文摘

协会最近的一项研究显示小的等位基因rs2228611(T等位基因)rs2114724(T等位基因)DNMT1与精神分裂症(深圳)和建议对拼接的影响的记录。复制研究控制使用310和304年深圳病人和证实了小等位基因纯合子基因型与深圳协会(= 0.04rs2114724和对rs = 0.0072228611)。本重大协会坚持Bonferroni调整后,301年以前公布的数据控制和325患者也被认为是(≤0.0002)。此外,我们发现男性患者的比例小等位基因纯合子rs2114724显著高于女性(= 0.002)。执行两个位点的单体型分析时,我们观察到一个重要的协会T / T- - - - - -T / T和T / T- - - - - -C / T(与深圳= 0.04)单。获得洞察功能的两个单核苷酸多态性水平的影响DNMT1成绩单、定量实时PCR实验使用外周血单核细胞从10个人都有T / T- - - - - -T / T(小等位基因纯合子),C / T- - - - - -C / T(杂合的)C / C- - - - - -C / C(主要的等位基因纯合子)单。独立,DNMT1蛋白质的水平也比较每个通过免疫荧光三人。这些结果表明,无论是DNMT1转录和蛋白质含量有显著不同的个体之间的外周血单核细胞研究的三组。综上所述,我们的研究结果证实,与深圳相关的两个小等位基因纯合性的,但对成绩单或蛋白质含量没有明显的影响DNMT1外周血单核细胞的小数量的样品测试。

1。介绍

精神分裂症(深圳)是一个复杂的障碍,在全球范围内的发病率∼0.7%和多种病因,包括遗传、环境、和表观遗传机制(1- - - - - -4]。许多家庭和病例对照研究发现许多单核苷酸多态性(snp)和人类基因组变异(亚微观的删减和复制)与深圳显著相关(5,6]。证据的参与表观遗传机制在深圳来自双胞胎研究中同卵双胞胎(MZ)显示一致性(41 - 65%1]。不同的表观遗传过程在哺乳动物中,DNA甲基化涉及添加甲基5^th碳的胞嘧啶是最深入研究[7]。DNA甲基化是建立的德由DNMT1新生甲基转移酶种能阻碍DNMT3B DNMT3A和和维护。DNMT3L没有催化活性,但调节新创甲基化(8]。

最近,单核苷酸多态性DNMTs研究了深圳患者和控制从南印度9]。这些结果显示轻微等位基因的一个重要协会DNMT1(rs2114724,= 0.02,rs2228611, = 0.002),DNMT3B(rs2424932在深圳男性,=0.006;rs1569686在早期发病以及家族史,= 0.03)DNMT3L(rs2070565在深圳的早发性以及家族史,= 0.003)。其中,小的等位基因rs2114724和rs2228611(图1(一)),这是当前研究的重点,都被认为会影响拼接的DNMT1成绩单。在这里,我们进行了复制的研究来验证这两个协会DNMT1小等位基因控制使用一个独立的集合310和304名患者。因为缺乏地拼接或unspliced mrna在真核细胞退化和减少整体的转录水平10),我们的水平相比DNMT1(转录和蛋白质个体之间有三个单体型对微小等位基因纯合,两大等位基因纯合,和杂合的)。这里讨论的结果。

2。材料和方法

2.1。患者和对照组

这项工作是人类伦理委员会批准的机构参与的机构。正常对照组和深圳患者被合格的精神病学家使用列入精神条件(11]。控制年龄和sex-matched和没有任何神经精神条件。获得知情同意后,5 - 10毫升血液是由静脉穿刺和外周血单核细胞分离利用Histopaque 1077(美国默克公司)解决方案。纯化单核细胞被洗1 x磷酸盐(1 x PBS: 37毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,10毫米Na₂HPO₄,1.8毫米KH₂阿宝₄),用于隔离使用SDS-proteinase K基因组DNA的方法(12)和总RNA使用RNeasy迷你包(试剂盒,德国)。总rna reverse-transcribed使用上标IV互补脱氧核糖核酸合成装备(美国热费希尔)和合成互补使用引物而被放大肌动蛋白和DNMT1通过实时PCR(见下文)。

