羊膜作为黑素细胞移植患者支架稳定的白癜风

文摘

白癜风是一种获得皮肤的疾病,严重影响患者的生活质量。治疗白癜风的黑素细胞移植的使用,包括但结果变量。治疗4焦或广义稳定的白癜风患者使用移植自体黑色素细胞的文化剥蚀羊膜(点)。文化活检获得在每个病人和生长在黑色素细胞的媒体10 - 14天后的细胞转移到剥蚀,移植到无色的病变。患者随访6个月使用无色的病变的临床评估。治疗领域之间4厘米不等²和210.6厘米²。在所有患者对治疗的反应非常好可以90 - 95%的成功率。我们的研究结果表明,移植自体黑色素细胞培养的是一个新的,简单,有效治疗白癜风稳定。

1。介绍

白癜风是一种获得皮肤的疾病,影响0.1 - -3%的世界人口,特点是表皮黑色素细胞的损失,并导致无色的病变的发展。白癜风的基本病机是未知的,尽管一些研究显示遗传素质,关系到其他自身免疫性疾病,生化和神经激素的失衡和环境毒素/压力[1- - - - - -3]。化妆品缺陷引起的白癜风有深刻的心理影响大约有三分之二的病人,患有抑郁症,低自尊,社会排斥,甚至就业歧视(4]。受焦白癜风患者,致病因素通常消失,留下明确的无色的病变。稳定广义白癜风,病变的大小和数目是固定几年Koebner现象是缺席。当前传统的白癜风治疗由紫外线疗法(窄带UV - b或补骨脂素+ a),局部类固醇,他克莫司,pimecrolimus, calcipotriol。稳定的白癜风,患者缺乏可靠有效的医学疗法的发展导致了使用自体黑色素细胞移植的手术治疗方法。这项技术包括厚移植、穿孔移植,吸疱移植,不需要细胞扩张(5,6]。并发症的手术方法会导致一个鹅卵石表面的外观,外围hypopigmentation,参差不齐的色素沉着,或缺乏色素沉着的治疗领域,以及疤痕及色素改变捐赠网站(7]。目前的黑素细胞有或没有角质形成细胞直接接触培养的自体移植治疗白癜风的发展阶段。这样的移植技术包括noncultured表皮悬架,培养混合melanocyte-keratinocyte悬挂有或没有载体,和培养纯黑素细胞悬液8,9]。

羊膜(AM),胎盘内的一部分,由一个厚的基底膜胶原IV型和层粘连蛋白和一个无血管的基质。戴维斯(10)是第一个在1910年用胎膜皮肤移植。随后,我经历了广泛使用的生物敷料管理伯恩斯(11下肢静脉溃疡,慢性(12),中毒性表皮坏死松解症(13),表皮松解大疱(14),外科敷料(15后,面部擦皮法(16]。自1995年以来,当金正日曾报道使用保存的人类是修复严重受损兔角膜(17),是移植已成功申请重建眼表面严重的角膜疾病患者(18]。

实验和临床研究使用我作为舞弊或补丁已经证明是促进组织愈合,减少炎症和纤维化,抑制血管生成。我就像一个基底膜和促进上皮细胞的迁移19),具有抗炎作用通过抑制蛋白酶活性和渗透的白细胞和抑制il - 1α和il - 1β(20.的差别,引发对这些TGF -β从而减少纤维化(21]。此外,我具有抗菌作用,降低术后感染的风险(22]。此外,我一直认为显示非常低的免疫原性。人类正在处理的技术和低温贮藏杜尔贝科修改鹰中、50%甘油推荐被FDA呈现所有的羊膜细胞不能存活的(23]。

在最近的研究中,我们报告的临床结果与黑色素细胞培养的应用到不同的无色的病变。

2。患者和方法

2.1。病人

研究机构伦理委员会的批准,获得了和书面知情同意的患者或父母。从2005年1月到2006年5月,4例(1男3女)年龄在13 - 29年,稳定广义白癜风和2稳定焦点白癜风治疗纯黑色素细胞的自体移植使用载体(表1)。稳定的疾病被定义为没有新的病变或扩大现有病变在过去的12个月。所有患者先前收到了几个医学治疗没有反应。

