产前皮质类固醇和产后流体限制对AQP3表达有微分作用,水处理,并在围产期鼠表皮屏障功能

文摘

损失的水不成熟的皮肤可以导致早产儿体温过低和脱水。水和甘油通道aquaglyceroporin-3 (AQP3)丰富胎儿表皮和可能会影响表皮水处理和表层水分通量。调查AQP3在不成熟的皮肤,我们测量在活的有机体内表皮水分运输和AQP3表达鼠崽暴露于临床相关的流体内稳态扰动。早产(E18)老鼠幼仔研究产前皮质类固醇后暴露(ANS),和新生儿(P1)老鼠幼崽后18 h快。表皮水分损失(TEWL)和皮肤水合作用测定,AQP3 mRNA量化了rt - pcr、原位杂交和免疫细胞化学应用于地图AQP3的表达。ANS导致一种改进皮肤屏障(低TEWL和皮肤水合作用),而AQP3 mRNA和蛋白增加。禁食导致失去屏障完整性和增加皮肤的水合作用。这些改变不是平行的AQP3的任何变化。最后,产前皮质类固醇和早期产后流体限制产生微分对皮肤屏障功能的影响和在大鼠表皮AQP3的表达。在围产期老鼠,AQP3并不直接确定净水运通过皮肤。

1。背景

极早产儿失去大量的水从皮肤表面早期出生后因不成熟的皮肤(1,2]。在这些婴儿中,过多的水分流失风险增加脱水和体温过低,条件,具有重要的临床后果。皮肤的功能,以阻挡环境,和表层水分损失(TEWL),取决于完整性的外层表皮的角质层3,4]。有明显的屏障功能的成熟和内容之间的关系和结构组织的角质层脂质(4,5]。水和甘油运输整合膜蛋白aquaglyceroporin-3 (AQP3)和水通道aquaporin-1 (AQP1)存在于皮肤6,7),也被证明是在胎鼠中表达的丰富8]。最有趣的是,AQP3表达角质细胞的质膜的表皮的基底细胞层8]。AQP3在表皮水化的作用和/或不成熟的皮肤表层水分运输缺乏一个称职的屏障被建议(8,9),但很少有人知道它的精确功能和监管。

产前糖皮质激素治疗(ans)被广泛用于导致胎儿肺成熟,从而减少早产新生儿呼吸窘迫的风险(10]。在胎鼠,俺们可以引起皮肤屏障的结构和功能的成熟(11]。糖皮质激素已被证明导致肺上皮细胞(AQP3表达12),但这并未被调查在发展中皮肤。

本研究的目的是进一步调查的作用AQP3在水运不成熟皮肤通过分析在活的有机体内表皮水分运输与AQP3表达在围产期鼠皮肤模型。两个独立的条件与围产期相关流体内稳态进行了研究,早产鼠崽暴露于产前皮质类固醇和术语幼鼠受到短期限制液体摄入量。

2。材料和方法

2.1。老鼠幼崽

所有实验进行定时的妊娠Sprague-Dawley老鼠(ALAB、Sollentuna、瑞典、m和b,丹麦)和他们的后代。

ans的影响早产大鼠皮肤上研究了管理倍他米松(60μ克/ 100克体重)腹腔内大坝()在一天胚胎(E) 17日,24日和18个小时之前交付E18 (= E0插天,妊娠= E22)。NaCl-injected动物()相同的孕龄被用作控制。在E18,大坝被thiobutabarbital腹腔注射麻醉(8毫克/ 100克体重),进行剖腹产,早产鼠崽交付,测量TEWL和皮肤水合作用。

研究流体的影响限制,学期新生老鼠幼仔保持与他们的大坝(),直到第二天早上,当随机选择后一半的后代分离的水坝和保存在孵化器的温度26°C,因此拒绝摄入液体和营养(P1_禁食)18 h。其他老鼠幼崽作为控制和留下他们的大坝乳儿18 h期间(P1_ctrl)。测量TEWL,皮肤水合作用,然后皮肤取样。控制被允许适应相同的环境条件让他们禁食幼崽的孵化器1 h段前测量。每只小狗分别重前和结束时18 h时期来确定任何体重的变化。水坝被喂以一个标准的老鼠的饮食(Ewos、Sodertalje、瑞典或Altromin拉赫,德国)和接收自来水随意。

