文摘

目的。膀胱癌的复杂病因变量和高异质性(BC)做预后预测具有挑战性。我们旨在开发一个健壮的和有前途的基因签名使用先进的机器学习方法预测公元前患者的预后和治疗反应。方法。single-sample基因集富集(ssGSEA)算法和单变量Cox回归分析用于识别的主要风险特征标志在各种癌症。随后结合生存和机器学习方法差异基因表达分析构建一个新的预后签名,这将是在另外两个独立的群组研究中进行验证。此外,亦发现了这个签名和治疗反应之间的关系。进行功能富集分析和免疫细胞估计也提供洞察公元前的潜在机制。结果。Epithelial-mesenchymal过渡(EMT)被确认为公元前的生存患者的主要危险因素(HR = 1.43, 95% CI: 1.26—-1.63)。小说EMT-related基因签名构造和验证在三个独立的组,显示稳定和准确的性能预测临床结果。此外,高危患者预后差和多变量Cox回归分析显示这是一个独立的危险因素患者生存。CD8 + T细胞亚群,M2巨噬细胞被发现在高风险患者的肿瘤微环境。此外,预期,高危患者对化疗药物会更敏感,而低风险病人从免疫疗法将受益更多。结论。我们成功地识别和验证小说EMT-related基因签名公元前预测临床结果和治疗反应患者,这可能是有用的在临床实践中风险分层和个性化的治疗。

1。介绍

膀胱癌(BC)是最常见的一种泌尿系统癌症,在全球拥有超过570000新病例和210000例死亡20201]。基于肿瘤(T)阶段,公元前的病人被分为公元前non-muscle-invasive (NMIBC)和muscle-invasive (MIBC)。后经尿道膀胱肿瘤,肿瘤复发和进展NMIBC患者中观察到63%和11%,分别为(2]。同样,大约一半的MIBC例行根治性膀胱切除术患者局部复发或远处转移,发展和34%死在一个5年随访期间(3]。个体治疗方案为公元前患者目前主要取决于癌症特征如tumor-node-metastasis TNM分期和病理分级(4]。然而,复杂的病因变量和公元前高异质性导致显著不同的预测,使预后预测困难(5]。因此,一个可靠的和精确的生物标志物在公元前的预后和预测治疗反应是高度在公元前指导保健有益。

epithelial-mesenchymal过渡(EMT)是一个细胞的过程,允许上皮细胞获得与抑制上皮间充质特性和行为特性,尤其是钙粘蛋白的损失(6,7]。EMT的激活被认为能够提高肿瘤侵袭性,转移和耐药,指的是侵略性的肿瘤类型(8,9]。几项研究证明了EMT与发展和生存的结果在公元前患者(10,11]。此外,EMT在实体肿瘤已被证明与化疗和免疫治疗反应(12- - - - - -14]。因此,EMT-associated特点和EMT-based基因签名有潜力预测临床结果和响应公元前化疗和免疫治疗的病人。

我们确定了EMT公元前生存作为主要风险因素的病人在这个研究。先进的机器学习方法被用来屏幕预后基因,导致构造一个EMT-related基因在多个群签名验证。此外,我们进行了全面的分析肿瘤微环境(时差),免疫细胞浸润,公元前和治疗反应的患者调查EMT的关系和识别潜在的机制。

2。材料和方法

2.1。数据的收集和预处理

基因表达及相关临床病理的公元前405年的数据样本和19个相邻正常标本取自TCGA (https://cancergenome.nih.gov/)。与总生存期(OS)消除不合格的样品后不到30天,TCGA数据集包括公元前393年病人被用作训练队列。随后,GEO数据库进行筛选后,两个数据集被选为本研究基于以下入选标准:(1)公元前组织学证实样品与基因表达信息;(2)样本与完整的临床资料;(3)超过100个样本。GSE13507数据集(Illumina公司human-6 v2.0表达式beadchip)包含公元前165年样本被利用为验证我队列。GSE32894数据集(umina HumanHT-12 V3.0表达式beadchip)由公元前221年样本被利用为验证第二队列。以上三组的详细信息如表所示1。参与本研究RNA-seq所有数据规范化和log2转变。