2.2。SNP基因分型结果与分析

从20正常个体基因组dna被用来放大区域包含rs2114724和rs2228611位点。引物序列和退火温度补充表中给出1。放大,10 ng每个基因组dna是使用5µ10 M每个引物的体积µl。放大条件包括95年一个周期的变性^°C 3分钟,其次是40 PCR(95年的周期⁰C: 30秒;55°C: 30秒;68°:30秒)和一个周期的最终在68°C扩展为3分钟。PCR产品gel-purified使用Qiaquick Gel-purification工具包(试剂盒)和测序桑格的双脱氧法测序方法。利用测序数据,个人主要等位基因纯合子,轻微的等位基因纯合子,杂合的基因型在识别位点。相应的基因组dna被用来开发放大耐火突变系统(武器)设计引物(补充表1)能区分主要和次要的等位基因的PCR (13]。放大的变性条件包括一个周期95°C 3分钟,其次是40周期的PCR (95°C: 30秒;55°C: 15秒;68°C: 20秒)和一个周期的最终在68°C扩展为3分钟。

ARMS-PCR的验证引物进行了使用相同的基因组测序的DNA样本。验证后,基因组dna从310年控制和304名患者被ARMS-PCR放大,和观察到的放大模式被用来推断基因型和等位基因频率。患者的数量控制和指定的基因型或单体型被用来执行费雪的t -测试(https://www.graphpad.com/quickcalcs/contingency1/使用双尾)方法和计算优势比(https://www.medcalc.org/calc/odds_ratio.php)[14]。≤0.05的值被作为重要。对于一个给定的基因型与深圳显著相关,外显率估计是用CalPen制作的,一个在线工具(15]。

2.3。实时聚合酶链反应分析

互补dna是从PBMCs准备10正常个体的三个单(主要在两个基因座的等位基因纯合子,杂合的两个位点,并为小等位基因纯合子基因座)和放大与引物DNMT1和β- - - - - -肌动蛋白成绩单(补充表1)使用iTaq普遍SYBR绿色Supermix(美国Bio-Rad)和QuantStudio3实时PCR系统(美国热费希尔)。DNMT1表达式是归一化β- - - - - -肌动蛋白作为一个内生控制获得ΔCt值。ΔCt值的平均值从十个人与纯合子的大单体型作为参考来计算ΔΔCt所有30个样品的三个单。相对丰度的记录被确定通过计算2^−ΔΔCt值(16]。单向方差分析(方差分析)进行了使用Microsoft Excel来识别任何显著差异DNMT1记录三组之间的水平(17]。

2.4。免疫细胞化学

纯化PBMCs洗和resuspended 1 x PBS稀释∼10⁶细胞/毫升。一毫升每个细胞悬浮液的转入6-well菜含盖玻片和离开静止30分钟在室温下允许附件的细胞(18]。不依从细胞被愿望,连接细胞被固定与500年10分钟μl 4%的多聚甲醛(美国默克公司)轻轻地沿着一侧的。1 x PBS的固定细胞被洗,permeabilized 500μl 0.5% Triton x - 100 (HiMedia、印度)10分钟,用1 x PBS 5分钟洗净,与500年了μl 1% BSA (HiMedia、印度)30分钟。主要抗体DNMT1(热费希尔,60 b1220.1)和组蛋白H3(细胞信号技术,4499)稀释1% BSA在一夜之间被添加到菜肴和孵化在4°C。细胞被洗了1 x PBS和孵化与荧光标记的第二抗体(细胞信号技术,4409年和4412年)在室温下一个小时。泥沙与1 x PBS重复两次,复染色与DAPI(热费希尔,D1306) 5分钟,洗了三次1 x PBS,并安装到玻璃幻灯片可视化使用共焦显微镜(徕卡:TCSSP8)。荧光强度的量化使用徕卡Las-X软件,使用组蛋白H3信号作为参考。归一化后的数据信号获得与组蛋白H3 DNMT1的相对信号20随机细胞为每个单独的被用于比较。DNMT1蛋白水平与三个单个体学生的比较t以及(双尾)≤0.05作为具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

我们建立了一个ARMS-PCR实现allele-specific放大,以便样品只包含较小的等位基因(等位基因小纯合子),只有主要的等位基因(等位基因主要纯合子),和两个两个位点的等位基因(杂合的)确定可靠(图1 (b))。我们使用ARMS-PCRs 310型控制和304个病人(材料和方法)。

