Dectin-1-Mediated M1巨噬细胞极化的作用在脑缺血再灌注损伤

文摘

介绍。脑缺血治疗的进步已经导致了更大比例的病人得到的好处重建血液流向大脑。然后,缺血再灌注损伤已成为一个新的关键问题。Dectin-1扮演着一个重要的角色在脑缺血再灌注损伤通过调节免疫细胞的功能。方法。C57BL / 6盲目分成四组包括sham-operated组和三种不同的大脑中动脉闭塞(MCAO)组(后6小时、12小时、24小时后插入删除)。dectin-1的蛋白表达水平,proapoptosis分子,antiapoptosis分子测定采用免疫印迹分析。分析了大脑组织流式细胞术检测M1巨噬细胞水平。结果。dectin-1和梗塞区域的相关分析表明,在它们之间有明显的正相关关系(R= 0.9603)。Dectin-1,裂解caspase-3,伯灵顿增加了,而antiapoptosis分子,bcl - 2,适当减少三个时间点(后6小时、12小时、24小时)。M1的巨噬细胞在缺血再灌注损伤后实验组增加与对照组相比。结论。dectin-1的高表达水平可能影响M1巨噬细胞极化和大脑细胞凋亡在脑缺血再灌注损伤。

1。介绍

中风是残疾的主要原因之一,全球第二高的死因,与某些明显增加患病率在某些领域(1),而缺血性中风是占大约72.5%的中风整体(2]。值得注意的是,中风是神经功能丧失的主要原因和神经元死亡在脑缺血性损伤的过程中(3]。脑再灌注损伤脑组织缺血性中风被定义为损伤后遭受血液供应不足,极大地降低了新建立的好处血液流动对急性缺血性中风(4]。

炎症是一个至关重要的因素与脑缺血再灌注损伤后的进展和预后。先前的研究表明,住宅的异常激活小胶质细胞是来源于神经胶质细胞和巨噬细胞来源于单核细胞循环导致了急性脑缺血性损伤(5]。外围的几种细胞包括T淋巴细胞、B淋巴细胞,中性粒细胞,也加剧了中性粒细胞功能损伤通过释放促炎细胞因子在中风的早期阶段6,7]。骨骨髓来源的巨噬细胞炎症和损伤加速缺血再灌注后的脑梗塞的地区,这增加了angiopoietin-like蛋白质的表达水平(ANGPTL) 2 (8]。

Dectin-1是c型凝集素受体(CLR)的家人,涉及在许多病理生理过程(包括神经炎症9)、巨噬细胞极化和中性粒细胞浸润[10]。基于先前的研究的一些研究,dectin-1主要是表达在树突细胞,巨噬细胞和中性粒细胞(11),参与了缺血再灌注损伤的参与调节巨噬细胞极化和中性粒细胞浸润10]。迄今为止,仍然有非常有限的研究在这一领域,所以需要进一步的探索探索dectin-1涉及的潜在作用在脑缺血再灌注损伤的发展。在这项研究中,我们调查了表达水平的dectin-1大脑和探讨脑缺血再灌注损伤后dectin-1的功能机制。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠(6 - 8周,在18到22岁的g)直接购买从三峡大学动物实验中心。所有老鼠都保持在一个specific-pathogen-free (SPF)环境3笼子(总共8大鼠/笼)和4组单独划分(2大鼠/组),和环境是22日至25日°C和充足的食物和水。所有英汉动物研究符合美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。英汉动物研究是由丁Fadian动物实验中心的武汉Barfil生物技术有限公司有限公司英汉动物研究伦理委员会批准闽东医院福建医科大学附属。

2.2。缺血性中风模型

相同的年龄范围的老鼠实验的开始。C57BL / 6和5%异氟烷麻醉,麻醉条件下保持了1.5%异氟烷。操作板上的老鼠固定仰卧的姿势,和脖子上的皮肤消毒。颌下腺可以观察到通过消除颈部的皮肤以及中间钝分离的过程。腺是轻轻推到一边分离气管前肌肉,然后沿着正确的分离胸锁乳突肌肌腱。在看到颈动脉鞘,皮肤肌肉牵开器是固定的。在这一点上,颈总动脉。颈总动脉的分叉的结扎,和一个滑结了附近的颈总动脉分叉,和附近的颈外动脉分叉的结扎。一个小切口在颈总动脉是由微观剪切。我们拿起MCAO线系通过血管,轻轻地抬起的丝线结扎颈总动脉”。 Then, we loosened the vascular clamp when the line tied enters the internal carotid artery, and we continued to push the line tied until the marker reaches the location of the vessel bifurcation. Tighten the slipknot. After 60 minutes of ischemia, the plug was removed, and the live mice were ligated to death. The muscle and skin were sutured. Samples were taken 6, 12, and 24 hours later. The success of the model was determined by Zea-Longa’s method [12]。大鼠的神经功能是在0 - 4分。分数评估术后24小时的行为。动物的分数从1 - 3被认为是成功的,和动物的0,4和生命体征不稳定被否决。

