生产的自对准支架,免费的外源性物质,从真皮成纤维细胞通过自组装技术

文摘

许多皮肤疾病,特别是衰老和癌症,包括修改的矩阵排列。这样的组织重组可能影响细胞行为和/或更多的全球生物过程。组织工程提供了准确的研究模型通过模拟皮肤和它允许建设的多功能立体的模型使用人类细胞。它也避免了使用动物,有时nontranslatable结果。在现有的各种技术中,自组装方法允许生产的本地附近的皮肤,免费的外源性物质。培养人类皮肤成纤维细胞在抗坏血酸盐的存在后两周,期间的重播这些细胞发生后高程的基质对透水戒指和文化追求另一个两个星期。这个协议产生明确的调整矩阵纤维和细胞与地平线平行。这种拉伸重建组织的厚度减少而产生的基质的标准技术。细胞数量也减少了。总之,一个新的、简单,廉价的方法来产生一致的组织免费的外源性物质在皮肤可用于基础研究应用。

1。介绍

自组装技术允许生产支架无外源物质从各种来源的间充质细胞如皮肤成纤维细胞(1,2),角膜,可见3),膀胱间质细胞(4),和脂肪基质细胞(5]。间充质细胞产生、分泌和组装细胞外基质(ECM)。这种方法繁殖生理矩阵附近环境,重建工程组织可以用来模拟一些疾病(例如,伤口愈合,疤痕6],硬皮病[7],牛皮癣[8],黑色素瘤[9),或皮肤的肌萎缩性脊髓侧索硬化症10])。

细胞或基质纤维的取向起着关键作用,调节细胞外基质沉积(11,12和改造13),细胞迁移(13],分化[12,14和扩散15),以及组织中细胞的力学性能是嵌入式16- - - - - -19]。病态涉及修改对齐的矩阵有很多,例如,癌症[20.),皮肤laxa [21),眼睛巩膜在糖尿病22),或青光眼(23]。老龄化还包括胶原纤维取向的变化(24- - - - - -26和肉毒杆菌毒素治疗可以改善胶原纤维排列27]。各种技术已经使用在过去生产一致矩阵。这些技术涉及的几个可以使合成支架的生物相容性(28,29日)或要求复杂的材料(30.),如微型图象(31日- - - - - -33)或化学改性表面(34,35]。

人类寿命的扩张,两个医疗条件提高对皮肤的组成和结构的变化:衰老和癌症。此外,光老化,引起的太阳下的无保护的皮肤的博览会,吸引了很多皮肤科医生的注意。居民在衰老真皮成纤维细胞呈现高浓度的基质金属蛋白酶(MMPs)诱导改造和皮肤变薄平板方面导致的损失epidermis-dermis结(乳头状结构36,37]。还发现,一个排列的胶原纤维附近的癌前病变的行为可能会影响新生的肿瘤。肿瘤导致的ECM的改造调整,加强调制通过整合蛋白和圆—圆相关蛋白激酶(岩石)由几个分子如基质金属蛋白酶,syndecan-1,同事(LOX) yes-associated蛋白质(笨蛋),caveolin-1,转化生长因子(及),成纤维细胞激活蛋白(FAP)和血小板源生长因子(PDGF),而且刚度等物理条件,压力,或间质流(38]。癌症myofibroblasts,通过沉淀和ECM萎缩,也有助于修改这个微环境36]。在肿瘤的生长质量,缺氧诱导的肿瘤促进改造和加强矩阵(39]。矩阵的一致性在肿瘤的发展中扮演着重要角色(40),特别是在它的侵袭性和转移性潜力(41- - - - - -43]。

矩阵的组织,特别是胶原纤维取向,及其对细胞的影响研究使用动物模型或组织工程技术,如上面描述的一个。细胞对拉伸或机械负荷调整细胞外基质(44- - - - - -47]。这种重组胶原纤维使适应新的生理条件(48]。这个特性可以用来生产组织与胶原纤维排列使用自组装技术。本研究提出了一种新的技术生产组织,无外源性材料和相对廉价的,矩阵纤维和细胞水平对齐用于临床应用(如果组织需要更多的结构,如角膜基质)或基础研究(从癌细胞繁殖真皮或老化的人)。除了一个塑料环提升构造,不需要特殊的材料。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

