受损的皮肤伤口愈合一个诱导一氧化氮Synthase-Knockout鼠标

文摘

背景。我们调查的影响损失的诱导一氧化氮合酶(间接宾语)皮肤切除损伤的愈合过程通过使用iNOS-null (KO)老鼠。造粒人口约细胞类型,即myofibroblasts和巨噬细胞生长因子的表达,reepithelialization评估。方法。KO和野生型(WT) C57BL / 6小鼠背景。在全身麻醉下两轮全层切除伤口直径5.0毫米的生产背皮肤。治疗特定的间隔后,肉眼观察、组织学、免疫组织化学和实时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),用来评估治疗过程。结果。伊诺的损失阻碍伤口肉芽组织形成和reepithelialization切除小鼠模型。详细的分析表明,myofibroblast外观,巨噬细胞浸润,mRNA的表达转化生长因子b和胶原蛋白1α2都是由缺乏伊诺镇压。结论。伊诺是必需的皮肤伤口愈合的过程中。缺乏伊诺阻碍巨噬细胞的入侵及其表达纤维发生的组件,可能会进一步削弱纤维发生的成纤维细胞的行为。

1。介绍

快速和组织良好的伤口愈合皮肤是至关重要的健康维护,减少细菌污染的风险,抑制水损失,抑制疤痕形成,可能会扰乱器官功能,等等。因此,皮肤伤口愈合的机制是很好理解的为了发展策略来克服受损伤口愈合的条件如压力溃疡和糖尿病伤口。

皮肤伤口愈合的过程阶段的总体由所谓的止血,增殖和成熟1- - - - - -3]。“止血”是第一阶段的阶段防止过度失血和触发事件导致中性粒细胞和巨噬细胞的炎症。炎症是紧随其后的是局部组织细胞的性能,也就是说,角化细胞和成纤维细胞。前细胞首先迁移到受伤部位为主要内容,开始增殖恢复分层。后者的myofibroblast变换能产生细胞外基质(ECM)和组织萎缩。细胞角化细胞迁移和fibroblast-myofibroblast转换的活动很大程度上取决于有效的生长因子,转化生长因子β(TGFβ),尽管一组生长因子被认为策划组织修复的整个过程(3]。

一氧化氮(NO)是与伤口愈合的细胞和分子的事件方面,也就是说,血管扩张,血管增生,炎症、组织纤维化或免疫反应(4- - - - - -6]。这些报告的总体建议没有合成简单的皮肤伤口愈合是至关重要的。然而,争议性的研究结果报道在类型的伤口模型(7,8]。没有生产是由诱导一氧化氮合酶(间接宾语)监管独立于细胞内钙海拔(9,10]。初始损伤炎症细胞的浸润,也就是说,中性粒细胞和巨噬细胞,成纤维细胞的重新myofibroblast及其转换,和新血管形成以及角化细胞迁移和增殖。TGF的主要来源β在组织修复过程被认为是巨噬细胞。刺激巨噬细胞受伤组织的招聘没有(11- - - - - -13]。此外,据报道,没有调节TGF的表情β(7]。因此推测,没有可能会影响皮肤损伤的愈合过程。

为了解决这个问题,在目前的研究中我们把鼠标线的可用性的一个优势C57BL / 6背景缺乏伊诺基因在我们的实验室。明显处于劣势的皮肤伤口愈合过程的定性评估,我们调查的统计分析关闭环形切除损伤的发生率在老鼠的背侧皮肤愈合的间隔,采用宏观观察、组织学、免疫组织化学、检测的mrna使用即时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr)。我们的统计分析表明,主要治疗切除皮肤损伤是受损失的间接宾语与人口和纤维发生的基因表达抑制巨噬细胞。

