抗菌的效果在体外蜂蜜来自丹麦各种植物

文摘

蜂蜜的生物行为背后的机制作为一个伤口补救已经深入研究;然而,并没有公布的数据对于任何蜂蜜的抗菌效果来自丹麦的植物。我们调查11各种丹麦植物来源的蜂蜜的抗菌活性和他们烹饪加工相比商业蜂蜜(雅各布森)和原始和医疗级麦卢卡(Leptospermum scoparium使用agar-well扩散法)蜂蜜。我们测试了影响三个(两株革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和一个应变的葡萄球菌epidermidis革兰氏阴性细菌()和两个铜绿假单胞菌和大肠杆菌)。所有样品,除了商业蜂蜜,表现出抗菌活性,样本来自水薄荷(各种aquatica),有机2(混合有机植物),和林登(椴树属cordata蜂蜜有一致的影响所有细菌检测和显示效果比医疗级和生麦卢卡(l . scoparium)蜂蜜。在丹麦蜂蜜甲基乙二醛的含量很低(< 2μg / mL)和显著(p < 0.05)高于原始和医疗级麦卢卡(l . scoparium)亲爱的,浓度,分别为6.29μ和54.33克/毫升μ克/毫升。丹麦蜂蜜的抗菌效应主要是由于过氧化氢。我们得出这样的结论:蜂蜜来自丹麦植物具有抗菌作用,可能通过一个障碍粘度的影响,同渗重摩,酸度,生物活性肽,最重要的是过氧化氢的内容。这些发现表明,蜂蜜各种丹麦花卉的来源可能有临床潜力,虽然有必要进一步的研究来阐明这种为了确定我们的结果在体外实验也适用于临床设置。

1。介绍

蜂蜜吸引了越来越多的关注治疗伤口的治疗不同,主要是由于验证抗菌活性(1]。抗生素耐药性和慢性伤口感染抗菌治疗增加了兴趣,包括honey-based伤口护理产品,这些已经在医疗监管当局注册伤口护理人员在许多国家,其中,欧盟、美国和新西兰。这些产品主要是基于麦卢卡(Leptospermum scoparium)从新西兰蜂蜜。

蜂蜜是花蜜的集合,由糖(75 - 79%),水(20%),蛋白质,维生素,矿物质和抗氧化剂2]。蜂蜜的作用机制研究了密集,并承认对伤口愈合的影响通过一系列的生理和生物活性属性(1]。蜂蜜的抗菌活性可以归因于自然发生的酶生产过氧化氢(H₂O₂)和不同的植物化学的组件(如甲基乙二醛(分别)3,4]。H的浓度₂O₂蜂蜜是低,同时仍然有消毒剂和组织清创效果没有细胞毒性,导致组织损伤(5]。此外,蜂蜜有一个低pH值、高同渗重摩,粘滞特性,抑制微生物的生长(6]。

蜂蜜不同地理和花卉的起源可能具有抗菌特性的差异,这可能与不同化学成分的蜂蜜(5,6]。亲爱的来自Leptospermum物种在新西兰麦卢卡)和澳大利亚的特点是高抗菌活性甚至在过氧化氢酶的存在,这是一种酶破坏H₂O₂。这nonperoxide活动是由于高浓度的分别,这是来自二羟基丙酮,存在于大量的花蜜Leptospermum物种(5,7]。但其他因素,如植物化学的物质和多肽bee-defensin-1,可能导致整个生物效应的蜂蜜(8,9]。

原始的丹麦通过农贸市场或出售的蜂蜜被当地商店的特点是不加热的过程中生产。这主要是因为原始丹麦从当地的养蜂人,立即处理蜂蜜蜂蜜埋没在眼镜上市出售,不像商业蜂蜜加热液化后存储。这个即时处理没有加热保存蜂蜜的自然酶的性质,但也有一个小细菌污染的风险。为了不影响蜂蜜的抗菌效果和消灭微生物,如肉毒梭状芽胞杆菌孢子在蜂蜜,有时发现医疗级蜂蜜应该由辐照消毒,而不是通过加热而破坏了葡萄糖氧化酶(10,11]。

有趣的是,没有公布的数据对于任何蜂蜜的抗菌效果来自丹麦的植物,尽管大量传统的生产和销售原始蜂蜜在丹麦和明显的兴趣发展当地,生物,和治疗有用的治疗伤口护理。

本研究的目的是研究生物活性不同花卉的丹麦蜂蜜来源,确定各种类型的抗菌活性在体外和关联这H的存在₂O₂和分别。此外,我们分析了一个商业(加热)医学级麦卢卡蜂蜜和(l . scoparium)蜂蜜以及生麦卢卡(l . scoparium)从新西兰蜂蜜比较。