斩首后,安然无恙的样本切除老鼠幼崽。样本(1)分析的组织含水量,(2)立即在干冰冷冻后AQP mRNA表达的分析,或(3)免疫组织化学浸泡固定。这项研究是乌普萨拉大学动物伦理委员会的批准。

2.2。TEWL

水的蒸发率(TEWL;g / m²h)从皮肤表面测量如前所述8)在早产鼠崽由剖腹产,使用蒸发计和术语的新生幼鼠(Ep1 Servomed,斯德哥尔摩,瑞典)。蒸发计探头被轻轻对皮肤在测量和计算TEWL通过测量相对湿度(RH;%)和温度在不同距离的两个点在皮肤表面自由蒸发。

早产组的幼崽,胎儿是小心翼翼地从胎盘的羊膜囊连接完整,与无菌压缩谨慎处理,放置在卧姿没有擦拭皮肤表面。TEWL测量被制成的上背鼠崽记录每2分钟,直到一个稳定的水平,交付后发生8 - 12分钟,去年两个值计算的均值。在新生儿期内幼鼠TEWL测量从后面两次,平均计算。作为TEWL是受到环境湿度和温度的影响13),蒸发计也用来测量RH空气中10厘米以上的动物,和环境空气温度(T_空气;°C)也记录,使用远距离温度计和热敏电阻(美国YSI,黄色的弹簧,哦)。这些测量确保所有测量都是在相似的环境条件下(表1)。

2.3。皮肤水合作用

皮肤表面水化评估通过确定皮肤电电容(SEC),使用新星DPM 9003 (NOVA研究公司,格洛斯特马,美国)与一个3毫米探针(14如前所述(15]。仪器运行在90年低,和999年较高的阅读,即表示为任意值的微微法拉等价物(pF)。探头紧贴皮肤,应用后不久被认为是记录的值,以反映皮肤的水合作用[15]。

在早产大鼠交会测量断断续续的背部皮肤上的老鼠崽,尾的地方TEWL测量。一个稳定的水平达到8 - 12分钟后,去年两个值计算的均值。在新生儿老鼠交会测量两次,平均计算。TEWL和交会测量完成后,皮肤温度(T_皮肤;°C)测定的老鼠崽使用远距离温度计和热敏电阻(YSI)(表1)。

2.4。皮肤含水量

的皮肤样本betamethasone-exposed早产幼崽(),未曝光的控制(),禁食新生儿幼崽(),和nonfasted控制()单独称重和冻结。样本为72 h后冷冻干燥,reweighed和皮肤含水量计算的湿重/干重比(W / D)如前所述16]。

2.5。AQP3 mRNA表达的半定量的分析

我们确定AQP3的表达水平的成绩单从E18早产鼠崽皮肤暴露于产前从E18倍他米松治疗和控制,以及定期禁食幼鼠和吮吸控制小狗使用半定量rt - pcr方法如前所述[8]。这种方法提供了一个量化的具体的mRNA的表达一个内部标准。

皮肤样品(~每30毫克)每组6动物获得的总RNA的提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。总RNA的收益率与分光光度计测量(美国贝克曼杜640年富勒顿,CA)。

在20 - RT进行μ包含3 L反应体积μg的总RNA,标准RT缓冲区(WI Promega,麦迪逊,美国),40 ng oligo-dT15 (Promega), 1毫米核苷酸(Amersham法玛西亚生物技术,小都,英国),60 U rRNasin (Promega),和300 U的RT (Promega),孵化为60分钟42°C。RT反应被终止在65°C失活之后10分钟冷却到4°C。

5毫升的解决方案被转换为50 - RT反应μL聚合酶链反应混合物标准PCR缓冲(Promega), 2.5毫米MgCl₂,0.2毫米每个核苷酸(Amersham法玛西亚生物技术),0.8μ0.4 M AQP3引物μM经典II内部标准(美国TX Ambion)和10 U AmpliTaq黄金(珀金埃尔默,促进城市、钙、美国)。PCR反应混合物被分成三个15的解决方案μL,随后放大在26日,28日和30日周期(94°C 30年代,65°C 1分钟),从95°C 8分钟和5分钟完成在65°C。

的条件每个引物的PCR在试点实验优化和数量的RNA,以确保量化指数阶段内的反应。PCR产品从三个不同数量的周期被用于量化的RNA样品克服错误由于任何样本总量变化的RNA。