伦理性考量:所有程序涉及患者根据《赫尔辛基宣言》和当地的研究伦理委员会批准。知情同意的捐赠者获得标本。人真皮成纤维细胞(神奇动物)被用作生产基质间充质细胞。皮肤活检是来自健康的捐赠者在整形手术。皮肤标本被在磷酸缓冲盐(PBS)含100 U /毫升青霉素(σ,奥克维尔,加拿大),25毫克/毫升(先灵葆雅、Pointe-Claire、加拿大)、庆大霉素和0.5毫克/毫升二性霉素b(百时美施贵宝,蒙特利尔,加拿大);然后是1毫米的切成小块。当时在4°C的环境在一夜之间有10毫升的解决方案包含500毫克/毫升嗜热菌蛋白酶(σ)与1毫米CaCl消息灵通的缓冲区₂,pH值7.4。第二天,真皮手工分离的表皮和孵化与搅拌3小时37°C 0.125 U /毫升溶液胶原酶H(罗氏诊断加拿大,蒙特利尔,加拿大)稀释Dulbecco-Vogt修改鹰的介质(DMEM,表达载体,伯灵顿,加拿大)含10%胎牛血清(Hyclone,洛根,UT), 100 U /毫升青霉素、庆大霉素和25毫克/毫升(神奇动物中)。离心收集的Fb被播种在培养瓶6×10⁴细胞/厘米²在Fb介质和培育37°C湿润有限公司8%₂的气氛。交换媒介是每周3次。三个细胞群。

2.2。工程基质生产

在通过三个被播种在融合培养Fb (4×10⁵神奇动物)在6-well板块包括锚具和培养在facebook中补充50μg / mL抗坏血酸盐为14天。基质上脱离了塑料和允许躺在井底(标准)或另一边翻和允许躺在井底(“翻转”)或高渗透塑料环(“拉伸”)。然后第二个播种。facebook被播种,形成一个融合性的层的顶部基质片(4×10⁵神奇动物)。在拉伸条件下,培养基添加了三个小时后完全淹没。在播种步骤,添加包含facebook创建一个光的介质抑郁的中心足以维持介质和细胞基质单尽管表面覆盖。摘要安克雷奇是完全重叠的塑料环;所以组织是不接触的塑料。文化是追求14天与facebook中补充额外50μg / mL抗坏血酸盐(图1)。渗透塑料环图中描述的是一个树脂玻璃设备2。

2.3。组织学分析

每个样本的部分被固定在HistoChoice组织固定剂(Amresco,梭伦,哦);然后他们从组织的四个矩形的中心约4毫米长度和高度1.5毫米(具体尺寸可以随侦探的能力)。在HistoChoice一夜孵化后,他们在石蜡嵌入。组织学部分5μ米被削减和染色使用马森的三色的(太)。

2.4。矩阵纤维角度的决心

矩阵纤维角度与视野评估使用照片和Axio成像仪M2显微镜(卡尔蔡司)和分析ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)测量25日完成每一幅太滑。打开后的图片文件(可以是提交给一个旋转的水平图像组织),5水平和5竖线的网格应用于组织照片。角的地平线的部分纤维25交点对应生成测量使用线按钮和分析/测量功能。值调整以适应在一个范围从0到90度。例如,−= 20度160度或175度等于5度。如果没有纤维交点,最近的纤维被选中。因此,有25个角措施/形象。

2.5。比长度/宽度的细胞嵌入到基质中

长度/宽度比例的细胞基质中嵌入评估使用照片和Axio成像仪M2显微镜(卡尔蔡司)和分析ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)测量10日在三个不同的照片太幻灯片。打开后的图片文件,紫色/粉色结构对应于相关的细胞识别和使用线按钮2线做一个十字的中心推测细胞的细胞核(当细胞似乎波浪,几个连续的线可以使用)。这些线的长度可以根据分析/测量功能。更大的测量是与细胞的长度和降低测量的宽度。

