文摘

的目标是。主要治疗冠心病经皮冠状动脉介入(PCI)和药物洗脱支架是用来抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖和迁移导致再狭窄的药物制剂释放进入血管壁。一旦药物洗脱支架部署,这些药物对许多生物效应在冠状动脉循环,不仅抑制VSMCs还扩展到血管内皮细胞(vec)。本研究的目的是探索目标分子抑制VSMCs增殖而不影响矢量。方法。信使rna和蛋白质的表情瞬时受体电位通道(TRPCs)培养VSMCs和矢量是由西方墨点法和RT-qPCR。VSMCs vec扩散是评估使用CCK-8化验和免疫印迹的增殖细胞核抗原(PCNA)。钙回填进行化验检测细胞内钙离子浓度在培养VSMCs和矢量。结果。TRPC6表达更丰富的比VSMCs vec,而TRPC4和TRPC5表情更丰富VSMCs矢量。击倒TRPC4或独自TRPC5没有显著的抑制VSMC增殖的影响。协同击倒TRPC4 TRPC5抑制VSMCs扩散,拒绝PCNA的表达,减少细胞内钙离子浓度但不是矢量。结论。这些数据表明,并发抑制TRPC4和TRPC5抑制VSMCs增殖而不影响矢量,从而为药物开发提供新靶点药物洗脱支架。

1。介绍

近年来,冠心病已成为危害人类健康的主要疾病之一,和经皮冠状动脉介入(PCI)仍然是主要治疗方法1]。药物洗脱支架是最广泛使用的支架在临床实践中由于其抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移(VSMCs)和预防再狭窄的药物制剂释放到血管壁(2,3]。一旦药物洗脱支架部署,这些药物对许多生物效应在冠状动脉循环,不仅抑制VSMCs还扩展到血管内皮细胞(vec)。然而,延迟扩散vec暴露了支架内腔的血管长时间,增加血栓形成的风险(4]。正常vec能保持血管体内平衡和抑制血栓形成通过调节血管张力,防止血栓形成,调节炎症。多余的vec凋亡是一个初步的事件在血栓形成发展5]。为了防止血小板聚集诱导的金属框架和支架血栓形成阻塞血管,接受PCI的患者必须接受双重抗凝治疗(6]。然而,支架植入后双抗血栓形成的治疗患者的出血并发症的风险增加(4]。识别药物目标可以抑制平滑肌细胞的增殖而不影响内皮细胞的增殖可以大大减少这些不必要的副作用在手术后患者服用双重抗血小板药物和缩短所需的时间双重抗凝治疗。

Ca2 +第二信使,扮演着一个重要的角色在细胞信号传导和调节众多的生理活动,如增殖,分化,传播的信息,和基因转录7]。细胞内自由钙离子浓度的变化直接影响细胞增殖(8,9]。有各种类型的钙通道,包括压敏电阻器钙通道(vdc) receptor-operated钙通道(roc)和门店钙通道(soc)。其中,soc中发挥非常重要的作用在调节细胞的功能,包括钙流入,细胞迁移,细胞增殖(10]。

瞬时受体电位通道(TRPCs)和ORAI soc的重要组成部分。在HEK293细胞、淋巴细胞和成纤维细胞,ORAI蛋白质提高门店入口(钙11]。如果内质网钙池中钙离子浓度降低或减少,机枪兵激活内质网传递信息TRPC ORAI位于细胞膜,这介导TRPC ORAI。的这两个calcium-regulated蛋白质通道导致细胞外钙流入,最终调节细胞生长和增殖12]。

的阳离子转运Na+/ Ca2 +交易所(NCX)是广泛分布在细胞膜,它精确、快速调节钙的浓度2 +在细胞质中,进而影响到许多细胞功能,如信号转导、细胞生长和发育,可兴奋细胞的兴奋收缩偶联(13,14]。以前的研究已经表明TRPC和NCX调节VSMCs[的扩散15),但目前尚不清楚是否SOC和NCX平滑肌细胞和内皮细胞的影响。这项研究旨在开发新型药物洗脱疗法可以减少所需的时间治疗。为此,我们探索了差异表达TRPCs VSMCs和矢量识别目标分子抑制VSMCs扩散而不影响vec的扩散。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类冠状动脉VSMCs vec (Bnbio,中国)培养如前所述[16,17在10%胎牛血清(的边后卫;美国圣地亚哥Sciencell) +杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;美国HyClone) 37°C公司5%28 - 10通道的孵化器。