所有单个PCR产品同时运行在1.5%琼脂糖凝胶1 x TAE缓冲区,包含0.5μg / mL GelStar染色(BioWhittaker分子应用,大我,美国)。GeneRuler 100个基点DNA梯(Fermentas维尔纽斯,立陶宛)是用于上浆PCR碎片。数字图像与使用Fluor-S获得多重图象分析与原软件(数量,版本4.2.1,准备Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)减法后匹配的背景。

所有反应的解决方案(除了RNA和cDNA、rRNasin和RT)在半定量RT - pcr在移液预拌消除错误。所有的RNA样品分析了至少三次。18 s rRNA表达水平的测量在所有样本和AQP规范化使用的表达式,从而纠正任何样本RNA浓度的差异,RNA质量、效率和RT PCR反应。AQP3表达的价值观作为AQP比18岁的信号。

AQP3的引物设计的基础上他们的序列和报道来自CyberGene (Huddinge、瑞典)如前所述8]。AQP引物选择从不同的外显子来避免放大的基因组DNA。经典的二18岁内部标准(Ambion)引物组作为内部控制,根据制造商的协议。

2.6。免疫组织化学

的皮肤样本betamethasone-exposed ()和控制()老鼠幼仔沉浸与3%多聚甲醛固定0.1甲次砷酸盐缓冲,提取和组织石蜡包埋和切片。石蜡切片(2μ在4°C m)孵化一夜之间亲和纯化主要抗体AQP3 (RA3040/1592AP [17),用辣根过氧化物酶共轭二次抗体(P0448、Dako、丹麦)如前所述[8,17]。

2.7。原位杂交

检查AQP3信使rna的分布表达式冷冻皮肤低温恒温器切割(20μ米)、解冻和安装在超级霜幻灯片。冷冻组织部分后缀在4%多聚甲醛在0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值为7.4 (PBS)在室温下1小时。在PBS(洗涤后分钟),部分简要在DEPC-H冲洗两次₂O和风干在室温下30分钟使用一个表迷。部分都保持在−20°C到进一步使用。

老鼠AQP3 cDNA被Bcl我和PstI水解。AQP3 cDNA片段401元,对应于478 - 873年的鼠AQP3 mRNA(加入数字:D17695),被绑定到质粒Bluescript SK II(+)或Bluescript KS II(+)准备合成构造AQP3 cRNA反义和探针,分别。构造与BssH II,水解纯化使用GFX PCR和DNA凝胶带净化设备(Amersham)和转录T7 RNA聚合酶的存在³⁵S-UTP。

的部分和蛋白酶K(0.05孵化μg / ml)解决方案包含:0.1米三,0.05 EDTA, pH值8.0十分钟在室温下增加探头渗透。在DEPC-H简单冲洗后₂O,幻灯片中孵化0.1三乙醇胺(茶),pH值8.0,3分钟。乙酰化作用,10分钟的幻灯片是孵化(562 0.25%μ在225毫升TAE l)乙酸酐。洗后分钟2 x标准柠檬酸盐(SSC),部分是通过分级脱水乙醇(50%,75%,95%,和99.5%)3分钟在每个浓度。部分是孵化prehybridization缓冲区(50% deionaized甲酰胺,pH值5.0;50 mM Tris-HCl, pH值7.6;25毫米ethylene-diamine-tetraacetate (EDTA), pH值8.0;20毫米氯化钠,0.25毫克/毫升酵母tRNA, 2.5 x Denhardt的解决方案)在湿室4小时55°C。

删除prehybridization缓冲之后,部分与标记探针杂交,稀释至最终的浓度cpm /毫升prehybridization缓冲:50%去离子的甲酰胺,20毫米Tris-HCl, EDTA 1毫米,0.33 M氯化钠,0.1毫米二硫苏糖醇(德勤),0.5毫克/毫升酵母tRNA, 1 x Denhardt的解决方案,0.1毫克/毫升poly-A-RNA,和10%硫酸葡聚糖。一夜之间,部分被盖玻片和孵化(14 - 16小时)在一个湿室60°C。