2。材料和方法

实验通过DNA重组实验委员会和和歌山医科大学动物保健和使用委员会。

2.1。切除伤口模型小鼠

iNOS-knockout (KO)和野生型小鼠(WT),这两个背景C57BL / 6和8到10周大,被用于实验。在全身麻醉下与戊巴比妥钠腹腔内政府(70毫克/公斤体重)14,15),背部的毛发剃,暴露在外的皮肤与70%乙醇擦拭。两轮全层切除伤口直径5.0毫米被捡在背侧皮肤褶皱皮肤在中线和使用无菌一次性活检环钻(Kai产业、岐阜、日本)和手术刀片我们之前报道的16]。伤口安排在同一时间进行了纵向的。氧氟沙星软膏(0.3%)是局部应用于伤口每天减少细菌污染的风险在第一次7 postwounding天。鼠标有明显排除感染的迹象。

2.2。宏观上观察

六KO和6 WT老鼠用于分析宏观的发现。伤口被拍到与SZ-PT(奥林巴斯、东京、日本)每隔愈合(0、1、3、6、8、11和14天)。剩余的皮肤缺损的大小(如最初的伤口面积的百分比)被评估使用Photoshop软件(版本8.0,奥多比系统、东京、日本)和统计分析。

2.3。组织学愈合组织

32 KO和32 WT老鼠被杀死在特定时间间隔的治疗(3、6、8、11和14天)与过量的乙醚处理和组织学。两轮切除伤口包括上皮边缘切除5.0毫米直径环钻无菌一次性活检和手术刀片。组织切除伤口和4.0%多聚甲醛固定在0.1 M磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)48小时和嵌入在石蜡处理和组织学。石蜡部分5μ米厚被削减和苏木精和伊红染色(他)。我们测量的厚度肉芽组织的两个点后伤口愈合;一个点的中心区域的最小厚度是肉芽组织;另一个是边缘区与肉芽组织的最大厚度(17]。这些数据的肉芽组织的厚度进行了统计分析。Masson-Goldner三色的染色也进行了可视化的胶原结缔组织再生愈合组织。

2.4。Reepithelialization切除皮肤伤口愈合

我们进一步分析了reepithelialization切除皮肤伤口愈合KO和WT老鼠以特定的间隔愈合的组织学水平(3、6、8、11和14天)。为此我们使用纸巾沾Masson-Goldner三色的。reepithelialization原伤口面积的百分比计算如下:reepithelization(%) =(距离由上皮)×100 /[原伤口边缘之间的距离][18- - - - - -21]。

2.5。免疫组织化学

免疫组织化学分析的评价细胞组件再生组织。Deparaffinized部分为间接免疫组织化学处理之前报道(22,23]。使用下面的抗体(22,23];单核细胞/巨噬细胞的存在是通过检查鼠单克隆F4/80 anti-macrophage抗原抗体(克隆A3-1, 1: 400;8月,瑞士,BMA生物医学)。鼠标单克隆抗-α光滑的肌肉肌动蛋白(α(SMA)抗体克隆1 a4, 1: 100;Neomarkers弗里蒙特,CA)是用于检测myofibroblast。两个视觉字段(×400)是选择从每个伤口床的边缘;其他三个从中间选择在受伤后伤口床6和8天。F4/80-positive巨噬细胞的数量和myofibroblasts探测到αSMA表达在伤口床上列举了这五个视觉领域(24,25]。

2.6。检测mrna使用实时逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

两个圆的直径5.0毫米的伤口用环钻,背叶片的皮肤24 KO和24 WT老鼠。提取RNA,一轮新愈合的组织切除使用环钻和同样大小的叶片作为最初的伤口在3天,6和8和储存在冷藏器(−80°C)。总RNA是获得使用σGenEluted™哺乳动物总RNA Miniprep工具包(Sigma-Aldrich有限公司、圣路易斯、钼)如前所报道(26- - - - - -28]。mrna的表达αSMA、F4/80转化生长因子β1 (TGFβ1),和胶原蛋白1α2新再生组织被rt - pcr进行评估。TaqMan一步法rt - pcr主混合试剂包和应用生物系统公司棱镜7700 (PE应用Biosysems,福斯特城,CA)被用作前面描述的(26- - - - - -28]。寡核苷酸探针和引物设计根据基因库的互补脱氧核糖核酸序列数据库使用引物表达软件(PE应用生物系统公司)。