2。材料和方法

2.1。蜂蜜样品

蜂蜜样品不同花卉的来源(表1)收集从当地养蜂人在2016年7月和8月之间。此外,一个样本从丹麦商业烹饪加工蜂蜜制造商雅各布森和由金合欢的混合蜂蜜来自东欧的不同区域。另外,原始麦卢卡(l . scoparium)蜂蜜从当地生产商从新西兰和获得商业医疗级麦卢卡(l . scoparium)蜂蜜(“Activon”,取而代之的医疗)是包括在内。所有样本存储在消毒容器在黑暗中在室温(20 - 22°C)。所有的测试进行盲法,和标签后的实验工作和统计分析完成。花卉的来源提供的身份是养蜂人基于可用性的不同来源花蜜的时候收集、养蜂场的位置,和蜂蜜的感官性质。样本稀释处理通过增加无菌Milli-Q水37°C到所需的稀释。在抗菌实验,75%的解决方案使用蜂蜜,除非另有说明。

2.2。病原体

病原体(菌种保藏食品微生物和发酵,哥本哈根大学的食品科学、丹麦)包括用于这项研究(我)金黄色葡萄球菌CCUG 1800;(2)金黄色葡萄球菌1094 - 7;(3)葡萄球菌epidermidisCCUG 39508;(iv)铜绿假单胞菌SKN 1317;(v)大肠杆菌K 12。

2.3。过程和测量

为检测蜂蜜的抗菌效果样本agar-well扩散法应用使用脑心浸液肉汤(BHI) (CM0113)和BHI琼脂(CM1136)作为媒介,准备根据制造商的指示(OXOID有限公司贝辛斯托克,英国汉普郡)。

嗨琼脂在微波加热,然后冷却到50°C,并转移到无菌管30毫升琼脂和100年μL的病原体(BHI肉汤一夜之间传播)进行测试。琼脂是搅拌前涌入无菌培养皿和保存为30分钟在室温下固化。

井(5毫米)切成agar-dishes和50μL的蜂蜜样品是用移液器吸取到每个。Milli-Q水作为参考。盘子在37°C 48 h和孵化的直径增长抑制区测量厘米到0.05厘米。

识别的主要抗菌物质蜂蜜,测试执行:渗透压力,稀释的样本,热敏感,分别的影响,酶的敏感性。所有实验进行重复的蜂蜜样品,除非另有说明。

2.4。渗透作用

样本75%的蔗糖(w / w),对应于蜂蜜中糖的数量,是由稀释7.5 g在2.5 g无菌Milli-Q蔗糖水。样本15%的蔗糖(w / w),对应于20%蜂蜜样品中糖的数量,是由稀释1.5 g蔗糖为8.5 g无菌Milli-Q水。50μl纯糖样品放置在琼脂井和过程如上所述。

2.5。测试热敏感

500年μL(每个样本添加到埃普多夫管和加热60°C水浴或在一锅沸水(100°C) 30分钟。在测试之前。

2.6。测试甲基乙二醛的效果

两种稀释40%的甲基乙二醛水溶液(中科院78-98-8,SIGMA-ALDRICH)准备。0.02%的浓度(200μ10 g / mL)μl甲基乙二醛加入19.99毫升无菌水。0.04%的浓度(400μ20 g / mL)μl甲基乙二醛加入19.98毫升无菌水。

2.7。检测酶的敏感性

蜂蜜样品处理两种不同的酶,过氧化氢酶和蛋白酶k,调查可能的生物活性多肽的意义和H₂O₂。500年μl的蜂蜜样品(75%蜂蜜)是用移液器吸取两个埃普多夫管。一个示例添加50μl 10毫克/毫升蛋白酶K解决方案的K (CAS No。39450-01-6, SIGMA-ALDRICH) 1毫克/毫升的解决方案。另外500μl的蜂蜜样品添加10μl 50毫克/毫升的过氧化氢酶解决方案(CAS No。9001-05-2, SIGMA-ALDRICH) 1毫克/毫升的解决方案。

所有样品都在37°C孵化2小时之前填写测试井和如前所述。实验只进行了四节中提到的五个病原体2。2,从而排除铜绿假单胞菌SKN 1317年,由于没有显著的抑制活性在前面的实验。