2.2。西方墨点法

培养的细胞溶解产物VSMCs和vec准备,和蛋白质被bicinchoninic酸(BCA)量化方法。10% sds - page分离后,蛋白质样本然后转移到PVDF膜和阻塞TBST 5%的脱脂牛奶。膜反应与anti-TRPC1 anti-TRPC4、anti-TRPC5 anti-TRPC3, anti-TRPC6和反β肌动蛋白抗体,用二次抗体标准西方墨点法程序。免疫印迹使用Bio-Rad拍摄的图像分析系统(Bio-Rad大力神,CA)及其密度分析一个v4.6.2软件使用数量。Anti-TRPC1、anti-TRPC4 anti-TRPC5抗体买来罗福斯生物制剂(利特尔顿有限公司、美国)。Anti-TRPC3、anti-TRPC6 anti-PCNA和反β肌动蛋白抗体购买从细胞信号技术(美国)。

2.3。RNA隔离和实时qPCR (RT-qPCR)

总RNA分离试剂盒试剂(美国英杰公司)根据制造商的指示。PCR是直接由骏CFX96监控实时聚合酶链反应序列检测系统。我们使用RNA模板和引物reverse-transcribe总RNA 25°C到cDNA退火后5分钟,其次是扩展在42°C 60分钟和失活在70°C,持续15分钟。放大了单链cDNA qPCR使用40周期。我们在基因库数据库中搜索目标基因序列,然后使用引物6.0软件设计引物具有良好的特异性和类似的退火温度。确保实验的成功,为每个基因,两对引物的设计和最好的对被选为后续实验。引物序列表中列出1。

表1
研究中使用的引物序列。
2.4。细胞转染

VSMCs通道10与siTRPC4转染后vec (5′-GGCCTAAATCAATTGTACT-3′)和siTRPC5 (5′-GACACGAATTCACCGAGTT-3′),都由RiboBio(中国),使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体)。siRNAs的转染浓度是根据产品规范进行了优化。小干扰RNA转染24小时后,从细胞中提取RNA,互补是通过反转录,mRNA水平的TRPC4和TRPC5被RT-qPCR测量。

2.5。CCK-8化验

消化细胞对数生长期,细胞悬浊液准备,和细胞计数,接种到96孔细胞培养板,直到坚持培养2 - 4 h。接下来,200年μL取代新鲜的完全培养基,CCK-8试剂(Gibco)添加(20μ每24 h L /)(至少三个复制井每组)和细胞孵化并不断监测5 - 7天绘制曲线。细胞计数也执行。

2.6。细胞内钙离子浓度的测量

钙实验,细胞被resuspended磷酸盐(PBS) Fura-2AM添加到最终的浓度5μ1.5 mol / L,哈佛商学院的解决方案(包含更易与L CaCl2)还补充道,和细胞密度调整1×106/毫升的温度37°C /在黑暗中30分钟。用荧光分光光度计检测激发波长340 nm和380 nm交替扫描,和发射光的荧光强度测量。所有的痕迹都代表几个独立的实验。

2.7。统计分析

SPSS 17.0软件被用于统计分析。结果表示为平均值±标准平均误差(SEM)。方差分析(方差分析)是使用Dunnett执行t测试多个比较, 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。VSMCs和vec的形态特征

显微镜显示,当VSMCs的融合达到100%,细胞显示很长梭形的形状,与梭状融合时达到50%至60%;VSMCs的长度显著增加,细胞排列规律,细胞边界较清楚。当细胞融合增长到100%,vec没有表现出这种典型的梭状结构,而是采用了菱形形状,折射率略低,细胞轮廓不清楚。形态学观察VSMCs和vec详细的补充材料1。

3.2。表达TRPCs VSMCs和矢量

RT-qPCR结果(图1(一))表明,信使rna表达水平在vec TRPC1和TRPC6高于VSMCs。相比之下,VSMCs TRPC3 mRNA表达水平,TRPC4, TRPC5明显高于矢量。差异具有统计学意义( )。

(一)
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(b)
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图1
(a) mRNA表达水平TRPCs (TRPC1、TRPC3 TRPC4, TRPC5,和TRPC6)在RT-qPCR VSMCs和矢量测量。(b)西方印迹和蛋白表达水平的TRPCs (TRPC1、TRPC3 TRPC4, TRPC5,和TRPC6) VSMCs和矢量。N= 12。 。 。

我们使用西方墨点法测量蛋白质丰度五钙调节蛋白在矢量和VSMCs和分析的结果使用ImageJ涂颜色的开发软件(图1 (b))。灰度分析后,我们发现TRPC6 ( )在vec比VSMCs更丰富。相比之下,TRPC4 ( )和TRPC5 ( )更丰富的比vec VSMCs。TRPC1的丰度和TRPC3两个细胞类型不同,但不是统计( )。

总之,我们测量5钙调节蛋白的丰度矢量和VSMCs qPCR和免疫印迹。我们发现TRPC4 mRNA和蛋白水平和TRPC5明显不同的两种细胞类型。因此,我们选择TRPC4和TRPC5后续实验。