表1
在三个独立的群组研究中进行公元前患者的临床特点。
2.2。研究设计

如图1三个阶段,包括发现、训练和验证,进一步探索阶段被纳入本研究。在发现阶段,EMT被确认为公元前预后的主要风险因素在各种癌症的标志。随后,预后差异表达基因(度)EMT-related基因包括随机森林生存和逐步Cox回归分析构建小说EMT-related基因签名,和它的预后价值也验证了在另一个军团两个独立的验证。此外,我们进行功能富集分析,免疫细胞浸润,估计和治疗反应预测(化疗和免疫治疗)在上面的三个军团。


图1
本研究的流程图。GSEA:基因集富集分析。EMT: epithelial-mesenchymal过渡。
2.3。BC预后的主要风险特征的识别

短暂,single-sample基因集富集分析(ssGSEA)是用来衡量各种证实癌症特征的性能训练队列使用“gsva”R的包。该算法是基于基因表达谱和基因注释标志集收购从分子特征数据库(MSigDB) [15]。然后单变量Cox回归分析确定了EMT最高的风险比公元前的操作系统的主要危险因素患者和荟萃分析也应用于计算EMT的集中风险比在多个军团来确认其预后的作用。此外,我们还应用基因集富集分析(GSEA)检测大大丰富了公元前癌症特征样本与相邻正常样本相比,使用“clusterProfiler”R包(16,17]。

2.4。EMT-Related预后基因签名的生成和验证

我们搜查了MSigDB数据库使用搜索关键字(Epithelial-mesenchymal过渡),收集了359 EMT-related基因。度BC标本与相邻正常标本从EMT-related基因筛选时使用“limma”R包标准 和错误发现率( )了(18]。与一个 值阈值为0.005,我们利用单变量Cox回归分析来检测预后基因EMT-related基因之一。度之间的重叠基因生存和预后基因包括随机森林(rsf)为进一步选择使用“randomForestSRC”R的包。随机森林的无国界记者是一个适应后续数据分析,基于树的合奏的机器学习算法。功能重要性与变量重要性衡量(VIMP)应用于选择真正的预测(19]。然后,无国界记者被发现的基因申请考克斯逐步回归构建EMT-related基因签名使用Akaike信息准则(AIC)。kaplan meier和长期有效的接受者操作特征(ROC)生存评估使用“survminer”和“survivalROC”R包应用于综合评价预后的预测EMT-related BC预后基因签名,和两个外部商量GSE13507 GSE32894被用于进一步的验证。最后,我们证明了独立的预后价值EMT-related基因签名基于单变量和多变量Cox回归分析。

2.5。功能富集分析

我们使用“战斗”功能从R包“上海广电”的批处理效果在GSE13507和GSE32894军团和合并到合并验证队列。公元前患者在训练和合并验证队列被分为高和低风险组基于最优截断值EMT-related风险评分(ERS)由X-tile软件。和KEGG基因集,从MSigDB获得,是用于高危人群之间的度的功能注释。在功能富集分析,输入基因列表来自度高,低风险组之间除以人队。

2.6。时间和免疫细胞分析在公元前

时间主要是由基质和免疫细胞,在肿瘤的预后起着至关重要的作用[20.]。估计算法用来计算基质得分,肿瘤免疫得分,估计分数,和纯洁的每个病人使用“估计”R包(21]。然后,上述成绩风险组之间比较。此外,各种免疫细胞类型的渗透公元前由CIBERSORT算法研究[22]。具体而言,基于22免疫细胞亚型的基因表达特性,仿真计算了1000次,22免疫细胞的相对组成比在每个样本终于获得。22免疫细胞类型的丰度在高危人群进行了评价和比较。