2.7。统计分析

所有参数的均值和标准差计算确定在本研究中。统计上的显著差异被使用不成对学生的评价以及。被接受为显著。

3所示。结果

3.1。宏观发现伤口愈合的

评估KO的背切除伤口的愈合过程和WT老鼠,我们检查了剩下的皮肤缺损区域的大小(如原始伤口大小的百分比)在每个治疗间隔(图1(一))。受伤后的一天,皮肤缺损的KO小鼠相似的形态与WT老鼠。时间点的3、6、8日和11日,剩余的皮肤缺损比WT KO小鼠大鼠具有统计上的显著差异(图1 (b))。在WT老鼠,伤口区域被减少到50%的原始伤口区域在受伤后第三天。相比之下,KO小鼠伤口地区仍然保持在50%甚至在伤后6天。在伤后第14天,皮肤缺陷没有这样的区别。这些观察表明,全层皮肤伤口的愈合延迟在伊诺的缺失。

3.2。组织学分析,肉芽组织形成

真皮的缺陷被新形成的肉芽组织逐渐关闭,皮肤愈合过程中表皮覆盖着。为此我们采用组织学观察他染色(图2(一个))。我们测量的厚度肉芽组织中心和边缘区在伤口愈合我们之前报道的。结果表明,肉芽组织在中心区域的厚度薄在KO小鼠在WT老鼠天与统计上的显著差异(图6和82 (b))。在边缘地带,肉芽组织的厚度明显变薄KO小鼠比WT老鼠一天6(图2 (c))。

3.3。评价Reepithelialization

新形成的肉芽组织的全层皮肤的伤口与reepithelialization角质细胞。我们评估皮肤伤口愈合的reepithelialization KO和WT组织沾Masson-Goldner三色的治疗以特定的间隔(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。在受伤后第一天,复层上皮的再生无法观察到在WT和KO小鼠(数据没有显示)。在损伤后3天,似乎没有过程的差异reepithelialization KO和WT老鼠之间。Reepithelialization显著延迟在KO小鼠天6和8的统计差异与WT老鼠(图3 (e))。最初的伤口是完全与上皮覆盖天11 WT和KO小鼠。结果表明,伊诺的损失阻碍reepithelialization的角化细胞的切除皮肤损伤愈合的过程。

3.4。免疫组织化学分析

蜂窝组件在新的肉芽组织的本质是通过免疫组织化学方法评估。虽然炎症细胞渗透愈合组织,据报道,巨噬细胞肉芽组织的形成发挥了关键作用或通过生长因子的表达新血管形成。图4表明F4/80-labeled巨噬细胞的免疫组织化学检测一天6。巨噬细胞的浸润KO愈合组织也减少了与WT老鼠在天6和8受伤后(图相比有统计学意义被4 (e))。

图5显示的免疫组织化学分布myofibroblasts探测到αSMA表达一天6。myofibroblasts抑制了人口的损失伊诺天6和8受伤后与WT小鼠相比具有统计学意义(图5 (e))。这些结果表明,抑制巨噬细胞入侵和myofibroblast外观可以解释肉芽组织形成的衰减和合成上皮重现KO愈合组织。

3.5。信使rna的表达WT和KO小鼠的正常皮肤

我们检查了基底的表达水平αSMA、F4/80 TGFβ1,和胶原蛋白1α2通过执行实时rt - pcr KO和WT老鼠的皮肤组织。虽然变化的数据在每个动物似乎更大,数据显示明显区别WT KO小鼠。的表达αSMA、F4/80 TGFβ1 mRNA在KO更明显正常皮肤组织与WT组织(数字6(一)- - - - - -6 (c))。没有显著差异的胶原蛋白- 1的表达水平α2 KO和WT组织(图之间的信使rna6 (d))。