2.2。羊膜

胎盘从母亲那里获得在选择性剖腹产筛查艾滋病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、htlv 1、巨细胞病毒、梅毒在出生的时候,3个月后收获AMs。层流罩下,胎盘被免费的血液凝块使用平衡盐溶液含50微克/毫升链霉素,50微克/毫升青霉素和2.5 ug /毫升两性霉素。羊膜是钝性剥离绒毛膜的其余部分分开。膜被夷为平地在硝基,上皮/基底膜表面。膜和纸被切割成厘米的块,放置在一个无菌瓶包含杜尔贝科修改鹰介质和甘油比例1:1。瓶被冻结在−80°C。立即使用前,我与PBS解冻,洗。作品被接受0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)在PBS 37°C 2 h。消化是是塑料铲轻轻擦洗去除上皮细胞而不破坏基底膜。Acellularity的擦洗)染色(图证实了1(一))。我是放置在一个塑料框前播种的黑色素细胞。

2.3。细胞培养

黑素细胞基础培养基(喜忧参半,PromoCell、海德堡、德国)没有PMA(佛波醇12-myristate 13-acetate)和牛脑垂体提取物、补充与碱性纤维母细胞生长因子(1 ng / mL),重组人干细胞因子(50 ng / mL),和人类重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(10 ng / mL) 10 - 14天,用于黑素细胞文化。

表面刮活检(1厘米²)来自色素臀部皮肤局部麻醉下。皮肤样品洗在磷酸盐(PBS)和结缔组织修剪。表皮与真皮分离了1% Dispase II(勃林格曼海姆,巴塞罗那,西班牙)与庆大霉素PBS(20毫克/毫升)在一夜之间37°C。表皮的床单被去皮真皮和0.05%胰蛋白酶和0.53毫米EDTA溶液中搅拌(trypsin-EDTA解决方案)10分钟37°C。trypsin-EDTA解决方案是灭活的胰蛋白酶抑制剂(σ,马德里,西班牙),在1500转离心5分钟。细胞颗粒在10毫升的补充resuspended喜忧参半,培养在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂在25厘米²组织培养瓶(Nunclon、鲁开德、丹麦)。当融合了(图80 - 90%1 (b)),细胞用0.25%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA消化,然后山肩到基底膜的一面是如上所述的密度cell /厘米²。黑色素细胞被培养了一个额外的3 - 4天,移植到裸露的皮肤或与福尔马林固定的免疫组织化学染色。

2.4。免疫组织化学研究

为了确保黑色素细胞的存在,免疫组织化学染色HMB-45 (1: 100;美国Biogenex,加州圣拉蒙)进行使用想象+系统(Dako、斯特鲁普、丹麦)根据生产的建议。AMs和细胞培养箱幻灯片中性缓冲福尔马林固定在4% 10分钟。在PBS洗涤后,自由浮动的羊膜和幻灯片permeabilized 5% Triton x - 100 30分钟和内源性过氧化物酶活动就熄了3%的H₂O₂10分钟。样本孵化主要抗体在一夜之间在4°C。冲洗后,膜和幻灯片与山羊antimouse孵化(K4001 Dako)标记聚合物在室温下为30分钟。细胞被孵化可视化部分涂+ (K3468 Dako)。洗进行每一步之间Tris-HCl 0.05缓冲区,0.5盐水,pH值7.6 (TBS)含0.05%渐变20 (TBS-T)。幻灯片和苏木精复染色轻,乙醇分级系列脱水,二甲苯清理,安装在DPX。人羊膜被安装到玻璃幻灯片,一夜之间,干了二甲苯,并与DPX盖玻片。样本在Eclipse E800M尼康显微镜检查,每张幻灯片和10个随机图像捕获与分析软成像系统Gmbh是一家现代化的、可靠的软件。黑色素细胞的数量每毫米²是计算使用ImageJ软件。

2.5。外科手术

与聚乙烯吡咯酮碘消毒后,用盐酸利多卡因局部麻醉下(20毫克/毫升),表皮烧蚀进行了使用丝绸摸Flashscanner附加到Sharplan 1030有限公司₂激光设置的5.5 7 W,共计0.2秒的脉冲持续时间(激光工业有限公司特拉维夫,以色列)。取得足够的深度创面的deepithelialization色素缺乏的地区,我们切除组织略低于是必要的,以实现查明出血,这表明渗透到真皮。一激光通过充分的为所有的病人。乳头状真皮达成后,裸露的病变治疗AMs含有黑色素细胞培养。AMs的黑色素细胞被安装在凡士林纱布(LINITUL Bama-Geve,巴塞罗那,西班牙)。每个羊膜(表面12.56厘米²)是安全的,培养的黑色素细胞的基底膜,在裸露的表面有一层凡士林纱布,steri-strips,几层传统干纱布和绷带。