2.7。评估治疗的反应

在癌症基因组药物敏感性(GDSC),最大的公共药物基因组学数据库,包含许多人类癌症细胞系的基因表达数据和相应的药物响应数据(23]。我们使用了“oncoPredict”包来预测每个病人的反应根据GDSC各种化疗药物(24]。此外,IMvigor210数据集(25)与转移性移行细胞癌患者antiprogrammed death-ligand (PDL) 1药物(atezolizumab)和GSE176307数据集与转移性移行细胞癌患者anti-PD-1或anti-PD-ligand-1包含在我们的研究中。根据从上述两个数据集获得的基因表达数据,我们计算了每个病人的人,然后这些患者分为高和低风险组。然后,免疫治疗反应的差异进行评估。

2.8。统计分析

达和皮尔森综合正常测试用于确定每个比较有一个正态分布。一旦数据符合假设的参数测试,我们使用一个双尾未配对进行了对比 - - - - - -测试和皮尔逊相关。的Mann-Whitney 测试和斯皮尔曼相关参数时使用并不是正态分布。结果被认为具有统计显著性水平的5% ( )除了差异基因表达分析和单变量Cox回归分析。

3所示。结果

3.1。识别EMT预后的主要危险因素

在训练队列,EMT表现出更高的人力资源总生存期( , )比其他癌症的标志,这是糖酵解,血管生成,等等(图2(一个))。在所有三个军团,EMT一直认定为一个风险因素集中人力资源为1.43(图2 (b)补充表1)。GSEA进一步表明,EMT显著标注在公元前的病人(图2 (c)补充表2)。除此之外,我们发现患者临床病理的后期阶段(阶段,肿瘤阶段,节点转移阶段,病态级)有ssGSEA分数高于患者在早期阶段(图2 (d)- - - - - -2 (e))。此外,kaplan meier生存曲线和公元前生存率较证明ssGSEA得分较高的患者明显恶化的生存结果,包括操作系统( , ),DSS(针对疾病的生存, , ),和发展类金融机构(无病间隔, , )(图2 (f)- - - - - -2 (h))。发现所有上面提到的强烈证明伟大的EMT在公元前患者的预后的影响。

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图2
识别EMT的领先公元前患者的预后的危险因素。森林情节表明EMT最高的人力资源在各种癌症特征训练队列(a)和多个军团荟萃分析计算(b)。(c) GSEA情节说明EMT是公元前显著富集样品比相邻的正常样本。(d)的热图展览EMT的分布分数和等级的患者信息,M, N阶段,和T阶段训练队列。(e)小提琴情节显示患者更高的T台,N阶段,病理等级EMT有更高的分数。kaplan meier生存曲线描绘高危患者除以EMT分数有更糟糕的操作系统(f), DSS (g),发展类金融机构(h)与低风险的患者。人力资源:风险比。公元前:膀胱癌。操作系统:总体存活率。DSS:针对疾病的生存。发展类金融机构:无病间隔。 ; ;ns,没有意义。
3.2。建立EMT-Related预后签名

我们收购了EMT-related基因( )从MSigDB差异基因表达分析。然后,66度的交集(13调节和53个表达下调基因)(图3(一个)(2)和26预后基因保护和风险基因24日)(图3 (b)13)筛选候选基因进行进一步分析(图3 (c)),和网络(图13中基因的紧密关系3 (d))。当所有13个基因被RSF共同认为,操作系统主要是与9基因(EMP1,ANLN,MSX1,NRP2,ID2下,FGFR1,WNT5B,LATS2,TGFB1I1)(图3 (e))。随后,这些9基因应用于逐步Cox回归形成EMT-related基因签名(图3 (g))。在小说中四个基因的基因签名,三个基因(MSX1,ANLN,EMP1)风险因素和剩下的一个(ID2下(图)是一个保护因素3 (f))。EMT-related签名计算EMT-related风险得分= ( )+ ( )+ ( )+ ( )。