3.6。基因表达在新再生组织的愈合伤口

然后,我们评估F4/80 mRNA的表达模式,TGFβ1,αSMA和胶原蛋白1α2在愈合组织KO和WT老鼠在3天,利用实时rt - pcr 6和8。F4/80 mRNA表达增加愈合过程中两种基因型的老鼠。虽然变化的数据在每个动物似乎更大,数据显示明显区别WT KO小鼠。这些组件的表达显著抑制在KO组织与WT相比组织一天6(图7(一))。TGF的表达β1 mRNA在愈合组织也增加了,大大减少在KO组织与WT组织相比天6和8(图7 (b))。的表达αSMA mRNA在KO组织明显减少明显与WT组织在第八天(图7 (c))。胶原蛋白1α2 mRNA表达减少在天KO组织与WT相比组织和统计上的显著差异(图3和87 (d))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,背一个环形切除伤口愈合的皮肤明显受损的老鼠伊诺的损失。组织学显示肉芽组织的形成和reepithelialization都减毒KO小鼠与WT老鼠在每一个特定的时间点。伤口没有合成通过阻断抑制NOS活性和基因敲除据说影响伤口愈合,特别是胶原蛋白合成(7,8,29日- - - - - -31日),符合当前的研究。

我们目前的免疫组织化学分析和实时rt - pcr进一步证实了组织学的研究成果;入侵的巨噬细胞和myofibroblast外观都是镇压缺乏伊诺。据报道巨噬细胞发挥重要作用在皮肤的愈合生长因子的表达一组包括TGFβ(32]。尽管各种生长因子参与组织修复的过程中,TGFβ是最重要的一个配体参与调控细胞行为在组织修复的生理或病理过程33]。本研究表明,TGF的表情β1 mRNA明显减毒在KO愈合组织与WT组织相比天6和8。先前的研究表明,没有参与TGF的迁移和活化β1巨噬细胞(34与结果相吻合)。myofibroblasts和临时积累细胞外基质逐渐取代胶原矩阵,大概由于TGF的作用β1 (35,36]。实时rt - pcr也表明,胶原蛋白1的mRNA的表达α2少KO小鼠组织与WT组织损伤后在天3和8。以前的报告表明,iNOS-null成纤维细胞扩散较慢,合成胶原蛋白,简约fibroblast-populated胶原晶格慢于WT成纤维细胞(4]。减少组织TGFβ1级的减少可以解释myofibroblast外观和胶原蛋白的表达。然而,在TGF受伤组织表达水平β1,αSMA、F4/80和胶原蛋白相比我更高KO鼠标WT组织。详细的机制,该机制可以解释现象被发现。

上皮细胞迁移是由TGFb积极调制/ p38信号(37]。减少组织的TGFb1水平可以解释上皮愈合的衰减伊诺的缺失。虽然在正常人皮肤损伤是修理完善,受损的糖尿病患者或压力溃疡愈合是被克服。减少没有水平衰减等组织与组织修复条件。战略供应不被认为是一个有效的治疗皮肤伤口愈合受损。

5。结论

目前的研究表明,伊诺是必需的皮肤伤口愈合的过程中。缺乏伊诺阻碍巨噬细胞的入侵及其表达纤维发生的组件,可能会进一步削弱纤维发生的成纤维细胞的行为。

信息披露

机构的网页是http://www.wakayama-med.ac.jp/med/eccm/intro/staff/core/index.html。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持由教育部、科学、体育和文化的日本(C16K10834 Hiroshi山田,C25462829 Maki重击,C15K10878 Yuka冈田克也、C25462729, Shizuya Saika,和C23592173 Munehito Yoshida)和NEI眼研究格兰特EY021510(小丑)。

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