拆卸盖玻片,幻灯片放到4 x SSC和温柔的在室温下搅拌20分钟。幻灯片在4 x SSC冲洗,在室温下最小。部分被处理20μ一分之一g / ml核糖核酸酶prewarmed核糖核酸酶缓冲(0.5 M氯化钠,10毫米Tris-HCl, pH值8.0;1毫米EDTA, pH值8.0)30分钟37°C。洗了4的部分减少紧缩洗高盐度在室温下,后跟一个高温清洗在70°C:德勤的解决方案添加1毫米。2 x SSC分钟,5分钟1 x SSC, 0.5 x SSC 10分钟,最后在0.1 x SSC 30分钟在70°C。然后,部分在0.1 x SSC短暂被洗涤冷却+ 1毫米德勤。在室温下脱水:50%乙醇德勤+ 0 + 1毫米,08年x SSC 3分钟,70%乙醇德勤+ 0 + 1毫米,08年x SSC 3分钟,95%乙醇为3分钟,最后99,5%的乙醇分钟。幻灯片是在室温下晾干的前30分钟以下部分被放置在柯达电影和储存在4°C先生5天接种后2天。电影D19开发的开发人员(柯达)4分钟RT和冲洗水,持续30秒,被固定在超级修复(柯达)5分钟在室温下磨,在水中涮净。非特异性杂交是由孵化与各自的部分³⁵S-UTP-labelled感觉cRNA上述cdna探针在相同条件下的反义RNA探针。

更高的解剖解决mRNA本地化,放射自显影法进行使用柯达NTB2核乳胶浸渍方法。在ddH NTB2,稀释1:2₂啊,是30分钟prewarmed 45°C。幻灯片轻轻地下降2倍在暗室的乳液和干在室温下为3小时。幻灯片是保存在一个黑盒子,干燥剂,包围铝箔和保持在−20°C 6天。幻灯片是在16°C 4分钟柯达D19开发者(柯达)稀释1:2。发展过程是停止以0.5%醋酸和ddH的冲洗₂O(30秒)。幻灯片是固定在高速固定,稀释1:4 (Stena,斯德哥尔摩,瑞典)7分钟,在ddH冲洗₂啊,分钟。对比染色与DAPI执行(1μg / ml ddH₂O) 5分钟紧随其后在ddH冲洗两次₂o .幻灯片在乙醇脱水50%(30秒),70%(30秒),80%(2分钟),95%(2分钟),到99年,5%(2分钟)和清除Histochoice清净剂(σ)为4分钟。他们干1分钟和盖玻片DPX安装介质(BDH)和保存在黑暗前2天分析。暗视野分析通过使用尼康microphot-FXA显微镜。

2.8。血液分析

TEWL和皮肤温度测量后,新生儿老鼠幼仔斩首,收集血液样本测定血清皮质醇(猎户座Diagnostica Spectria涂层管等,埃斯波,芬兰),酸碱状态,S-Sodium, S-Potassium (ABL 770、辐射计、丹麦哥本哈根)。

2.9。数据处理

值作为。学生的以及未配对的观察是用来测试的统计学意义。不到的价值观。01被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。皮肤屏障特性和水分在早产鼠崽

皮肤的功能作为一个障碍在暴露于产前糖皮质激素被使用两个不同的仪器技术评估:梯度法来确定TEWL和皮肤表面电容的测量来评估表皮表面水化。未经处理的控制早产鼠崽E18交货有很高TEWL出生后早期(g / m²h)。在幼鼠暴露在E18倍他米松交付之前,TEWL低大约30% (g / m²比未曝光控制老鼠幼崽(h),图1)。

除了减少TEWL,接触ans导致降低皮肤表面水化,所反映的交会的较低pF相比pF的控件(,图2)。

获得总数的估计皮肤含水量,whole-thickness皮肤样品分析的湿/干重比。皮肤的含水量测量W / D是低幼鼠暴露ans ()比未曝光的控制()(,图3)。在环境RH没有差别,T_空气,或者T_皮肤两组之间(表1)。

3.2。AQP3 mRNA表达早产鼠表皮

皮肤AQP3 mRNA表达的水平是由半定量rt - pcr。rt - pcr产品是由高分辨率记录凝胶电泳,导致单个产品预期的大小(AQP3, 484个基点;经典二18岁,324个基点)。逆转录酶时省略了RT反应的解决方案,没有特定的产品出现,证实PCR碎片从信使rna,而不是生产污染基因组DNA。确保使用的PCR循环数量是合适的,反应终止在三个不同的周期,和30个周期被发现在线性放大的范围。