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图3
建设EMT-related基因签名。火山情节展示度(a)和BC之间相邻的正常样本,和预后基因(b)由单变量Cox回归计算。红点是调节基因或者风险基因,蓝点礼物表达下调基因或保护基因。(c)维恩图解显示13度之间交叉基因和预后的基因。(d)公元前13 EMT-related基因的相关性。调节基因表达下调基因与灰色和红色的颜色表示。风险描述的基因是蓝色和保护性基因是彩色的绿色。的 Cox回归测试的值13个基因是由圆圈的大小表示。13日执行相关分析基因,每个基因之间的连接线路。红色和蓝色线存在积极和消极的相互关系。(e)变量重要性情节基于随机森林生存分析13个基因。蓝色表明预测变量,而红色代表nonpredictive变量。(f)森林情节基于单变量Cox回归分析表明,这四种基因签名都与总体存活率显著相关。每个基因(g)的系数所描述的基因签名栏的情节。度:差异表达基因。
3.3。人作为一个独立的预后因素与承诺值在每个队列

基于人的最佳截止值由X-tile软件,患者分为高的低危险组病人中,所有三个军团训练和验证。kaplan meier曲线表明,高风险患者存活率明显降低操作系统( , ),DSS ( , ),和发展类金融机构( , )(数据4(一),4 (c),4 (e))。人队,预测的AUC 1, 3, 5年在数据说明4 (b),4 (d),4 (f)。AUC值最高的操作系统、DSS和DSI是0.686,0.768和0.687。在验证我群,低风险患者的生存益处明显好于低风险病人(操作系统: , ;决策支持系统: , )(数据4 (g)和4(我))。操作系统和DSS的最大AUC值验证我组分别为0.657和0.703(数字4 (h)和4 (j))。同样,人也表现良好的预后预测验证II组( , ,最高 )(数据4 (k)和4(左))。总的来说,人是准确的和健壮的病人在公元前的预后评估。

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基因签名作为一个健壮的和有前途的预测因子为生存的预测。kaplan meier生存曲线说明糟糕TCGA生存结果的高危患者训练队列(a, c, e),验证我队列(g, I),和验证二组(k), ROC曲线1年,3年,5年生存预测描述,这个基因签名承诺和稳定的预测性能对BC病人训练队列(b, d, f),验证我组(h, j)和验证II组(l)。

在单变量Cox回归分析,T台,N舞台,舞台,与操作系统和人都显著相关,而人被证明是唯一的独立的预后因子为操作系统多变量Cox回归分析( , )在训练队列(表中2)。也可以获得类似的结果在两组验证(补充表3 - 5)。

表2
单变量和多变量Cox回归分析临床特点和人的整体存活率TCGA队列。
3.4。功能性浓缩和免疫细胞渗透分析

根据功能富集分析,度风险组之间表现出显著富集EMT-associated途径,包括细胞外液,上皮细胞分化,伤口愈合(图5(一个))。此外,如补充图所示1,EMT分数代表EMT过程的性能都与四个基因的表达水平和人队( , )。此外,开心的组件的比较表明,高危患者有更高的基质分数( ),免疫分数( ),估计分数( ),和纯度较低的肿瘤( )比低风险病人(图5 (b))。也可以观察到类似的结果在合并后的验证队列(图5 (c))。此外,通过分析免疫细胞的渗透,我们发现CD8 + T细胞亚群,巨噬细胞M1, M2和巨噬细胞在高渗透,和B幼稚细胞低渗透在高危病人身上的培训和验证军团(数据合并5 (d)和5 (e))。

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图5
功能性浓缩和免疫细胞渗透分析基于基因签名。(a)条形图显示明显丰富通路在高危病人。小提琴情节显示免疫得分更高,基质得分,估计分数,和纯度较低的肿瘤高危患者在训练与低风险患者相比(b)和合并验证组(c),框图描述CD8 + T细胞亚群,巨噬细胞M1和M2巨噬细胞是高渗透和b幼稚细胞低渗透和高危患者在训练(d)和验证(e)军团合并。 ; ; 。
3.5。人的角色在预测化疗敏感性和免疫治疗的反应