2.8。pH值测量

使用校准PHM250 pH值测量进行了离子Analyzer-Radiometer分析。

2.9。分别以浓度测定蜂蜜

二羰基的决心蜂蜜进行根据亚当斯(12]。短暂的2毫升Milli-Q水混合0.6克的蜂蜜。随后,1.5毫升的稀释蜂蜜混合0.75毫升2%o苯二胺(门诊部当)(98%;σ,Steinheim,德国)磷酸盐缓冲剂(0.5米,pH值6.5;默克公司,达姆施塔特,德国),一式三份,剩下晚上derivatize(19小时)。衍生化后,样本过滤0.2μm过滤器和基于超高液相色谱分析的方法(UHPLC)所描述的Hellwig et al。13]。简而言之,百浪多息60的样品分离苯材料(250毫米4.6毫米,5μ米),一个警卫(Knauer,柏林,德国5列4毫米)充满了相同的材料和一个在线过滤器(3μ米),注射量是50μL,流量是0.7 mL / min,紫外检测312海里。洗脱液由0.075%醋酸(σ,Steinheim,德国)和洗脱液B是80%甲醇(σ,Steinheim,德国)和20%的洗脱液梯度是如下:10%到50% B从0到27分钟。一个线性渐变,50% B从27到30分钟保持不变。从50%到70%,增加B从30到34分钟。由一个线性渐变随后B 44分钟增加到100%。保持不变,从44到48分钟。,finally back to 10% B from 48 to 50 min. by a linear gradient. A standard curve was prepared with the quinoxaline of MGO (Sigma, Steinheim, Germany) in the range between 0.4 μ克/毫升,20μ克/毫升。

2.10。统计分析

数据被认为正常的分布,进行了统计分析使用Excel v15.26和容易2016 v6.1.60 t和单向方差分析测试。此外,测量的最小二乘方法(lsmeans)应用于数据采用两两比较的数据(阿尔法= 0.05)由软件RStudio (0.99.446 RStudio团队(2015),版本,RStudio:集成开发r . RStudio, Inc .,波士顿,MA)。

3所示。结果

所有丹麦蜂蜜的抗菌效应(p < 0.05),有机蜂蜜样品2(混合有机植物),薄荷水(各种aquatica)和林登(椴树属cordata)甚至拥有特定的活动大肠杆菌和铜绿假单胞菌,而医疗级麦卢卡(l . Scoparium蜂蜜没有显示出活动对这些物种。没有明显差异(p > 0.05)所有样本的重复测试和所有控件之间没有任何明显的价值在不同的实验。测试结果的一个例子后,琼脂扩散法提出了图1。

的柱状图数据2和3披露蜂蜜样品的抗菌效果。薄荷水(m . aquatica),林登(t . cordata)和有机2(混合有机植物)能够抑制所有的检测病原体,显示最大的抑制区和有显著(p < 0.05)影响革兰氏阴性细菌。蜂蜜的抗菌效果是最大的三个革兰氏阳性病菌比革兰氏阴性细菌。两个蜂蜜山楂(Crataegus monogyna)和Activon麦卢卡(l . scoparium)显示,至少有三个革兰氏阳性的抑制作用葡萄球菌和无法抑制这两种革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌。商业蜂蜜,雅各布森,没有抗菌效果的测试。

3.1。渗透作用

纯糖蔗糖(75%和15%)样品上没有显示任何抑制五个选定的病原体。

3.2。热敏感

蜂蜜样品的热处理显示减少抑制性影响检测病原体。蜂蜜样品的热处理在30分钟100°C。抑制在所有蜂蜜样品抗菌效果;然而,蜂蜜样品希瑟(Calluna寻常的)、覆盆子(悬钩子属植物odoratus)、油菜籽(芸苔属植物显著),有机2(混合有机植物),薄荷水(m . aquatica),和林登(t . cordata)能够抑制微生物生长的一些病原体在60°C(热处理后图4)。

3.3。分别的影响

单纯采用解决方案包含200μg / mL或400年μg / mL四有抑制作用的5个检测病原体,铜绿假单胞菌样品被排除在研究由于污染。在400年的浓度μg / mL分别,一个抑制作用被认为在所有四个检测病原体和显著(p < 0.05)高于200μg / mL分别在三个测试的病原体(金黄色葡萄球菌(1094 - 7),美国epidermidis,大肠杆菌)。

