的初步研究托灭酸对细胞增殖的影响,细胞凋亡,细胞内胶原蛋白沉积在瘢痕疙瘩成纤维细胞在体外

文摘

瘢痕疙瘩疤痕fibroproliferative障碍是由于胶原蛋白的积累类型即托灭酸(TA)、非甾体类抗炎药,发现可能影响老鼠体内胶原蛋白的合成。在这个初步研究,我们旨在测试TA对细胞增殖的影响,细胞凋亡,细胞内的沉积在瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原蛋白。正常成纤维细胞(NFs)和瘢痕疙瘩成纤维细胞(kf)是人体真皮组织。在剂量范围内10⁻³-10年⁻⁶M和曝光时间24小时、48小时和72 h,我们发现0.55×10⁻³M TA在48 h接触表现出显著减少在NFs和kf细胞增殖。在这些实验条件下,我们证明了(1)助教治疗诱导的凋亡率相比,kf NFs;(2)助教治疗减少胶原蛋白生产kf与NFs;(3)助教治疗减少胶原蛋白I型表达kf比较NFs。总之,我们的数据表明,TA减少细胞增殖,诱导细胞凋亡,抑制胶原蛋白在kf积累。

1。介绍

瘢痕疙瘩疤痕,疤痕形成上调扩大超出了原病变的边界(1]。瘢痕疙瘩疤痕的主要组织学表现是典型的成纤维细胞的增生与细胞外基质的过度积累组件,特别是胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖(1- - - - - -4]。这种类型的疤痕的原因仍然未知,但它已经指出,任何皮肤磨损包括烧伤后瘢痕疙瘩的伤疤可以开发,穿刺或手术(1- - - - - -6]。不同于正常的伤口愈合,瘢痕疙瘩疤痕形成始于异常组织真皮损伤扩展的增长超出了原来的伤口的边界(7- - - - - -11]。中央病理性瘢痕疙瘩疤痕的伤口愈合反应是由间充质细胞的高密度瘢痕疙瘩成纤维细胞(kf) [9,10]。因此,kf的增长导致过多的细胞外和细胞内矩阵基质,由不规则的分类指导和厚变透明螺旋束称为keloidal胶原蛋白(5,12]。在瘢痕疙瘩的形成疤痕,类型的胶原蛋白最初由成纤维细胞分泌颗粒III型胶原。在成熟的过程中,胶原蛋白I型逐渐取代III型胶原,最终由细胞外基质在创面的99% (1,5,9- - - - - -12]。目前,常见的治疗瘢痕疙瘩往往结合切除重建手术。糖皮质激素或5 -氟尿嘧啶注射之后,压缩疗法如硅胶表经常使用(1,2]。尽管如此,复发仍在45%和100%之间(3,4]。因此,瘢痕疙瘩的治疗仍然是一个巨大的挑战的整形外科医生。

托灭酸(TA)是一个fenamic酸衍生物属于非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)类,传统上用于风湿性疾病(13,14]。这组药物的主要医疗用途包括类风湿性关节炎、骨关节炎和炎症性关节病15- - - - - -18]。助教,也写成2 - ((3-chloro-2-methylphenyl)氨基)苯甲酸酸在IUPAC(图1)、水溶性低分子量261.7克/摩尔。确切的医学应用、不良反应和助教机制尚不清楚。然而,先前的研究已经非常具体描述应用程序的助教。研究说明,TA与抑制结缔组织中胶原代谢老鼠和有能力诱导癌细胞凋亡[13,14,19- - - - - -25]。有一个抑制钠tolfenamate胶原蛋白0.15 mol / L的代谢生理盐水的老鼠(13]。助教减少细胞的生存、生长和血管生成在肿瘤和癌症细胞,包括人类肿瘤异种移植人类胰腺癌,人类神经母细胞瘤、前列腺癌和鼠标通过调节转录因子Sp1的活动;人类通过调节NADAG-1头部和颈部癌症;人类通过ESE-1 / EGR-1结直肠癌;和人类影响口腔癌的p38增殖蛋白激酶信号通路(14,19- - - - - -23]。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和化学物质