公元前化疗广泛用于治疗在临床实践中。因此,我们估计每个病人的治疗反应6常用药物(顺铂、长春花碱、吉西他滨、甲氨蝶呤、紫杉醇、阿霉素)通过评估他们的IC50值基于GDSC数据库。因此,顺铂的IC50值( ),长春花碱( ),吉西他滨( ),甲氨蝶呤( ),紫杉醇( ),和阿霉素( )高危组明显低于低风险组(数字6(一)- - - - - -6 (f))。此外,相关分析的结果也表明,人是与顺铂的IC50值负相关( , ),吉西他滨( , ),和阿霉素( , )(图6 (g)- - - - - -6(我))。这些结果表明,较高的人更敏感的患者化疗。

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图6
EMT-related基因签名预测化疗和免疫治疗的好处。箱形图显示较低的集成电路50值六个常用化学药物在高危患者(f)。人之间散点图说明负相关性和估计的IC50值顺铂(g)、吉西他滨(h)和阿霉素(我)。小提琴情节显示人的nonresponders显著高于免疫疗法的反应者群IMvigor210 (j)和GSE176307 (l)。高危患者的比例显著降低反应(CR / PR)和更高比例的nonresponses (SD / PD)在两个IMvigor210 (k)和GSE176307 (m), IC50:half-maximal抑制浓度。人:EMT-related风险评分。克雷格:完全响应。公关:部分反应。SD:稳定的疾病。帕金森病:进步的疾病。 ; ; 。

Anti-PD1 / PDL1目前FDA批准的药物治疗公元前3 anti-PDL-1药物(atezolizumab、durvalumab和avelumab),和2 anti-PD-1药物(nivolumab和pembrolizumab)。因此,我们评估是否人可能利用预测治疗反应的免疫学检查点封锁(ICB)治疗基于上述两个军团。因此,反应显示较低的人相比之下,IMvigor210(无 ,图6 (j))和GSE176307 ( ,图6(左))。此外,通过分配患者分为高和低风险组人的基础上,我们发现高危患者的百分比有显著降低的反应(完全缓解,CR /部分反应,PR)和更高比例的nonresponses(稳定的疾病、SD /进行性疾病,PD)在两个IMvigor210 ( ,图6 (k))和GSE176307 ( ,图6 (m))军团。

4所示。讨论

EMT是上皮细胞的过程转变成mesenchymal-like细胞与上皮标记的表达减少,如钙和upregulation间充质标记表达式(7,26,27]。减少表达上皮标记在公元前病人与疾病进展(更高的级别和阶段)和EMT-related分子(β连环蛋白或plakoglobin)与贫穷有关DSS (9]。萨彦岭等人发现监管者Zeb-1 EMT表达之间的联系和增强移行细胞肿瘤细胞入侵和迁移11]。此外,有一个实体肿瘤的EMT水平之间的联系及其对化疗和免疫治疗的反应(12- - - - - -14]。上述研究表明,EMT在实体肿瘤具有显著的预后和治疗的潜力。然而,缺乏EMT-related基因签名公元前预测预后和治疗反应。

我们开发了一个EMT-related基因签名预测生存结果(操作系统、DSS和DFI BC的病人。这个基因签名的鲁棒性和适用性验证了两个独立的军团从两个不同的RNA-seq平台。我们的研究结果表明,指定为高危患者使用小说签名比低风险病人不良的生存状况。此外,多变量Cox分析显示,该基因签名是唯一的独立预测指标操作系统调整后的临床因素。没有观察到这两个签名之间基因重叠,与之前的研究相比,使用七EMT-linked基因预测患者的预后MIBC [28]。我们的基因签名只有四个基因表现良好在所有三个军团,和AUC值高于前一个。此外,全面分析了EMT和化疗和免疫治疗反应之间的关系,为进一步的研究提供了基础。

功能富集分析,以更好地了解患者不同的临床结果的潜在机制。我们的结果显示这两个族群之间的度显著富集在细胞外液,细胞增殖,上皮细胞分化,伤口愈合,公元前,和其他变量。山等人表明,癌症相关的成纤维细胞产生的液可能引起转移BC细胞通过增加他们的EMT (29日]。王等人报道,增加UCA1表达BC-derived液通过EMT(促进肿瘤生长30.]。麦科恩等人提出,EMT对伤口愈合所需的细胞增殖至关重要(31日]。此外,四个基因的表达水平和人EMT评分有显著相关性,表明小说签名与公元前EMT过程有关。我们的发现表明EMT-related特征可能与公元前的开发和发展密切相关,和EMT-related基因签名,有巨大的潜在预后gene-function-based预测。