3.4。蛋白酶k的影响

所有样本显示不同的抑制效果不同的细菌。为金黄色葡萄球菌(1094 - 7),有机蜂蜜样品1(混合有机植物),油菜籽(显著)、薄荷水(m . aquatica)、山楂(c . monogyna)和贝尔希瑟(艾丽卡tetralix)有显著(p < 0.05)降低蛋白酶k治疗后活动。为s . epidermidis可比的结果观察与覆盆子(r . odoratus)、山楂(c . monogyna贝尔)和加热器(大肠tetralix)(p < 0.05)。为大肠杆菌蛋白酶k治疗导致显著(p < 0.05)降低九13的蜂蜜样品,和六个样品完全失去了抑制作用(表2)。

3.5。过氧化氢酶的影响

用过氧化氢酶治疗废除所有丹麦蜂蜜样品的抗菌效果,而Activon麦卢卡(l . scoparium)保持显著的抗菌效果。葡萄球菌(1094 - 7)epidermidis(p < 0.05) (表3)。

3.6。pH值在蜂蜜

14蜂蜜样品有不同pH值在3.25和3.77之间(意思是:3.49和标准的变化:0.14)(图5)。

3.7。蜂蜜样品中甲基乙二醛

的浓度分别在Activon麦卢卡(l . scoparium在原始的麦卢卡蜂蜜),(l . scoparium分别是54.33μ和6.29克/毫升μg / mL,这些浓度均明显高于其他蜂蜜样品(图6)。

4所示。讨论

这是第一次研究证明蜂蜜来自丹麦的植物表现出抗菌效果。这个生物效应是对一些蜂蜜类似于或高于麦卢卡的抗菌效果(l . scoparium)亲爱的,特别是关于革兰氏阴性微生物的抑制作用。行动的机制主要是由于H的内容₂O₂现在在丹麦蜂蜜。采用较低的内容在丹麦蜂蜜医疗级麦卢卡(相比l . scoparium蜂蜜,这个植物化学的物质的影响在丹麦蜂蜜的抗菌效果可能是小巫见大巫。

明显差异可以观察到的植物来源的抗菌效果蜂蜜薄荷水(m . aquatica),林登(t . cordata)和有机2(混合有机植物)拥有最稳定在所有检测病原体的抗菌效果。同时,商业烹饪加工的蜂蜜不显示任何抑制病原体。这个结果,从纯糖样品,结果表明,抗菌效果不仅仅是条件蜂蜜中糖含量。

革兰氏阳性目标菌株是最容易蜂蜜而革兰氏阴性细菌对所有包括麦卢卡蜂蜜样品(不太敏感l . scoparium),这是按照以前的观测(9,14]。抗菌药物敏感性的差异蜂蜜和其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间可能是由于细胞壁的组成。革兰氏阳性细菌没有一个外膜保护肽聚糖层与革兰氏阴性细菌对抗菌药物更容易渗透,造成损害15]。

H的生产₂O₂葡萄糖氧化酶的存在于蜂蜜被认为是一个重要因素整体蜂蜜的抗菌效应(16]。但浓度没有达到的水平被认为是细胞毒性(17),这可能是相关的应用的蜂蜜作为治疗伤口护理(18]。在本研究观察到治疗蜂蜜样品与过氧化氢酶、酶抑制葡萄糖氧化酶从而生产的H₂O₂,显著降低所有丹麦蜂蜜的抗菌效果。但是,麦卢卡的抗菌效应(l . scoparium)蜂蜜的一些革兰氏阳性菌株不受影响。这一发现是依照以前的观测,比H水平的重要因素₂O₂占这种蜂蜜的抗菌效果(1,19]。证实采用,至少在更高的浓度(400μg / mL),有抗菌效果,一起发现高水平的分别以麦卢卡(l . scoparium)蜂蜜样品,这种物质可以负责大部分已报道这蜂蜜的抗菌效果(19]。相比之下,丹麦蜂蜜分别以非常低的水平,这就是为什么这种物质具有很少或没有意义,这些特殊的蜂蜜的抗菌作用类型。另一方面,研究表明,蜂蜜与H₂O₂端依赖活动可能更广谱抗真菌药治疗有用比麦卢卡蜂蜜,因为他们被发现比麦卢卡蜂蜜更有效抑制皮肤真菌菌(20.)和物种的酵母假丝酵母(21]。

