文摘
鳞状细胞癌(口腔鳞状细胞癌)是最常见的口腔癌症在美国每年,影响近30000美国人。尽管最近检测和治疗的进步,几乎没有改善的五年存活率毁灭性的疾病。口腔癌之前可能癌变前的疾病出现组织学检查为发育不良。识别的分子标记细胞改变将帮助确定发育不良的风险发展到口腔鳞状细胞癌。本研究的目的是确定是否存在任何关联组织学诊断发育不良与OSCC损伤和改变的表达desmosomal信息在口腔上皮细胞粘附分子。我们的数据表明,口腔鳞状细胞癌组织样本显示免疫反应性降低desmoplakin和plakophilin-1蛋白质与正常口腔上皮细胞相比。此外,显著降低desmoplakin观察免疫反应性发育异常的组织与正常口腔上皮细胞相比。相比之下,desmoglein-1染色持平的水平之间的样本然而desmoglein-1发现局部口腔鳞状细胞癌中细胞边界样本。这些数据表明,desmoplakin和plakophilin-1表达的变化可能是一个有用的组织形态学变化的标志,并提供一个工具识别之间的口腔病变。
1。介绍
口腔癌影响美国人口的3%,据估计,35000新病例今年将诊断(1]。尽管最近口腔鳞状细胞癌的诊断和治疗的进步,生存只有小幅改进在过去30年里(了2])。肿瘤细胞迁移和变化与细胞外环境相互作用已经被证明是促进许多实体肿瘤的进展。癌细胞改变胶的特点允许快速增长的肿瘤细胞脱离他们的邻居,渗入底层的基质,在体内传播到遥远的网站建立一个肿瘤转移。因此了解粘附分子表达的变化是很重要的决定在组织和细胞的入侵能力预测转移的可能性。已经提出,地区口腔发育异常可能随时间进展口腔鳞状细胞癌(3,4),因此可以考虑癌变前的病变。然而,使用组织形态学诊断发育不良是主观的,取决于口腔病理学家的培训和经验。因此,识别的分子标记细胞改变将帮助识别癌变前的病变和协助确定发育不良发展到恶性肿瘤的风险。小说描述的标记也会协助早期诊断,从而提高口腔癌预后。
细胞桥粒最突出的信息连接复合体在复层扁平上皮组织。损失细胞桥粒的各种类型的癌与肿瘤细胞的迁移能力的提高(5- - - - - -7]。的跨膜细胞桥粒的核心由单程desmosomal钙粘蛋白(desmogleins和desmocollins)中认为heterotypically交互和同型的细胞外空间协调和信息粘附[8,9]。除了desmosomal钙粘蛋白,最近发现tetraspan蛋白质,补也已被证明能够本地化细胞桥粒和影响细胞桥粒装配在角化细胞10]。的胞质域desmosomal钙粘着蛋白将直接与几个desmosomal斑块蛋白质,包括plakoglobin和plakophilins反过来招募desmoplakin的角蛋白细胞骨架中间丝状体通过相互作用[11]。组装desmosomal结允许角蛋白中间丝细胞骨架伸展在细胞和上皮组织提供一个机制来承受机械应力。失活的具体desmosomal粘附复合物通过自身免疫血清在寻常天疱疮或天疱疮foliaceus导致表皮水泡(12]。
遗传突变desmosomal基因已经被鉴定,导致各种皮肤,头发,心脏缺陷(了13,14])。突变plakophilin-1与外胚层发育不良和皮肤脆弱综合症(15]在突变desmoglein-1与纹状palmoplantar keratoderma。突变desmoplakin plakophilin-2,两个基因编码desmosomal组件表示的心,已经涉及arrhythmogenic右心室心肌病的发展(ARVC) [16]。ARVC患者表现出fibro-fatty替代心脏的肌肉从而导致心脏性猝死。通常病人窝藏desmoplakin突变也可以表现出缺陷的头发和皮肤由于破坏这些上皮组织的细胞桥粒。
考虑到这些发现,我们假设改变了表达和/或本地化desmosomal蛋白可能导致的细胞发育异常的,最终发展为鳞状细胞癌。虽然许多研究已经描述了desmosomal组件的定位和表达在皮肤和皮肤肿瘤,很少有人知道关于desmosomal组件表达在肿瘤引起的口腔黏膜。在这项研究中,我们研究了两个desmosomal斑块的表达蛋白质,desmoplakin plakophilin-1。Desmoplakin被发现在所有的生活层表皮细胞桥粒虽然plakophilin-1最高表达分化层。此外,我们检查了分化的表达特定desmosomal钙粘蛋白,desmoglein-1。在这项研究中我们假设的变化区分特定的组件更容易表现出正常和发育异常的样本之间的表达的变化。这些变化可能是维护在口腔鳞状细胞癌样本。
2。材料和方法
2.1。组织采购和疣状