在这些实验条件下,皮肤的表皮AQP3 mRNA显然是更高的老鼠崽暴露ans从控制老鼠幼崽(皮肤;图4)。

3.3。AQP3在早产鼠表皮蛋白表达

免疫组织化学分析显示强劲AQP3 immunolabeling所有有核细胞层的表皮上皮基底层通过颗粒层。ans暴露导致增加AQP3标签但分布(图没有明显变化5)。

3.4。新生儿皮肤屏障特性和水含量老鼠幼崽

TEWL由evaporimetry在幼鼠禁食18 h在产后1天的时代。同窝出生仔畜老鼠幼崽,保持与他们的大坝被用作控制。在禁食(P1 TEWL是两倍g / m²h)和控制(g / m²h)大鼠崽(;图6)。

同时,禁食导致增加肌肤含水量,反映在更高的W / D在禁食(7.9±0.8)比在控制(6.5±0.3)(;图7)。秒读数在所有组接近于零,表明低成熟的啮齿动物的皮肤表面水化(数据没有显示)。

3.5。AQP3 mRNA表达和分布在新生儿鼠表皮

新生儿的老鼠,AQP3信使rna表达水平无显著差异与学习小组之间的rt - pcr检测(数据没有显示)。insitu公司杂交并没有透露任何fasting-induced mRNA表达的分布(图的变化8)。

3.6。血液生化指标和体重新生儿幼鼠的变化

在禁食崽S-cortisol值(更易/ L)高出大约三倍()比乳儿控件(更易/ L)。酸碱状况无显著差异,S-Sodium或S-Potassium被发现之间的团体(数据未显示)。

禁食的体重明显降低大鼠崽比乳儿控制18-h时期后,和没有差异RH, T_空气,或者T_皮肤两组之间(表1)。

4所示。结论

本研究探讨AQP3水通道的角色在围产期鼠皮肤测试在一个实验模型之间的关系和AQP3表达在活的有机体内表皮水分运输。

首先,我们测试的影响产前皮质类固醇治疗早产之前,一个国家在不成熟的皮肤有极高的透水性。研究表明,糖皮质激素诱导功能变化的皮肤早产鼠崽,导致降低TEWL,降低表面水化,降低皮肤的含水量。这些变化发生在与增加表皮AQP3表达相比未曝光控制。

其次,我们研究了流体的影响限制在新生鼠的小狗。流体限制模仿细胞外的过度损耗水经常遇到出生后(即、脱水)。流体限制导致TEWL和皮肤含水量增加,虽然没有改变观察AQP3表达或分布。

水通道蛋白的发现提供了分子解释几个过程涉及transcellular运输水在许多不同的组织(18]。水通道蛋白家族的一些成员已确定,并描述了两个主要的组aqp [19]。一组只可渗透水的水通道蛋白,而第二组,aquaglyceroporins所谓达到,AQP3所属,也渗透甘油(20.]。通过这些渠道运输选择性但被动通量受外部力量如由大分子或离子渗透的影响。

水通道蛋白在皮肤的生理功能是不完全清楚。AQP3存在于许多上皮组织,有人建议,它可以提供上皮细胞与水保护他们免受脱水(9]。在支持,马等人发现受损的角质层的水合作用小鼠缺乏AQP3 [21]。然而,这些作者报道说,晚些时候在AQP3零小鼠皮肤甘油含量降低与皮肤水合作用的障碍(22)和皮肤的改变可以通过甘油纠正更换(23]。全部这些数据有力地表明,在成熟的啮齿动物AQP3影响皮肤水合作用通过影响甘油运输。

不成熟的发展中皮肤特性明显不同于成熟。在婴儿早产,表皮很薄,它的最外层,角质层,功能缺陷。由于弱皮肤屏障功能,这些婴儿失去大量的水从皮肤表面,由于蒸发流体损失,容易导致脱水和体温过低。在搜索机制参与运输的水通过成熟皮肤,我们以前提出的数据分布和基因表达的AQP3在围产期鼠皮肤与皮肤屏障的发展(8]。而成熟的啮齿动物的表皮薄显然不同于人类,胎儿和新生儿的皮肤啮齿动物显示许多结构和功能的相似性与人类皮肤及其发展。在之前的研究中,我们表明,TEWL很高在最不成熟的老鼠崽,逐步随孕龄增大而减小。AQP3在表皮的基底细胞层与高表达在胎儿成熟的动物。因此我们提出,水通道蛋白可能通过不成熟皮肤,促进水运,显然缺乏角质层能够限制水的损失。