所有的皮肤样品都在莱特州立大学获得IRB SC4833数量。疤痕组织的样本(KF1)来自一个24岁的非裔美国男性与瘢痕疙瘩瘢痕的临床和病理证据证实如前所述[10,26]。第二个(KF2)瘢痕疙瘩成纤维细胞系来自于一位35岁的非洲裔美国女性购买从写明ATCC(写明ATCC通过11日,美国)。一个正常的成年人的皮肤样本(NF)来自于一位29岁的非裔美国女性在整形手术(7,8]。皮肤标本孵化2毫升消化中含有高葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(美国生活技术Gibco)、5毫克/毫升胶原酶/ dispase II(美国RocheDiagnostics),和0.25%胰蛋白酶(表达载体,生活技术,美国)8小时低于5%股份有限公司₂在37°C (7,9,27]。孤立从瘢痕疙瘩成纤维细胞通道(P) 0疤痕组织和正常皮肤组织总介质组成的高葡萄糖DMEM培养,10%胎牛血清(Gibco,生活技术,美国),1%笔/链锁状球菌/谷氨酰胺(表达载体,生活技术,美国)5%股份有限公司的条件₂,在37°C。每个细胞株分别培养。KF1 P13 P15, KF2 P 3到5,NF P3-P8测试化验。作为KF1和KF2进行在每个试验中,通常指KF在下面。助教从开曼化学公司购买,美国。

2.2。麻省理工

NFs和kf被分成不同的组与TA(10预处理⁻³10米,⁻⁴10米,⁻⁵米,或10⁻⁶米)不同时期(24小时、48小时或72 h),分别。MTT工具包(表达载体,生活技术,美国)是用于扩散试验。吸光度检测在535 nm Packard融合分光光度计(27]。亲戚的细胞增殖率(%)与细胞培养测定和分析根据以下方程: 所有实验都独立执行。六次与瘢痕疙瘩成纤维细胞文化文化以及正常皮肤真皮文化。

2.3。细胞凋亡

NFs和kf被分成三个组控制(“C”,只有接受媒介)、汽车(“V”、中0.55% DMSO),和助教(550μTA溶解在0.55% DMSO溶液介质)48 h单独接触。Annexin-binding缓冲区(美国表达载体,生活技术)和propidium碘(表达载体,生活技术,美国)解决方案准备工作1 x。细胞凋亡的检测是通过fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)石中剑流式细胞分析仪(Accuri C6, Inc .)、美国)(20.,21]。所有实验都独立执行。四次与瘢痕疙瘩成纤维细胞文化文化以及正常皮肤真皮文化。

2.4。胶原蛋白染色

NFs和kf被分成三个组控制(“C”,只有接受媒介)、汽车(“V”、中0.55% DMSO),和助教(550μTA溶解在0.55% DMSO溶液介质)48 h单独接触。天狼星红/快速绿色染色工具包(美国Chondrex)是用于分析胶原蛋白的生产。吸光度在535 nm和600 nm)检测到帕卡德融合分光光度计和分析通过以下方程: 所有实验都独立执行。四次与瘢痕疙瘩成纤维细胞文化文化以及正常皮肤真皮文化。