2.6。厚度的测定

基质厚度是评估使用照片和Axio成像仪M2显微镜(卡尔蔡司)和分析ImageJ软件(NIH,马里兰州贝塞斯达)25日为每3 MT测量做图片/重建组织。

2.7。细胞密度测定

细胞数量和细胞密度评估使用照片和Axio成像仪M2显微镜(卡尔蔡司)通过计算细胞10片重建组织。值被规范化为标准条件获得的价值。

2.8。统计分析

值表示为平均值±标准错误的意思。使用学生的进行了统计分析以及比较两个数据集。建立了水平的意义。

3所示。结果

3.1。组织生产的组织使用标准的或“翻转”技术显示明显的差异而产生的组织使用“拉伸”条件

马森的三色的染色后,切片的组织产生了使用标准(图3(一个))或“翻转”(图3 (b))技术提出了一个同质和紧凑的矩阵分布大致相似的细胞。此外,矩阵似乎纤维随机波浪和组织。相比之下,使用“拉伸”技术生产组织和清晰的矩阵纤维和细胞水平对齐,即使矩阵保持紧凑,细胞均匀分布(图3 (c))。

3.2。“拉伸”技术诱导调整矩阵的纤维和细胞工程组织而产生的的标准或“翻转”方法

组织产生的标准或翻转技术产生一个矩阵,其中纤维染色马森的三色的技术角度提出不同的从地平线从0到60度。意思是(标准偏差)的彩色纤维角度为25.1度15.4和26.616.2标准和“翻转”组织,分别(图4)。没有明确的方向排列的纤维或细胞在这些组织可以看到相反,当“拉伸”技术是用于生产组织。在这些情况下,所有的纤维0之间提供了一个角度,从地平线(图10度4)。意思是(标准偏差)的彩色纤维角是1.682.95“拉伸”组织(显著不同标准和“翻转”)。

3.3。嵌入在细胞基质更平坦的组织产生的“拉伸”技术比使用标准的协议

之间的比率最大长度、最大宽度的细胞包含在重建结果进行分析以确定矩阵的取向纤维细胞的形态有影响。值为- 1指示圆细胞;值0表示几乎线性细胞附近。细胞的组织重建使用标准的技术比是0.390.10与0.100.01细胞嵌入“拉伸”协议,产生的结果N= 3,,值< 0.04(图5)。

3.4。组织的细胞计数和厚度减少组织生产相比,使用“拉伸”技术标准和“翻转”技术

组织的厚度生产使用“拉伸”技术相比显著降低(−18%)(图与其他两个条件6(一)):88.6μ米3.1(“拉伸”)与122.7μ米32.4(标准)或120.2μ米32(“翻转”),。没有增加染色的不同组织不管所使用的技术。“拉伸”的细胞数量也显著降低了组织与其他技术相比(图6 (b)):18.12.5和253.2和27.83.5标准和“翻转”组织,分别是()。然而,所有的组织的细胞密度保持类似的生产:226.4 / c细胞2.3,257.330.9和227.834.2标准,“翻转”和“拉伸”,分别。

4所示。讨论

在历史的角度来看,自组装技术在于叠加矩阵表由培养成纤维细胞在抗坏血酸盐为4周(49,50]。这种技术被称为“表叠加自组装”在这个文本。这里,“表叠加自组装”技术的一种变体,称为“重播自组装”,曾经,成纤维细胞在2周后受移植者,不需要叠加一步。文化被追求额外2周。组织生产使用标准”再播自组装”,在这项研究中,表现出更多的同质分布在基质的细胞没有空间描述矩阵表等当细胞堆积在“表叠加自组装”技术51]。这些技术之间的区别是很重要的。在“表叠加自组装”细胞主要是发现底部的基质表与ECM建议他们几乎没有联系,而成纤维细胞被发现在整个重建组织“重播自组装”协议时使用,建议与ECM细胞有更多的接触。

在几项研究中,复杂的技术评估使用染色和观察胶原纤维排列与偏振光或双光子技术结合使用快速傅里叶变换。我们选择了一种更轻的分析由于明显的差异之间的结果我们的实验条件。因为我们不能假定在马森的三色的仅仅是胶原纤维染色,我们称之为太染色纤维。尽管如此,图3是一个优秀的插图的格言:一个图片顶一千个词。

在“表叠加自组装”,大部分的间充质细胞保持底部的组织,在塑料表面附近,和矩阵上面沉积。这种细胞的积累负责的弱点,单独堆放表(50]。在这项研究中,第一步,再播之前,产生同样的组织。因此,通过翻转矩阵表之前再播真皮成纤维细胞,我们受移植者细胞表面的组织主要构成细胞,相反对成纤维细胞的标准技术,第二层是受移植者的主要组织构成的矩阵。不过,没有区别的参数,是衡量在这项研究中,可以观察到组织之间所产生的这些技术与一个类似的组织组织(数字3,4,5),组织厚度(图6(一)(图),细胞计数6 (b))。