目前的研究没有发现直接关系AQP3的表达和表层水分运输的措施。因此,AQP3不应仅仅被视为膜表面孔隙水泄漏在不成熟的表皮,与TEWL AQP3通道的数量直接相关蛋白质表达。此外,AQP3的增长不太可能导致增加水涌入到表皮自类固醇曝光后表皮含水量较低。根据获得的数据从研究成熟AQP3零老鼠,似乎可能增加AQP3的意义也在发展中皮肤表皮增殖的调节甘油有关交货(24,25]。另外,因为数据表明AQP3调节角化细胞迁移通过增加水侵前缘的迁移细胞(24,26),观察增加AQP3可能改变细胞或亚细胞分布。这样的地方就不会被我们的测量效果。

这里我们报告也改变液体和营养的供给影响皮肤的屏障功能的新生鼠的小狗。出生后早期一段短期禁食导致TEWL和增加皮肤的含水量。这些变化不相关的任何变化AQP3 mRNA表达,或皮肤形态。进一步分析mRNA表达,insitu公司进行杂交,但没有改变信使rna分布可被检测到。

胎儿/新生儿表皮可以受营养状况的影响;宫内生长迟缓幼鼠显示表皮厚度减少,但这似乎并没有与任何损失产后屏障功能(27,28]。

必需脂肪酸的沉积表皮取决于营养摄入量,而其他脂肪酸和胆固醇合成新创的表皮(29日和禁食导致皮肤的脂质合成减少30.]。代谢反应禁食包括糖质新生增加,主要是由于上升的循环的胰高血糖素和胰岛素水平(31日),但糖质新生也引起皮质醇(32]。在这一过程中一个衬底是甘油33),这是一个重要组成部分表皮和角质层34]。的体重和崛起的大损失在禁食S-cortisol老鼠幼崽,禁食期间是重要的,可能会导致表皮脂肪和蛋白质的分解,从而干扰屏障功能和湿重/干重比增加,无论任何AQP3表达的变化。

我们的实验模型既有优点和缺点。我们整个动物的方法的主要优势是它与人类的病理生理学。的皮肤屏障的功能病理状态极度早产(原因很明显是独特的人类婴儿)通过研究不容易理解生理胎儿生活的状态,或成熟的个体。的梯度法测量表层水分运输在活的有机体内使比较平行研究的发现在人类婴儿,和获得TEWL水平范围内观察到的人类早产和新生儿。记住从成熟不成熟的皮肤是不同的,我们假设AQP3可能发挥作用在表层水分运输早产后,我们相信我们的模型的目的是调查临床相关的围产期皮肤病理生理学。然而,在整个动物的研究总是有生理代偿机制影响了数据的风险。同时,我们干预虽然围产期医学密切相关,有可能影响其他基因的转录和翻译除了AQP3对皮肤屏障的形成很重要。其他方法显然将被要求获得更多知识和机械的见解AQP函数,和未来的研究不仅要关注水的运输。

缩写

AQP3:	Aquaglyceroporin-3
答:	产前皮质类固醇治疗
TEWL:	表皮水分损失
证券交易委员会:	皮肤电电容
W / D:	湿/干重比
rt - pcr:	反向transcriptase-Polymerase连锁反应
RH:	相对湿度
pF:	微微法拉。

利益冲突

作者没有利益冲突。

确认

这项研究得到了瑞典研究理事会(73年授予nos。vx - 14729年和03644年),Gillbergska基金会,皇冠公主殿下Lovisa社会儿童的医疗保健,玛尔塔和贡纳V Philipsson基金会,丹麦国家研究委员会,凯伦Elisa Jensen基金会人类前沿科学计划,欧盟委员会(European Commission)(授予QRLT 2000 00778和2000 00987号)。作者要感谢Kjallstrom barbroandreasson, Ann-Christine Eklof, Ida玛丽亚Jalk,乐天诉Holbeck专家技术援助。

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