除了生产和H的内容₂O₂或采用其他属性的蜂蜜可能导致整体对细菌的影响。蜂蜜的含水量较低和高同渗重摩和粘度,酸性pH值,leptosin和多肽bee-defensin-1都发现有助于减少细菌生长(22]。蜂蜜的低pH值似乎并没有成为当前研究的一个重要因素。高同渗重摩认为增加蜂蜜的抗菌效果。然而,从我们的实验中,高浓度的葡萄糖就没有任何抑制细菌生长。此外,加热预处理商业蜂蜜没有抗菌效果,尽管认为高水平的糖。其他的研究也表明,葡萄糖的解决方案具有更少的抗菌效果比蜜(23),sugar-induced同渗重摩在蜂蜜只是视为导致病原体的不利的环境,而不是一个主要在细菌生长抑制因子。

为进一步表征背后的机制在丹麦蜂蜜的抗菌效果,生物活性肽研究的参与通过添加蛋白酶k不同蜂蜜样品。蛋白酶k将分裂的蛋白质,从而灭活等生物活性肽defensin-1 [5]。Defensins抗菌肽创建保护宿主细胞入侵和感染的病原体(24]。我们发现总体规模较小的抑制区琼脂板和病原体之间的一些差异和蛋白酶k的蜂蜜类型后的应用程序进行测试。之前就有报道称,有差异的存在bee-defensin-1在不同种类的蜂蜜9]。我们的研究显示减少影响细菌生长后添加蛋白水解酶,这是表明参与的生物活性肽。然而,和其他方法进一步的研究来阐明如果丹麦蜂蜜含有生物活性bee-defensin-1。

在整个实验中,agar-well扩散法是应用和使用蜂蜜75%的解决方案,为实际的原因,确定蜂蜜样品的抗菌效果。蜂蜜的75%溶液对细菌生长有显著影响,而没有影响蜂蜜的20%解决方案。这一发现也申请麦卢卡(l . scoparium)蜂蜜。完善,agar-well扩散法是适合测试抗菌效果,但如果最低抑制浓度(MIC)计算,更敏感的方法如琼脂或肉汤稀释,直接并入到蜂蜜的琼脂增长媒体必须使用(25]。通过这种方法微生物带入测试抑制物质直接接触,从而不依赖于扩散通过琼脂媒体代理的能力(26]。

由于蜂蜜的物理特性,它可能导致潮湿的环境,这是有利于伤口愈合27]。此外,蜂蜜可以刺激免疫反应,减少炎症,进而导致加速伤口愈合(1,28,29日]。此外,蜂蜜也可能减少手术伤口清创术在选定的情况下(18,30.]。然而,如果蜂蜜是应用作为医学治疗伤口护理是必要的为灭菌处理蜂蜜为了消除可能存在的病原体或c .肉毒孢子(11应该[执行],为什么通过γ辐照灭菌10]。蜂蜜的抗菌活性无显著变化被发现由这个方法灭菌的蜂蜜,蜂蜜与H₂O₂端依赖活动或在麦卢卡蜂蜜10]。此外,没有发现显著变化造成蜂蜜的理化和矿物质的内容从γ辐照灭菌的31日]。加热蜂蜜的过程将会消除病原体也降低H的活动₂O₂和其他抗菌物质。这是验证本研究中样品的抗菌活性被抑制在大多数通过加热蜂蜜到60°C。

5。结论

这是第一个研究提供大量在体外蜂蜜的抗菌效果的调查来自丹麦各种植物。我们验证了伟大的变化在不同的花卉与水源薄荷(m . aquatica),林登(t . cordata)和有机2(混合有机植物)拥有最高的抗菌活性的检测病原体。这些丹麦蜂蜜可比,甚至优于商业医疗级蜂蜜。抗菌效应可能是由于H的活动₂O₂的,虽然没有直接测量这种物质的浓度。其他研究也能够验证蜂蜜的抗菌活性的变化取决于地理位置和花源(26,32]。

由于觅食的蜜蜂是不完全可控,取决于主导花源集合的时候,这将是几乎不可能标准化自然monofloral蜂蜜。因此,它是合理的假设一个特定的植物来源的蜂蜜也建立在一定比例的非特异性的花蜜。然而,虽然蜂蜜的抗菌活性可能是一个障碍的结果影响蜂蜜的植物化学的特点、pH值、粘度、和内容的H₂O₂蜂蜜,混合使用不同的类型可能优于monofloral蜂蜜。需要进一步的研究来阐明这一假设和决定我们的结果在体外实验也适用于临床设置。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

这项研究没有收到任何特定公共拨款资助机构,商业,或非营利部门。

的利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者同样造成了上述。

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