3.3。建设TRPC4和TRPC5击倒VSMCs和矢量

在这项研究中使用的实验方法成功地转移siRNAs进入靶细胞(参见补充材料2详情)。我们选择优化siTRPC4 siTRPC5 vec传染和VSMCs(参见补充材料3详情)。结果表明,没有观察到红色荧光消极的控制,但与100 nM siTRPC4红色荧光观察,100海里siTRPC5, siRNA构造转染后48 h。TRPC4的转染效率和TRPC5 siRNA vec VSMCs超过90%(图2(一个))。接下来,我们用免疫印迹分析TRPC4和TRPC5蛋白表达水平。结果表明转染TRPC4 TRPC5 siRNAs成矢量和VSMCs下调TRPC4和TRPC5蛋白质的表达水平(图2 (b))。

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图2
(一)siTRPC4 (100 nM)和siTRPC5(100海里)转染到vec VSMCs,和细胞被荧光显微镜检测转染后48 h。a和b没有标记Cy3 vec的转染48 h -控制;c和d是TRPC4 siRNA(100海里)的vec转染48 h, e和f TRPC5 siRNA(100海里)的vec转染48小时;g和h TRPC4核(100海里)和小干扰rna(100海里)TRPC5 cotransfected vec 48 h。其中,a, c, e, g brightfield下观察转染后的细胞形态,b, d, f和h下观察转染效率的红色荧光通道,i和j没有标记Cy3负控制的VSMCs转染48 h, k和l TRPC4 siRNA(100海里)的VSMCs转染48 h, m和n是TRPC5 siRNA(100海里)的VSMCs转染48 h和o和p TRPC4核(100海里)和小干扰rna(100海里)TRPC5 cotransfected VSMCs 48 h。其中,i、k、m和o brightfield下观察转染后的细胞形态,和j, l, n, p是观察转染效率的红色荧光通道。规模酒吧= 50μm。(b)后的表情TRPC4和TRPC5抑制使用siRNA策略,TRPC4 TRPC5蛋白质表达水平被西方墨点法测量。黑色:空白组。N= 12。 与VSMC-CTRL, VSMC siTRPC4, VSMC siTRPC5。 。
3.4。并发击倒TRPC4和TRPC5抑制VSMC增殖而不影响矢量

在这项研究中,我们使用CCK-8化验,活细胞计数和细胞周期蛋白PCNA检测检查TRPC4的影响和TRPC5 siRNAs vec的扩散和VSMCs。结果显示没有增殖能力的变化矢量携带siRNAs TRPC4或TRPC5单独或结合在一起。然而,VSMCs细胞cotransfected TRPC4和TRPC5 siRNAs显示更明显抑制增殖的细胞携带TRPC4或TRPC5核(图3(一个))。VSMCs,相比之下,小干扰rna (NC)集团的争夺,TRPC4和TRPC5联合干预组表现出PCNA的表达下调表达( ;图3 (b))。

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图3
(a)的影响沉默TRPC4 VEC和VSMC增殖和TRPC5 CCK-8评估分析和可行的细胞计数。 与VSMC-CTRL, VSMC siTRPC4, VSMC siTRPC5。 。(b) PCNA蛋白表达的蛋白免疫印迹分析。VSMCs和矢量、TRPC4 TRPC5,并结合TRPC4 + 5干扰组测试,结果是与NC组。数据意味着+ SEM。N= 12。 与VSMC-NC。
3.5。并发击倒TRPC4和TRPC5减少细胞内钙离子浓度在vec VSMCs但不是

一个1μM thapsigargin浓度(TG)被用来刺激细胞内钙的消耗商店,外部的钙离子浓度增加到2米,和测量细胞内钙离子浓度的变化。结果表明,VSMCs干扰TRPC4或TRPC5本身并没有改变细胞内钙离子浓度( )。然而,干扰TRPC4和TRPC5同时显著降低细胞内钙浓度( ;图4(一))。vec干扰TRPC4或TRPC5单独或一起TRPC4和TRPC5并未显著改变细胞内钙离子浓度水平的NC组( ;图4 (b))。

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图4
(一)TRPC击倒对钙的影响在VSMCs存储损耗。TRPC4、TRPC5 TRPC4 + TRPC5化验后7分钟。干扰TRPC4和TRPC5显著降低细胞内钙含量(N= 6, 对小干扰rna (NC)争夺)。(b) TRPC击倒对钙的影响在vec存储损耗。TRPC4、TRPC5 TRPC4 + TRPC5干扰组化验后7分钟。每个实验组细胞内钙离子的增加实际上是恢复的NC组(N= 6, 与NC)。