时间在癌症的形成过程中起着至关重要的作用和治疗抵抗(20.]。公元前时差失调促进发展和转移32]。本研究报道,高危患者免疫得分更高,基质分数,和肿瘤纯度较低,表明人的潜在作用时间和是与先前的研究一致33]。的预后和预测潜在的免疫细胞浸润在公元前调查,和一些免疫标记与治疗结果(34]。一些研究报道,更高的CD8 + T细胞浸润在上皮和侵入性边缘显示较长的操作系统或在公元前DSI患者(35- - - - - -37]。然而,一项研究报告了基质CD8 +细胞浸润和生存之间的负相关的结果(38]。CD8 + T细胞被发现更渗透到肿瘤的高危患者,建议我们应该更加注意这个有趣的现象。肿瘤浸润亚群是重要的抗肿瘤免疫抑制。一个荟萃分析的研究表明,亚与贫穷有关操作系统在许多实体肿瘤,与我们的结果一致(39]。巨噬细胞的先天免疫成分是必不可少的,可以分为炎性巨噬细胞(M1)和抗炎巨噬细胞(M2)。在先前的研究中,更高的M2巨噬细胞密度与病理组织学的成绩在公元前患者(40,41]。此外,有一个倾向于患者巨噬细胞水平高,有贫穷的生存34]。我们的研究结果显示,M2巨噬细胞浸润明显高于在高危患者中,与先前的研究一致。

我们选择6代表化学药物,发现高危患者对这些药物更加敏感。人之间的负相关性和药物敏感性被发现在三个化疗药物,包括吉西他滨、顺铂、阿霉素。上述结果显示,高危患者除以人可能更有可能从化疗中获益。免疫抑制剂检查站被批准用于临床使用在2017年公元前转移。不幸的是,只有21.1%的转移患者对银行独立委员会治疗(pembrolizumab)[公元前42]。因此,预测生物标记需要确定一个特定子集的患者可能对免疫疗法。我们的分析表明,低风险病人显示,两组更好的响应,这表明我们的模型可以用于识别患者可能受益于免疫疗法。这些发现表明,基因签名可以指导临床治疗决策关于化疗和免疫治疗。

虽然这是一个原始签名与前途的临床应用,这项研究有一些局限性。尽管我们在预后预测的基因签名的强劲表现,更需要有大量的样本前瞻性研究来验证其一般应用程序。此外,一个有趣的现象观察到在这项研究中,特别是关于生物功能的潜在机制和免疫细胞渗透,需要进一步试验研究。此外,缺乏实验和临床证据验证药物反应也限制在未来应该解决的。

5。结论

总之,我们识别和验证一个小说EMT-related基因签名与高跨多个独立组预后预测疗效。此外,它与BC病人的化疗和免疫治疗反应。这部小说签名有巨大潜力预测预后和指导临床治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

发源地,并且Yicun王设计的研究。Yicun小王和郝主任分析了数据并进行图像处理。郝张起草了手稿。王发源地,并且Yicun修订后的手稿。所有作者都阅读和批准的最终版本的手稿。Yicun小王和郝主任的贡献同样这项工作。

补充材料

补充表1。单变量Cox分析基于ssGSEA分数癌症的标志在所有三个军团。补充表2。GSEA癌症的标志。补充表3。单变量和多变量Cox回归分析的临床特征和人的生存结果(DSS, DFI TCGA队列。补充表4。单变量和多变量Cox回归分析的临床特征和人的生存结果(操作系统、DSS) GSE13507队列。补充表5。单变量和多变量Cox回归分析的临床特点和人与OS GSE32894队列。 Supplementary Figure 1. Correlations between the EMT score and ERS, and expression levels of four genes included in the novel signature.(补充材料)