档案组织部分从UNMC口腔病理学服务得到UNMC机构审查委员会的批准。8个正常的(口腔颊粘膜)15组织学证实发育不良样品和十五口腔鳞状细胞癌样本用于分析。所有的石蜡包埋组织切片切成5米部分,收集到带电Superfrost幻灯片(电子显微镜科学,哈特菲尔德,PA)。福尔马林固定石蜡包埋的部分使用二甲苯脱蜡、水化分级系列酒精和水。抗原检索是通过微波治疗5分钟刚做好的10毫米柠檬酸钠(pH值6.0)。组织孵化在阻断缓冲区(1 x磷酸缓冲盐,0.1% Triton x - 100和1%牛血清白蛋白)30分钟前孵化与初级抗体在一夜之间c .抗体过剩主要是被广泛的洗涤1 x磷酸盐。组织与适当的孵化FITC-conjugated antimouse二级抗体和安装在vectashield安装媒体包含DAPI(向量实验室,伯林盖姆,CA)。照片被收集的蔡司显微镜和axiocam axiovert 200从智能成像CCD相机使用SlideBook软件创新(Denver, CO。)
2.2。抗体
鼠单克隆antidesmoplakin (10 f6), plakophilin-1, desmoglein-1产生在我们的实验室如前所述17,18]。Antidesmoplakin抗体10 f6认识到人类的羧基终端域desmoplakin (AA 1960 - 2151)。代antiplakophilin-1和antidesmoglein-1单克隆抗体被描述之前(18,19]。
2.3。染色行为的评价
疣是半定量的评估系统得分的基础上至少有三个独立的评估。得分是基于整个组织整体染色,染色的视野。消极的控制,正常口腔黏膜无主处理抗体和信号强度是确定为背景。数值得分为每个样本分配基于以下规模。强烈的细胞边界信号相对较弱的胞质信号给定一个得分为“3”,适度的细胞边界和胞质染色强度得到了“2”的分数,总体疲软的染色强度是进了一个“1”,和染色强度相似背景水平得分“0”。为plakophilin-1免疫染色,观察人士要求法官核信号与胞质信号到达一个整体信号强度评分自核信号往往是异构的在一个给定的组织样本。成绩的统计分析是由方差分析分析和显著差异是由克鲁斯卡尔-沃利斯多重比较。
3所示。结果与讨论
开始我们的分析我们选择一组之前诊断发育不良和口腔鳞状细胞癌组织样本的一部分UNMC口腔病理学活检在牙科学院服务。我们选择15发育不良样品和十五口腔鳞状细胞癌样本比较八正常口腔黏膜样本。发育异常的组织是基于基底细胞层增生,细胞异型性明显,细胞有丝分裂,增加和无序相比正常口腔黏膜上皮内的分层(图1 (b))。对于本研究我们选择不进一步分层发育不良样品由于高度的主观性在这些样本的诊断。口腔鳞状细胞癌样本与中度分化鳞状细胞癌诊断的口腔病理学家在UNMC活检服务(图1 (c))。正常口腔黏膜获得与正常样本表现出潜在的纤维瘤表面上皮细胞(图1(一))。苏木精和伊红染色的组织被用来确认诊断和代表部分如图1。
(一)
(b)
(c)
先前的报道表明,desmosomal分量表达式通常是减弱或消失在口腔鳞状细胞癌相比正常上皮细胞(5,20.]。为我们分析我们选择包括发育异常的样本以确定desmosomal附着力损失是一个早期事件发展为鳞状细胞癌。我们使用单克隆抗体染色组织小组特定人类desmosomal组件(desmoplakin、plakophilin-1 desmoglein-1)和发育异常的的染色模式相比,口腔鳞状细胞癌样本与正常口腔黏膜。
Desmoplakin desmosomal斑块是一个必要的组成部分,已被证明在招聘起着关键作用的角蛋白中间丝细胞骨架网站信息的附着力。正如所料,desmoplakin染色在正常口腔黏膜表现出一种强烈的染色模式出席信息边界在分化的表皮层(图2(一个))。一些分散细胞质观察信号;然而这个信号是小相比,细胞边界染色。一些微弱的核信号也存在,决心是背景信号引起的二次抗体也因为这个信号是负控制样本的抗体(图中被省略了2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
Desmoplakin口腔发育异常的组织组织化学染色显示中断Desmoplakin导致细胞质扩散desmosomal本地化的本地化。此外,有一个下降的整体强度antidesmoplakin信号(图2 (b))。领域的相对正常desmoplakin定位可以看到但这些区域很小,没有扩展在整个发育异常的组织(数据未显示)。染色口腔鳞状细胞癌和样品antidesmoplakin抗体显示相对较低的蛋白表达在几个样品;然而,少量的desmoplakin目前可以看到局部的细胞边界模式类似于正常组织(图中看到2 (c))。大部分口腔鳞状细胞癌样本显示没有antidesmoplakin免疫反应性和得分为负。
半定量的评分进行评估desmoplakin整个小组组织的信号强度。至少有三个独立观察员被训练识别正常细胞border-associated desmoplakin染色在正常组织和消极的背景信号与负控制相关组织。标识符删除幻灯片和分数的记录。Desmoplakin染色在正常口腔黏膜标本染色时得分最高的发育异常的样本和口腔鳞状细胞癌样本得分显著降低(图5)。这些数据表明,失去antidesmoplakin immunoreactiviy过渡期间检测在口腔正常发育不良。