4所示。讨论

本研究的目的是确定抑制VSMCs扩散的分子目标而不影响vec通过研究SOC和相关calcium-modulating分子。我们比较vec在mRNA和蛋白表达水平和VSMCs五Ca2 +通道蛋白(TRPC1、TRPC3 TRPC4, TRPC5,和TRPC6)。其中,TRPC4和TRPC5 vec和VSMCs显著差异表达。的表达在VSMCs TRPC4和TRPC5高于vec。这项研究的结果表明,在人类冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞,downregulation TRPC4和TRPC5可以抑制VSMCs扩散而不影响vec的扩散。TG用于耗尽时细胞内钙池,细胞内钙离子浓度显著下降。当外源钙离子增加,细胞内的钙离子浓度恢复。然而,在细胞中TRPC4和TRPC5同时沉默,添加外源钙离子没有恢复细胞内钙离子浓度。钙离子浓度的分析表明,cointerference TRPC4和TRPC5 VSMCs显著影响钙流入,但不是矢量。

TRPC家族由7名成员(TRPC1-7)形式homo和调节细胞内形成Ca2 +浓度和参与各种生理和病理过程18]。其中,TRPC4和TRPC5属于同一亚科和分享69%的同源性(19]。本研究进一步证实了TRPC4和TRPC5基因的同源性。免疫印迹结果表明,蛋白表达水平TRPC4和TRPC5在矢量和VSMCs几乎相同,这是进一步支持的功能实验。这两个基因有协同效应,两个基因沉默抑制VSMCs的扩散程度大于要么沉默基因。结果证实,TRPC4 TRPC5同源,执行类似的功能。

一项研究表明,TRPC1在衰老大鼠主动脉组织中蛋白质水平显著降低,而TRPC6急剧增加(20.]。进一步的研究发现,siRNA-mediated抑制TRPC1表达式可以补偿TRPC6 upregulation [21]。另一项研究显示,TRPC5可以与分子相互作用,如TRPC4 TRPC6,从而调节他们的生理功能22]。TRPC倾向于形成杂聚合物,和一个或多个TRPC差别损失或对这些蛋白质可能被其他TRPCs补偿23]。这种机制是否也存在TRPC4和TRPC5之间需要进一步的研究。

各种病理生理状态与增加和减少TRPC通道表达和异常通道开启和关闭活动(24]。最近的研究表明,TRPC4参与肺动脉高压的影响内皮细胞和平滑肌细胞的增殖25]。TRPC抑制剂的使用和特定TRPC通道阻滞剂可以减少Ca2 +浓度和调节细胞增殖26]。在我们的研究中,发现TRPC4和TRPC5表达信使rna和蛋白质含量在两个矢量和VSMCs。然而,比vec VSMCs表达水平较高。随后的实验表明,VSMCs明显下降后沉默的扩散TRPC4 TRPC5。相比之下,vec扩散没有明显影响这些基因的沉默。我们的研究是TRPC通道的表达发生了变化,从而影响VSMCs和vec的生理状态。表达下调机制TRPC4和TRPC5抑制VSMCs的扩散是通过抑制减少跌倒由TRPC4 TRPC5,导致细胞减少钙流入。我们需要进一步建立动脉粥样硬化动物模型的影响来确定TRPC4和TRPC5 VSMCs和vec在病理条件下的扩散。有研究表明,内皮细胞,如TRPC1、TRPC4也促进电容钙流入(27]。这个电容钙流入是否与跌倒有关尚不清楚,但我们TRPC4和TRPC5差别实验表明,对这些没有影响内皮细胞的增殖,所以我们可以推测是否电容钙补充剂涌入TRPC4的功能,并进一步探索是必要的。不受控制的细胞增殖可能与高水平的细胞凋亡有关(28]。Furuya等人还显示,增加细胞内自由钙离子可导致细胞凋亡(29日]。因此,有一个关闭细胞凋亡和细胞增殖的关系。在我们的研究中,细胞凋亡在不被察觉的情况下,这将是在后续实验中进一步探讨。

总之,目前的差别研究清楚地表明,对这些TRPC4 TRPC5可以抑制平滑肌细胞增殖,为建立新的药物洗脱支架提供潜在的药物靶点。

数据可用性

期间产生的所有数据或分析本研究中包括发表的这篇文章及其补充信息文件。

信息披露

蒙牛曾庆红和霁是co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

蒙牛曾庆红和霁贡献同样这项工作。

确认

本研究支持格兰特(没有。81370383)从中国的国家自然科学基金。

补充材料

形态比较血管平滑肌细胞和血管内皮细胞,核转染成矢量和VSMCs,和建设TRPC4 TRPC5击倒的血管平滑肌细胞和血管内皮细胞。(补充材料)