2.3。Triphenyl-2 3 5-tetrazoliumchloride (TTC)

老鼠的大脑的部分放在triphenyl-2 2%, 3, 5-tetrazoliumchloride (TTC) 37°C温度箱30分钟。每个片完全浸泡在TTC和PBS洗。TTC的结果是盲目地使用数码相机拍摄的。白色区域的部分(梗死区)和红色部分(noninfarcted区)使用ImageJ测量,和总梗塞面积之和梗塞(梗死面积/ (noninfarcted区+梗死区))。

2.4。免疫印迹

大脑组织被削减,磨,和细胞溶解里帕裂解和提取缓冲(猫# P0013B, Beyotime)和蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加(猫# P105539,阿拉丁)。蛋白质(30μg)是由sds - page分离(5%的浓缩胶和12%的分离胶)和转移到PVDF膜(猫# ISEQ15150和猫# IPVH00010,微孔)。5%脱脂牛奶是用来阻止,孵化了PVDF膜有针对性的初级和二级抗体的抗体。最后,乐队的蛋白质与发射极耦合逻辑检测可视化解决方案(热)。抗体的主要如下:兔多克隆抗体dectin-1(猫# Ab140039, 1: 1000;Abcam),鼠标bcl - 2单克隆抗体(猫# ma1 - 12246, 1: 1000年,热),鼠单克隆抗体伯灵顿(猫# sc - 7480, 1: 1000年,圣诞老人),兔多克隆抗体caspase-3(猫# 9662,1:1000年,春秋国旅),和anti-GAPDH(猫# AB-P-R 001, 1: 5000年,杭州Xianzhi生物有限公司有限公司)。我们量化蛋白质带的强度与ImageJ软件,而所有目标蛋白质GAPDH规范化。

2.5。流式细胞术

脑组织用剪刀剪成碎片,消化0.25% trypsin-EDTA复杂的消化解决方案在37°C为30分钟。血清终止消化,猎鹰的细胞进行筛选。离心后,液体被丢弃。PBS-resuspended细胞1毫升0.5%牛血清白蛋白(BSA)流管离心机在1000转3分钟。上层清液被丢弃,PBS resuspended细胞被测量。抗体CD11b (eBioscience™)和F4/80 (eBioscience™)在4°C添加和孵化在黑暗的30分钟,之后,这些细胞被测量使用流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)。FSC和SSC在第一个实验基于细胞巨噬细胞的大小。在接下来的实验中,这些都是没有改变。

2.6。统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 5.0 (GraphPad棱镜软件公司,圣地亚哥,美国)和SPSS 15.0对Windows(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。连续变量表示为中位数(四分位差、差)和计算Mann-Whitney测试。分类变量表示为百分数,由测试组间比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Dectin-1在脑组织的表达水平增加了在脑缺血再灌注损伤

探索dectin-1在脑缺血再灌注损伤的潜在机制,我们调查的表达水平dectin-1效果脑组织的缺血再灌注损伤后三个合适的时间点。蛋白表达水平的dectin-1显示增加的趋势在6个小时,12小时,24小时后缺血再灌注。与此同时,TTC的结果显示,缺血区域的速度/组织显著增加(见图1(a))。缺血再灌注后,蛋白质含量的比值dectin-1 / GADPH为0.454,0.521,和0723年在6个小时,12小时,24小时,分别在sham-operated集团,它是0.267。缺血性面积/组织的比例为6.92%,14.11%,和30%在6个小时,12小时,24小时,分别在sham-operated集团,这是观察到没有任何相应增加(见图1(b))。dectin-1在梗塞区域的相关分析表明,这是一个明显的正相关关系(R=(图0.9603)2 (c))。dectin-1明显的表达水平与脑梗死后,脑缺血再灌注损伤。

3.2。Dectin-1参与了脑梗死脑缺血再灌注损伤后调节细胞凋亡

基于之前的研究,dectin-1的干扰基因消融或抗体封锁导致了相当大的改善心脏功能,伴随着增加apoptosis-related蛋白(10]。进一步调查潜在的分子机制在脑梗死,我们测量dectin-1的蛋白质含量,proapoptosis分子,antiapoptosis分子。缺血再灌注损伤后,代表免疫印迹分析和总结数据显示proapoptosis分子伯灵顿的蛋白质含量和裂解caspase-3减少,而antiapoptosis bcl - 2分子的增加三个合适的时间点(6小时、12小时和24小时),与这些相比sham-operated组(数字3(一个)和3 (b))。Dectin-1参与大脑细胞死亡调节脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的信号通路。