2.5。免疫印迹

NFs和kf被分成三个组控制(“C”,只有接受媒介)、汽车(“V”、中0.55% DMSO),和助教(550μTA溶解在0.55% DMSO溶液介质)48 h单独接触。从每个细胞株蛋白质提取和BCA测定的浓度测定。每个样本混合10的60微克μL 5 x蛋白样品加载缓冲区。那时trans-blotted PVDF膜与阻断缓冲区阻塞(3% BSA;1 x TBS;和0.05% Tween-20) 1 h。之后,这是孵化与兔单克隆反人类胶原蛋白I型(热费希尔科学稀释1:2000年,美国),在两个晚上在4°C。Anti-rabbit HRP-conjugated二级抗体(σ稀释1:20000年,美国)被添加到瓶上的膜在室温下了一个小时。与TBST冲洗后,细胞膜被激活与化学发光合衬底(细胞信号技术,美国)在室温下在黑暗中4分钟。可视化和量化使用化学发光检测系统(美国Bio-Rad)。蛋白质带强度每车道被体积强度和得分是规范化beta-actin(σ稀释1:4000年,美国)(27]。所有实验都独立执行。四次与瘢痕疙瘩成纤维细胞文化文化以及正常皮肤真皮文化。

2.6。统计数据

执行统计分析与STATISTICA version 6.0(美国StatSoft, Inc .)。数据显示为均值±SEM由单向方差分析评价本研究中两组之间。,对于所有的测试被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。剂量和时间响应的助教在NFs和kf细胞增殖

TA在NFs和kf扩散的影响是通过MTT分析评估,这是显示在图2。在助教的最高浓度,细胞增殖率出现下降。随着曝光时间的增加,NF和KF核扩散大幅降低10点⁻³M助教。细胞增殖也减少了TA应用时更大速度超过48或72小时。基于试验结果,0.55×10⁻³M TA在48 h暴露决心成为未来理想的条件实验。

3.2。助教剂量和时间的影响在kf诱导细胞凋亡

确定助教诱导细胞凋亡在NFs和kf, Annexin-V /π标签在应用管理0.55×10⁻³M TA溶解在0.55% DMSO 48 h。虽然车辆仅表现出影响NFs,选择性明显细胞凋亡TA-treated kf non-TA相比治疗组kf和NFs(图3)。

3.3。助教剂量和时间的影响在kf抑制胶原蛋白的积累

定量分析细胞内和细胞外的小天狼星红荧光染色法反映了所有类型的胶原蛋白的程度由成纤维细胞产生的。结果表明,胶原蛋白产量显著降低在kf之前确定剂量和时间(图4)。此外,有一个相当大的kf形态学变化。在所有样品染色强度降低。分泌,染色蛋白质和细胞密度均降低,尤其是在KF的文化。

3.4。助教剂量和时间的影响在减少胶原蛋白的表达在kf I型

助教的影响胶原蛋白I型(胶原蛋白I)蛋白表达进行评估通过免疫印迹在两种细胞类型。蛋白量测量每次治疗后48小时。图5显示了一个强有力的增加表达相比,kf NFs。助教显著抑制胶原蛋白的表达类型我kf与其他群体相比,抑制胶原蛋白I型表达式在NFs TA治疗后不显著。这一结果表明,0.55×10⁻³M TA 48 h抑制胶原蛋白我表达在kf但不显著,有效地在NFs。

4所示。讨论

瘢痕疙瘩吓唬,疤痕的一种,是一种fibroproliferation疾病与胶原沉积的积累造成的自分泌的upregulation TGF -β在伤口愈合过程中信号(5,13,27]。助教的角色,fenamate NASID,最近已被用于癌症治疗(13,14,19- - - - - -25]。这些实验是为了确定管理助教能够改变proliferatory瘢痕疙瘩成纤维细胞和减少kf的胶原蛋白的生产。我们的初步研究表明,助教有可能正常化的一些特征kf如细胞凋亡和胶原蛋白的生产。