高度渗透塑料环上的矩阵表诱导机械张力和文献表明,这种紧张可能导致胶原纤维的调整,适应组织的机械约束。之前证明再播成纤维细胞在一个矩阵表引起短暂的基质金属蛋白酶(MMP)的峰值51]。这些基质金属蛋白酶可以帮助重新排列纤维的机械应力,但这种紧张也可能诱导MMP本身(52,53]。MMP的起源或矩阵的调整的分子机制,可以进一步调查,“拉伸”组织明确提出了矩阵纤维和细胞一致地紧盯着地平线相比标准和“翻转”条件(数据3和4)。先前的研究表明,细胞排列在矩阵纤维对齐(54];在这工作,这方面没有评估,但它可能是有趣的在未来调查这一点。似乎同质取向的组织扁平化的细胞(图5(图),较低的细胞计数6 (b))。相同数量的细胞被播种在每个条件,这种差异可能导致细胞增殖减少或成纤维细胞的死亡由于压力或基质的重组。有趣的是,此前报道,在皮肤老化,细胞增殖率较低(55,56]。

伸展运动可以诱导增殖和细胞凋亡。瓣膜间质成纤维细胞反应循环应变增加,与此同时,增殖和凋亡。结合这两个相反的生物过程可以导致越来越多的细胞或降低:在这种情况下,细胞数量减少(56]。血管平滑肌细胞增殖是由循环应变(减毒57而内皮细胞的增殖,不断提交给压力,增加(58]。c-Jun n端激酶(物)被发现增加犬髌腱细胞,还定期在紧张。持续激活物也是proapoptotic,所以组织的过度使用,这地方在恒定应力环境中,可能是有害的59]。然而压力也起着关键作用的强度:成骨细胞的体外细胞增殖增加与生理循环应变下刺激,但却降低了刺激supraphysiological范围时(60]。在癌症,肿瘤组织的张力,也就是说,压应力,从周围的ECM,可能导致细胞生长调节与细胞凋亡和增殖在高压力区和细胞凋亡和增殖在低应力区(61年]。在目前的研究中,我们可以注意到,“拉伸”条件下细胞数量减少但增殖和凋亡没有评估。同样,拉伸的强度没有测量。实验在未来能做进一步描述技术。

“拉伸”组织提供了一个更薄的基质。这可能稀释不结果实的组织因为太染色不是更强烈。细胞数量的减少ECM的组织仍然可以解释较低生产分子然后薄基质层。进一步的研究,如胶原蛋白沉积动力学,需要说明这一现象。

“拉伸”技术是一个简单的技术可用于研究衰老和癌症。有趣的是,小鼠皮肤胶原蛋白取向指数为0.32,8周时这个值是0.78 60周。随机取向有一个0值,当1是完美的并行组织。这些结果表明ECM深刻改造和矩阵的排列纤维老化期间(25]。这将是有趣的调查如果老化的表皮重建基质外植体和“拉伸”基质显示了相同的功能。

同样实验使用健康、癌前,癌细胞产生的结果与标准或“拉伸”技术可以与文学等细胞中描述的行为。

伤口愈合伤疤后经常发生问题尤其是拉力的皮肤被打破。身体的某些地区更容易产生这种不足的治疗形式:前胸部,例如,产生疤痕,瘢痕疙瘩。强大的身体区域之间存在分歧的垂直和水平对齐的胶原纤维(62年]。角膜基质是另一个组织排列的胶原纤维是至关重要的,疤痕可能有问题。疤痕组织形成的控制需要保持一个清晰的愿景(63年]。“拉伸”组织可能是有用的工具,在体外研究切口进入真皮或角膜基质的后果。

5。结论

矩阵组织纤维是最重要的这个研究的结果。基质片的文化渗透环上“拉伸”技术允许的总重组组织成纤维细胞的第二播种后15天。在这项研究中塑料的化学治疗/缩微成像和使用外源性物质是必需的。渗透环不是组织和集成是可重用的。这个家庭的自组装技术是相对廉价的这样一个组织的成本低于1美元每平方厘米,使其可以访问所有的研究实验室。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢杜拉基金会楚de魁北克和加拿大卫生研究机构(CIHR)。

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