.05和| log2(褶皱变化)|≥1。这些度包括52个基因调节和47个基因表达下调与NFAA APA相比。火山图显示所有APA和NFAA(图之间的不同表达基因3 (b))。热图包括50个最调节和表达下调的基因明显显示了APA和NFAA(图之间的区别3 (c))。
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3.2。Coexpression分析
标准化和批处理的影响消除后,数据集用于WGCNA相结合。独立和规模意味着软阈值的权力(网络连接β)如图2(一个)。β= 6选择最大化模型,和19个模块,包括一个灰色模块(图2 (b))。所有的模块,布朗模块表现出最高的正相关与APA (module-trait加权关联= 0.69),而谭模块显示最强的负相关与APA (module-trait加权关联=−0.49)。我们也观察到,谭模块相关与注册会计师最强烈,而红色模块相关的最强烈的肾上腺皮质腺瘤与突变β连环蛋白基因,它经常发生在肾上腺皮质腺瘤和癌。
一个eigengene系统树图和热图是用来量化模块的相似性和相关性的临床特征APA(图2 (d))。结果表明,有一个高水平的独立模块。选择棕色和棕褐色模块,和APA的GS和毫米之间的关系都在散点图(数据显示模块2 (e)和2 (f))。基因在两个模块与APA高度相关。布朗的模块, 和相关= 0.66;棕褐色的模块, 和关联= 0.65。七十个基因从棕褐色棕色模块和12基因提取模块作为进一步分析中心的基因,使用标准和GS≥0.2毫米≥0.8。最后,随机选择400个基因的20848个基因构建一个网络热图(图2 (g))。
3.3。基因的鉴定和功能富集分析真正的中心
真正的中心度之间的基因在基因的一个十字路口设置的数据集相结合,中心基因的棕色模块和中心基因tan模块。基因被证实(图29真正的中心4(一)),包括三个lncRNA基因(SSTR5-AS1, LINC01314,LINC01116)和一个转录因子(DACH1)。集成网络的枢纽基因提取使用Cytoscape从coexpression网络软件(图4 (b))。评估这些基因的功能,功能富集分析使用clusterProfiler包和Metascape数据库(数据4 (c)和4 (d))。四种生物过程满足选择标准(部分2)被过滤掉,去:0015914(磷脂运输):0015748(有机磷酯运输):0045332(磷脂易位)去:0034204(脂质易位),使用clusterProfiler包;同样,浓缩从Metascape数据库结果如下::0015914(磷脂传输),:0051099(绑定)的积极监管:0016042(脂质分解过程),去:0001666(缺氧反应)。我们建造了一个浓缩网络Cytoscape使用的宾果游戏插件模块节点和黄色是重要的铀浓缩项目(图5)。
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3.4。GSEA结果
我们执行GSEA合并后的数据集。去富集分析,39基因集富集在APA表型值< 0.01,而58基因集富集在NFAA表型值< 0.01。至于KEGG通路富集分析,四个基因集富集在APA表型值< 0.05,而七个基因集富集在NFAA表型值< 0.05。部分结果如图6和7。富集分析显示,数据集”负调节脂质定位”,“负调节脂质运输,”和“纤溶酶原激活物”是丰富NFAA表型,而数据集“IRE-mediated展开的蛋白质反应,”“肽基天冬酰胺修改”和“τ蛋白激酶活动”在APA表型丰富。KEGG通路富集分析,数据集“ABC转运蛋白,”“补充凝血级联,”和“glycosylphosphatidylinositol GPI锚生物合成“NFAA丰富的表型,而数据集“glycerophospholipid新陈代谢,”“促性腺激素信号通路,”和“亚油酸的新陈代谢”丰富了APA表型。
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3.5。使用GSE10927验证中心的基因
我们使用另一个数据集GSE10927验证基因的真正中心。17度的验证数据集符合设定标准(部分2)被过滤掉。度的基因表达模式与之前确认的29的真正中心基因数据集相结合。六个基因,WISP2、S100A10 SSTR5-AS1、SLC29A1 APOC1,SLITRK4——同样的表达式模式(图确定的两个数据集8)。所有这些基因样本显示,APA表达相对较低和高表达NFAA样本,与所有值< 0.001。
3.6。筛选候选小分子药物的治疗
浓缩的筛选条件下分数<−0.75和值< 0.01,五个候选药物的潜在治疗价值APA是过滤掉(表1),包括clorsulon (C8H8Cl3N3O4S2)、甲氧苄氨嘧啶(C14H18N4O3),放线菌酮(C15H23NO4) meclocycline (C22H21ClN2O8)和terfenadine (C32H41NO2)。所有这些药物与基因表达模式显示显著负相关性在APA,表明这些药物可能对APA有效药物。我们也调查了这些候选药物使用的二维结构Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),如图9。
4所示。讨论