所有614个人被归类为纯合的基因型主要等位基因或纯合子的微小等位基因杂合的,和个人的数量为每个基因型列表(表1)。从这些基因型,微小等位基因频率估计rs2114724对患者作为控制的0.43和0.45。与小等位基因控制的数量没有明显不同于患者。另一方面,患者的数量较小的等位基因rs2228611(频率= 0.47)明显高于(= 0.04)比控制(频率= 0.41)。费雪的t -测试进行确认是否有基因型频率控制和患者之间有显著差异。例如,158 310控制C/T基因型的rs2114724剩下的控制(152)C/C或T/T基因型。病人的情况下,125年有304患者C/T基因型和剩下的179人C/C或T/T基因型。利用这些信息,当小动物——一张长有费雪的t -测试执行,值为0.01,表明的比例C/T个人在控制(51%)显著高于病人(41%)。这个基因型的优势比为0.7,这意味着的几率C/T基因型是一个控制高于精神分裂症。类似的分析表明,微小等位基因纯合子基因型rs2114724(=0.04;优势比= 1.5253)rs2228611(=0.007;优势比= 1.7)的患者明显高于在控制。与以前公布的数据综合分析(9)总计611控制和629例显示更重要的协会的微小等位基因位点与深圳Bonferroni调整后(≤0.0002)个人优势比为1.73 (rs2114724)和1.83 (rs2228611),分别。

我们下一个检查是否有性别差异的分布小调allele-associated基因型患者(表2)。为rs2114724,小等位基因纯合的比例明显高于男性(52 170)是(= 0.002)比女性(134)22日。没有这样的性别差异微小等位基因纯合子基因型的情况rs228611。

单体型分析控制和患者之间透露了一个重要的协会的微小等位基因纯合子基因型rs2228611(T/T与小等位基因纯合子基因型()=0.04;优势比= 1.52)或杂合的基因型rs2114724(= 0.04;优势比= 4.7)的病人(表3)。

小的等位基因rs2228611和rs2114724都被认为会影响的拼接过程DNMT1信使rna (9]。自mrna拼接异常或不能接受成功的拼接是不稳定和退化10),我们测量DNMT1外周血单核细胞的信使rna水平的10个人C/C- - - - - -C/C,C/T- - - - - -C/T,T/T- - - - - -T/T单体型。虽然定量实时PCR数据显示单体型中的转录水平的变化,没有差别的平均水平DNMT1三个单(图之间的转录水平2(一个))。

作为一个独立的方法,DNMT1蛋白质含量比较在三人各有三个单免疫细胞化学(图2 (b))。的情况下DNMT1成绩单、相对DNMT1蛋白质含量不同的分布在一个单体型和没有差别(图三个单体型中蛋白质含量2 (c))。这些结果结合转录水平相比,通过实时PCR表明微小等位基因单体型(T/T- - - - - -T/T)不得与任何可识别的减少有关DNMT1成绩单或蛋白质水平。

4所示。结论

小的等位基因rs2114724和rs2228611已报告与深圳有关,胃,卵巢癌,乳腺癌,高血压,和听力损失(19- - - - - -24]。研究结果支持这些等位基因与深圳的重要关联。我们的观察是基于611控制和629名患者,和小尺寸的样品研究,需要更多的研究来证实这些发现。相反的预测微小等位基因影响拼接过程中,没有明显的变化记录或蛋白质含量PBMCs个人只有轻微的在这两个基因座的等位基因。自测试的样本量小,未来的研究涉及一组更大的样本可能识别事件DNMT1成绩单或蛋白质含量的影响。也有可能这些小等位基因的影响特定于神经元。在这种背景下,一个类似的功能分析大脑尸检样本是十分必要的。这些微小的等位基因的影响最终仍可能是太小检测实验甚至在大脑中。是否这么小的效果,如果有的话,和其他地方的其他变体DNMT1基因或其他相关基因的结果在一个可识别的分子异常深圳需要进一步调查。

数据可用性

手稿中的数据不包含任何文件需要存入公共存储库。收集所有必要的信息数据在手稿本身。

的利益冲突

作者没有任何经济利益的竞争。

确认

KNM实验室支持由DST-CSRI,歌剧,和人类疾病研究中心。免疫荧光成像在中央分析实验室进行BITS-Pilani,海德拉巴校园。Sumana Choudhury支持人类疾病研究中心的奖学金。

补充材料

补充表1:寡核苷酸用于测序,ARMS-PCRs和实时PCR分析。(补充材料)