3.3。Dectin-1-Mediated M1巨噬细胞极化参与脑缺血再灌注损伤

促炎细胞因子il - 6和TNF -α的象征性的细胞因子M1-polarized巨噬细胞,而抗炎细胞因子il - 10被称为符号M2-polarized巨噬细胞的细胞因子13]。高水平的M1-polarized巨噬细胞检测脑缺血再灌注损伤后,和各自的高水平dectin-1可能加速脑缺血再灌注后的极化。研究结果显示的比例M2巨噬细胞在缺血再灌注损伤过程中增加。sham-operated组的比例是0.42%,而在实验组,0.71%,1.23%,和1.82% 6小时后,12小时和24小时的缺血再灌注损伤,分别(图2)。

4所示。讨论

目前,研究结果表明,dectin-1表达水平显著增加脑组织的缺血再灌注损伤过程中。与此同时,与apoptosis-related dectin-1显著相关蛋白的表达在脑缺血/再灌注模型。有趣的是,流式细胞术结果显示,脑梗塞与M1巨噬细胞的极化和dectin-1的高表达水平。apoptosis-related蛋白质的水平和M1巨噬细胞的比例支持的假设dectin-1发挥了重要作用在脑梗死和凋亡过程中缺血再灌注损伤。

的高表达水平dectin-1观察骨骨髓来源的巨噬细胞和中性粒细胞在缺血性中风。删除和表达的蛋白质测试表明,M1 dectin-1显著相关巨噬细胞极化和中性粒细胞浸润在心肌梗塞的组织(10]。海带多糖、dectin-1拮抗剂IBA1-positive细胞的数量减少和肿瘤坏死因子的表达和诱导一氧化氮合酶在缺血性中风后第三天,减少脑梗死的体积和改善神经功能(14]。Upregulation dectin-1的心肌细胞缺血再灌注损伤后促进心脏重构通过激活NF -κB和NLRP3 [15]。Dectin-1 macrophage-dependent方式会导致脱髓鞘和轴突损伤,和枯死的dectin-1-null基因敲除动物模型表明,轴突也减少脊髓损伤后(16]。Dectin-1可以调解后受伤部位缺血再灌注损伤的炎症反应,产生不利影响,并补偿增生心脏,大脑,神经,和其他相关组织。

在心肌缺血再灌注损伤,巨噬细胞被证明是主要的细胞类型和显示功能异质性与促炎的巨噬细胞(巨噬细胞M1)浸润在第一次和高水平的抗炎巨噬细胞(M2巨噬细胞)在第二个反应,倾向于anti-inflammatory-related免疫细胞。M1 TNF -巨噬细胞表达α伊诺,il - 1β,而il - 6诱导强烈促炎反应,导致心肌缺血再灌注损伤。相比之下,M2巨噬细胞表达il - 10、ARG-1和ARG-2耗尽精氨酸商店和聚胺和脯氨酸(而不是一氧化氮),聚胺和脯氨酸对细胞的生存很重要。黄芩甙元发挥了神经保护作用在脑缺血再灌注损伤体内通过调节巨噬细胞M1 / M2极化(17]。

肺炎的大鼠模型,dectin-1的高表达,这是一个关键受体识别和清除由巨噬细胞诱导分化的巨噬细胞M1 (18在NF -]κB-dependent通路(19]。Dectin-1来源于微粒β葡聚糖M2来源于巨噬细胞的骨转换成M1-like表型,这表达了促炎细胞因子如TNF -α伊诺,il - 1β,il - 6抑制肿瘤的发展(20.]。此外,dectin-1影响麦克米兰,NF -κB, p38-associated通路,调节中性粒细胞招聘通过表达和分泌的监管处于受控和g - csf后缺血再灌注损伤17]。

总之,dectin-1是一个重要的immune-cell-related受体的表达水平增加缺血再灌注损伤和缺血再灌注损伤的预后相关。Dectin-1-mediated M1巨噬细胞极化和大脑细胞凋亡参与再灌注损伤。本文的研究还不够全面,和结果只是相关性研究的一部分。在未来,我们可以获得更多的科学研究结果通过细胞的结构模型和蛋白表达的干预。

数据可用性

生成的数据集分析在此研究可从相应的作者在12个月内出版。

伦理批准

英汉动物研究伦理委员会批准闽东医院福建医科大学附属。

信息披露

陈Zongyun和林Bixia co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

作者的贡献

ZK和YXY导致了项目设计和实验设计。CZY导致了写作和重要的修订手稿。LBX导致设计和参与的重要修订手稿。过程和HXP导致了实验操作和结果分析的手稿。慢乙肝造成实验结果的讨论和文章翻译的手稿。DY和LQC导致了分析和解释,以及关键的修订手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。陈Zongyun和林Bixia同样这项工作。

确认

作者感谢武汉Barifil生物技术有限公司,为他们提供动物实验的网站和技术支持。本研究支持的福建医科大学帆船基金项目(2018 qh1221)和福建省财政部(bpb zk - 2020)。

引用

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