在这项研究中,我们结合肾上腺皮质腺瘤样本两个系列的地理数据集进行差异基因表达分析和coexpression网络分析。一群真正的中心基因被发现包括三个lncRNAs (SSTR5-AS1, LINC01314,LINC01116)和一个转录监管机构(DACH1)。这些基因可能发挥重要的作用在调节其他真正的中心基因的表达。LINC01116与骨肉瘤,胃癌,神经胶质瘤,头颈部鳞状细胞癌,为促进扩散,入侵,肿瘤细胞的迁移21- - - - - -23]。我们观察到,LINC01116高度表达NFAA样品和低表达的APA样本,表明它是一个APA的保护性因素。DACH1作为足细胞的转录因子是必不可少的功能(24]。然而,所扮演的角色DACH1APA的发病机理需要进一步调查。
我们通过各种方法进行功能富集基因进一步分析真正的中心。使用clusterProfiler包中,我们确定了四个高度相关的生物过程:磷脂运输、有机磷酯运输、磷脂易位,脂质易位,磷脂运输是最低的一个调整P价值。磷脂运输也有相当丰富,当使用Metascape数据库功能富集分析。之后,去注释浓缩进行Cytoscape使用宾果插件模块和浓缩网络也是构造。最重要的物品在GO浓缩磷脂有关运输和(或)磷脂代谢过程。总的来说,这些结果表明,磷脂运输和代谢可能APA的发病机制。
从GSEA浓缩的结果也获得了类似的结论分析。去注释的浓缩结果NFAA表型包括“负调节脂质本地化”和“负调节脂质运输,而浓缩的结果KEGG APA表型包含glycerophospholipid代谢途径,表明高水平的磷脂代谢活动在APA可能NFAA区分开来。潜在的分子机制需要进一步调查,尽管GSEA浓缩的结果提供了一些线索。
六个相同的基因表达模式和验证数据集相结合的识别。然而,验证样本有其局限性。由于缺乏数据分泌荷尔蒙的验证样本,样本分组可能产生假阴性结果分肾上腺NFAA集团大规模样本。高醛甾酮症样品肯定是APA;然而,我们不能保证所有的大规模样本NFAA肾上腺。尽管这种现象可能产生假阴性结果的样本分组过程中,增加了验证结果的特异性,只与APA显著表达差异基因和NFAA可以被定义为使用上面的筛选标准(部分度2)。
六个基因,WISP2、S100A10 SSTR5-AS1、SLC29A1 APOC1,SLITRK4已经确定了拥有相同的表达式模式相结合,验证数据集。这些基因在生物过程中扮演各种角色WISP2, S100A10, APOC1间接或直接参与脂类代谢。WISP2小说adipokine,据报道,WISP2击倒增强脂肪生成(25]。S100A10细胞膜修复蛋白与磷脂膜(拿着复杂的相互作用关系26]。SSTR5-AS1的反义lncRNASSTR5L作为一个肿瘤抑制,以及抗肿瘤治疗的潜在生物标志物(27]。人类equilibrative核苷转运体1 (hENT1),也称为SLC29A1SLC29家族的一员,扮演着重要的角色在腺苷信号nucleoside-derived抗癌,抗病毒药物运输在人类28]。载脂蛋白C1 (APOC1),所有的载脂蛋白中最小的一个,参与脂质运输和代谢。赶到triglyceride-rich脂蛋白和高密度脂蛋白和交流酯化胆固醇脂蛋白类之间,从而控制等离子体的脂质水平。Gautier的研究表明,人类APOC1转基因技术可以减少hypercholesterolemic兔子的血管硬化(29日]。APOC1也是一个关键基因丰富,使用clusterProfiler包和Cytoscape(表吗2和3),进一步确认磷脂运输和磷脂代谢可能APA的发病机制中发挥重要作用。
在所有候选药物推测使用提出根据基因表达数据库文件度、环己酰亚胺是抑制肾上腺皮质的活动报道(30.]。研究人员发现,放线菌酮进行总磷脂生物合成的抑制作用[31日]。Kempen的研究表明,环己酰亚胺不仅抑制极低密度脂蛋白(VLDL)分泌,也能抑制其他载脂蛋白的释放32]。在早期的研究中,磷脂生产被发现严重抑制cycloheximide-treated细胞(33]。各种证据表明,环己酰亚胺作为磷脂生物合成抑制剂中扮演了重要的角色。根据我们的研究上面,这反酌磷脂生物合成环己酰亚胺可能是其抑制作用的病理生理学基础。其他候选药物是否还保存属性如环己酰亚胺仍需要更多的研究来证实。此外,甲氧苄氨嘧啶显示绑定到磷脂的能力矩阵的双分子层膜(34),这表明甲氧苄氨嘧啶为APA也可能是一个潜在的有效的药物。
5。结论
使用差异基因表达分析和WGCNA,我们确定了具体的实际中心APA的基因。三种基因编码lncRNAs,其中一个编码转录因子。我们使用这些真正的中心基因进行功能富集分析。大部分的铀浓缩项目与磷脂代谢有关。此外,我们发现一些有前途的候选人药物治疗APA使用提出的数据库,其中一个已经报道了抑制肾上腺皮质的活动,也是一个强有力的磷脂生物合成抑制剂。这些结果表明,磷脂代谢是一个重要的机制,可以控制生产和(或)分泌APA醛固酮。因此,药物能够调节磷脂代谢过程为APA肾上腺组织可能是有前途的药物。然而,在这项研究中使用的样本数量很小,这一限制可能会倾向我们的结论。因此,更多的研究需要更大样本大小。
数据可用性
生成的数据集和/或分析在当前的研究可从基因表达综合数据存储库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)加入数字GSE33371 GSE28476, GSE10927。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
YYD导致稿件写作。杰为手稿的修改提供了极大的帮助和为英语提供了指导编辑和数据分析和设计方法。HW参与部分数据分析。仲量联行导致了本研究的设计和概念。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
作者感谢齐盛苏先生的临床实验室、广西医科大学第一附属医院,因为他的指导在这个研究。这项研究得到了国家自然科学基金(81660075号和81960087号)和广西医疗卫生适宜技术开发和推广应用程序项目(S2018号078)。