病人被要求限制运动治疗地区3 - 4天。当时绷带移除。术后两周,所有患者开始接受阳光照射或UVA照射两次每周大约6周刺激黑素细胞增殖。

3所示。结果

3.1。细胞培养的分析

黑色素细胞的存在证实了在文化的基础上,细胞的形态与HMB-45采用免疫分析。黑色素细胞移植的数量0.1和之间的不同每个膜。黑色素细胞转移到我时,一个平行的文化室幻灯片也执行,黑色素细胞的比例大于90%,每一个案例。

3.2。临床结果

无色的表皮被通过有限公司₂激光。最大的区域在一个会话中治疗是210厘米²4厘米,最小的治疗病变²。每月的评估可以进行长达6个月的每一个病人。而反应后观察2个月在一些患者中,完整的评估可以在所有的病人的比例(图6个月后进行2)。

所有患者对治疗的反应非常好(表1)。没有差异,可以根据浓度的黑色素细胞移植。有趣的是,在所有的病人的边缘区域白色病灶也repigmented,与观察到的其他手术,黑色素细胞的病变仍是枯竭的边缘。另一方面,表皮再生移植后6天完成,没有疤痕是收件人的区域(图中观察到3)。

4所示。讨论

尽管有各种类型的医疗和外科治疗白癜风的治疗响应焦或慢性稳定广义常规治疗白癜风是穷人,相当数量的患者未能应对可以满意的程度(24]。细胞移植技术优势组织移植如穿孔移植或吸疱表皮移植,包括更大的统一的色素沉着,皮肤结构异常,如鹅卵石的风险降低,能够覆盖更大的地区的白癜风贪污较小的尺寸。Noncultured表皮悬液移植稳定白癜风被附近和Surleve-Bazeille[第一次描述了25),和最近的一篇论文报告的使用这种技术在儿童和青少年26]。然而,供体皮肤大小受体之间的皮肤大小比例是1:3和1:10。黑色素细胞体外的扩张提供了更多的细胞移植;因此,从一小块皮肤的细胞可以用于治疗大vitiliginous区域。培养的黑色素细胞移植的限制之一是细胞的交付车辆,促进细胞灌输和留在皮肤病变的位置。细胞悬浊液管理可能会导致黑色素细胞的消失而使用不同的支架移植可能提供一个更好的衬底。最近我们对待一群五焦或广义稳定的白癜风患者使用移植自体黑色素细胞培养的剥蚀,可以很好的利率(90 - 100%)27]。这里我们对两个白癜风患者病变大于200厘米²与类似的令人满意的结果。从第二周黑色素细胞的增殖指数,这样大的无色的地区没有直接治疗局限性。使用我的意思是提供一个支架移植的黑色素细胞提供了几个优势:的消炎和抗菌性能是随着缺乏抗原性促进皮肤的上皮形成和减少疤痕。基底膜及其潜在的细胞外基质含有胶原IV型,类型七世和laminins-1和5 (28)提供一个自然的基质细胞,让黑色素细胞的黏附和增殖。由于这些原因我似乎是一个非常好的基质培养人类黑色素细胞类似于观察与人类是什么缘的上皮细胞(29日]。除了他们的生物学性质,AMs是容易获得和unexpensive,可以定制,并通过化妆可取的,避免疤痕使用厚皮移植。

被假定表皮创伤(擦皮法或激光)可能是促黑触发水库的黑色素细胞,也就是说,毛囊及周围皮肤。另一方面,可以诱导可能postinflammatory,造成表皮创伤后炎症介质的释放。我们认为这些都是不可能解释观察到的影响在我们的病人根据研究,范加尔et al。30.)已经表明,可以诱导表皮消融,紫外线治疗,炎症介质在安慰剂组病变是极其有限的。

我们还表明,有限的使用₂激光可以精确去除表皮,真皮的保护,和没有出血和炎症是一个用户友好的程序,快速、统一与更多的古典擦皮法或diathermosurgery [31日]。

结果在这有限的患者需要进一步的研究来证明有用的作为黑色素细胞的支架。只有一个个体内的临床试验评估的有效性是在悬挂支架与黑色素细胞的应用可以确认使用的载体的高效运输和移植的细胞。

确认

本研究支持的部分临床试验EudraCT没有。2009-017757-36从洋底de Investigacion疗养地(FIS),西班牙卫生部。

引用

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