最初,我们测试了TA NF和KF扩散的影响通过应用五个浓度的TA (10⁻³10米,⁻⁴10米,⁻⁵10 M,⁻⁶M) 3种不同的曝光时间(24小时、48小时和72 h)分别为了确定最小的药物浓度的条件下对疾病的影响最大比例的成纤维细胞。我们发现NF和KF增殖率下降10⁻³M TA 48 h后曝光。这表明NF的多样性和KF扩散显著降低某些更高数量的助教。细胞增殖测定的线性外推法,数据在48 h透露,TA的有效浓度从而导致减少NF扩散是550年的一半μm .这个浓度的助教48小时暴露没有显示显著减少kf增殖,但其他影响仍将存在。在72小时,有一个大的减少KF文化扩散与NFs。这可能是由于一个长的过渡期对KF TA的毒性反应或副作用改变文化的媒体每三天。进一步限定的影响这个助教和时间接触治疗,我们用0.55×10细胞凋亡进行化验⁻³助教和48小时时间曝光。一组暴露于0.55% DMSO溶液中添加来控制车辆的影响。尽管0.55% DMSO诱导成比例的凋亡率在NFs和kf,细胞凋亡在kf TA治疗诱导选择性显著的凋亡率与NFs。这表明细胞凋亡明显受到助教。根据典型的组织学变化kf [1- - - - - -4),减少胶原蛋白生产主要药理目标治疗瘢痕疙瘩的伤疤。在我们的研究中,我们测试了助教的影响在减少胶原蛋白的积累,而且试图验证细胞凋亡之间的关系和胶原沉积。根据我们的数据,发现胶原蛋白生产的抑制率高kf后0.55×10⁻³M TA与48 h曝光时间与NFs。虽然NFs 0.55% DMSO增加胶原蛋白生产的影响,造成生产0.55% DMSO在kf没有显示具体的意义。同时,TA治疗后,细胞数量也减少了。因此,TA在kf减少胶原蛋白生产效率高。天狼星红胶原蛋白定量测定目标螺旋胶原蛋白重复包,因此非特异性为特定类型的胶原蛋白。大部分胶原蛋白I型胶原蛋白由kf,和我们的结果为胶原蛋白类型具体我助教治疗后(1,2,12,26- - - - - -28]。我们的研究证实,胶原蛋白I在kf和NFs。治疗助教在体外显著减少胶原蛋白表达在kf NFs。

在细胞凋亡和胶原蛋白表达实验中,DMSO车辆本身也有一些效果与对照组相比。底层机制,这不是明显的从我们的研究。在细胞凋亡检测,与治疗组相比,汽车集团有更多的显著影响NFs虽然kf的影响并不显著。这可能进一步考虑临床研究。胶原蛋白表达分析,DMSO没有显著诱导胶原蛋白表达在NFs。在kf,显著增加胶原蛋白的表达,但这种效应可以抵消助教。总之,DMSO并不影响性能的助教在kf细胞凋亡和胶原蛋白表达。目前的研究是有限的样本的数量。尽管如此,统计上显著的效果从助教在KF细胞治疗。一个潜在机制的活动助教在瘢痕疙瘩Sp2转录因子的诱导能力退化。 Sp1 has a role in the canonical TGF-β转导通路。因为TGF -β被广泛认为是中央祖纤维疤痕和自分泌信号具有大容量,Sp1的退化可能作为一种公认的药理目标在瘢痕疙瘩。未来的研究可能包括使用TGF -β受体阻滞剂和测量细胞内磷酸化SMAD家庭成员。其他研究包括工作细化剂量对溶解度没有车辆。虽然基因小鼠模型为瘢痕疙瘩还不存在,仍然有瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕的有效模型函数验证机制和活动助教的疾病。尽管这个初步研究的缺点,明确助教有可能选择性地治疗瘢痕疙瘩成纤维细胞在正常皮肤成纤维细胞。许多其他小分子治疗瘢痕疙瘩的检验,但是助教和fenamates总的来说,没有探索。

一般来说,我们目前的新数据表明,托灭酸诱导细胞凋亡和抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的胶原蛋白生产。助教可能成为新的治疗应用治疗瘢痕疙瘩的伤疤。先进技术的发展,成千上万的已报告在瘢痕疙瘩治疗疤痕。然而,这是第一次,TA成功使用在体外诱导细胞凋亡,减少胶原蛋白在kf积累。此外,助教是一个可用的商业配方化学。因此,TA建议临床试验来证实我们的发现。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

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