Plakophilins犰狳重复蛋白的一个家庭中扮演重要角色的组装和维护细胞桥粒(14,21]。有趣的是,plakophilin-1也被确认为核蛋白质在培养细胞来源于复层上皮组织(22,23]。Plakophilin-1据报道在最高度表达分化层复层鳞状上皮如皮肤(7,24]。与皮肤的角质化上皮plakophilin-1定位不同,plakophilin-1本地化的生活口腔黏膜的上皮细胞层(图3(一个))。这种差异表达可能会反映出区别角质化的和nonkeratinized组织。
(一)
(b)
(c)
(d)
除了预期的plakophilin-1细胞边界定位在正常口腔黏膜,我们也观察到强烈的plakophilin-1核本地化。细胞边界信号看到plakophilin-1像desmoplakin虽然强度有所降低。大多数plakophilin-1信号在正常样本集中在原子核(图3(一个)),往往掩盖了信号在细胞周围。核本地化的plakophilin-1培养细胞之前已经报道过(22,25,26]。核本地化plakophilin-1在福尔马林固定的组织不是同质个体组织。一些地区的组织观察没有观察到核plakophilin-1而强大的细胞边界染色。目前,plakophilin-1的核函数是未知的。Plakophilin-1发育不良样品经常组织化学染色显示总体强度下降,特别是在核Plakophilin-1池(图3 (b))。核plakophilin-1很少和弱发育异常的和口腔鳞状细胞癌中观察到的样本。Plakophilin-1定位在口腔鳞状细胞癌样本通常广泛局部细胞质中几乎没有核信号(图3 (c))。完全丧失的细胞边界plakophilin-1协会经常看到在口腔鳞状细胞癌样本(数据未显示)。
得分antiplakophilin-1信号在这些组织透露一个整体轻微下降,发育不良的组织与正常口腔黏膜相比虽然这种变化不显著。比较plakophilin-1染色在口腔鳞状细胞癌样本在正常口腔黏膜染色显示显著减少plakophilin-1这些组织样本(图之间的免疫反应性5)。与先前的报道一致,plakophilin-1染色却降低了与正常组织相比,鳞状细胞癌(7,24,27];然而plakophilin-1并不显著降低发育异常的组织。
Desmoglein-1是一个跨膜desmosomal钙粘着蛋白最高度分化的表皮层中表达。在我们的口腔黏膜样本,这种区分特定desmosomal钙粘蛋白高表达在正常口腔黏膜和皮肤的所有生活层desmoglein 1表达仅限于最分化细胞层(28]。有趣的是,我们观察到健壮desmoglein-1信号在口腔鳞状细胞癌发育异常的组织和样本。的染色强度antidesmoglein-1信号往往是略有降低;然而我们一直观察到显著desmoglein-1蛋白在所有的样品我们观察(图4)。虽然在口腔鳞状细胞癌desmoglein-1本地化细胞边界,也可以观察一些细胞质强调细胞边界附近的信号。这个改变定位一直在口腔鳞状细胞癌样本。得分antidesmoglein-1染色的这些组织没有透露显著改变anti-desmoglein-1我们样品间的免疫反应性。
(一)
(b)
(c)
(d)
虽然样本容量相对较小,我们能够发现明显重要改变desmoplakin之间正常的免疫反应性和发育不良的口腔上皮细胞显示中断desmosomal附着力可能是一个早期事件在口腔鳞状细胞癌的进展。此外,plakophilin-1表达式出现在后期的变化而变化看到desmoplakin免疫反应性,可能在应对改变角蛋白中间丝附件信息联系的网站。
在我们的样本中,desmoglein-1免疫反应性之间没有明显改变了正常和口腔鳞状细胞癌样本。这一发现与最近的一项研究显示分歧desmoglein-1表达式的逆相关,头颈部鳞状细胞癌患者的预后不良(29日]。规模相对较小的样本池可以解释所观察到的这两项研究间的差异。desmoglein-1常被中断的分布,而不是集中在细胞边界相当分散在整个细胞,最有可能在细胞表面(图4 (c))。基于desmosomal斑蛋白的损失,desmoplakin plakophilin-1,分散的本地化desmoglein-1并不出人意料。检查这些细胞粘附标记,尤其是desmoplakin,发育不良的组织提供了一个很好的标志的组织发展为口腔鳞状细胞癌的风险增加。
确认
作者要感谢Anjeza Pashaj,菲莉Kumm和布雷特·罗伯茨期间优秀的技术支持这个项目。这个项目得到了内布拉斯加州大学牙科学院的暑期研究奖学金计划以及美国国立卫生研究院(DE016905) j·k·Wahl。