文摘

t细胞急性淋巴细胞白血病(t)是一种严重的血液肿瘤来源于早期t细胞祖细胞,这是极其耐化疗。经典,阿霉素(阿霉素)是一种有效的一线药物治疗t;然而,阿霉素抵抗限制了其临床疗效。DEK,原癌基因(卡片)参与了肿瘤在t但仍然未知。我们沉默DEK Jurkat细胞,检测细胞增殖与细胞计数和集落形成试验。然后,我们发现与CCK-8 DEK的药物对阿霉素的敏感性,细胞周期和细胞凋亡与强力霉素治疗。免疫印迹分析来确定细胞凋亡和细胞cycle-related基因的蛋白表达,包括BCL2L1 caspase-3,和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。最后,DEK的致瘤能力使用BALB / C裸小鼠模型进行了分析。在这项研究中,DEK Jurkat细胞中高度表达。DEK,可能导致减少细胞增殖和抑制细胞的比例s阶段细胞周期和细胞凋亡和强力霉素治疗后效果更明显。 Western blot results showed that DOX treatment leads to cell cycle arrest, reduction of cyclin-dependent kinase 6 (CDK6) protein, accumulation of CDKN1A protein, and DOX-induced apoptosis accompanied by reductions in protein levels of BCL2L1, as well as increases in protein level of caspase-3. Furthermore, DEK-silenced Jurkat cells generated a significantly smaller tumor mass in mice. Our study found that DEK is a novel, potential therapeutic target for overcoming DOX resistance in T-ALL.

1。介绍

t细胞急性淋巴细胞白血病(t)是一种严重的血液肿瘤转移,咄咄逼人,抵抗化疗(1),所有病例中占大约15%的儿童和25%的成年人(2]。诱导治疗的进步,所有患者的风平浪静的幸存者最近临床试验(超过85%3]。然而,大约20%的儿童和40%的成年人与t密集化疗后复发,导致50% - -60%的5年总生存期(4]。药物抗性是t的复发和死亡的主要原因5]。因此,resensitizing耐药白血病细胞对化疗可以提高所有患者的预后。

最近,基因表达系统一直强调[6]。DEK,原癌基因(卡片)在恶性肿瘤细胞中表达的是优先7]。DEK促进肿瘤发生不同类型的肿瘤细胞通过促进细胞增殖和细胞周期调节过渡,以及抑制细胞凋亡与衰老8]。此外,DEK删除诱导细胞凋亡伴随着增加TP53活动及其upregulation CDKN1A和伯灵顿9];这种效应可能与TP53的生长迟缓和激活函数。CDKN1A介导细胞周期阻滞在G1和G2期,导致细胞凋亡,并能有效地抑制CDK2 CDK3,到,CDK6 [10- - - - - -12]。DEK的差别在黑色素瘤,对这些显著增加细胞凋亡,通过强力霉素治疗衰老和TP53和CDKN2A水平没有影响但对CDKN1A和caspase-3水平有显著的影响(13]。DEK过度已经出现在许多肿瘤,包括慢性淋巴细胞白血病和急性髓系白血病(14,15]。然而,DEK参与t仍然是未知的。据报道,DEK沉默可能会增加癌症细胞对阿霉素的敏感性治疗nonsmall细胞肺癌和转移性结直肠癌16,17]。因此,我们假设DEK沉默可能提高白血病细胞的敏感性。

阿霉素(阿霉素)是一种蒽环霉素化学治疗剂,通常用于对所有18,19]。蒽环霉素如强力霉素、拓扑异构酶II,杀死白血病细胞通过抑制细胞RNA和DNA合成(20.,21]。然而,阿霉素的疗效是有限的药物抗性的发展在白血病细胞(22]。DEK缺陷在不同肿瘤细胞被证明能增加他们对阿霉素的敏感性(13,20.]。基于这些研究,我们认为的差别,对这些卡片能增强Jurkat细胞对阿霉素化疗敏感性的t细胞。

在这项研究中,我们确定卡片表达在不同的白血病细胞系,发现DEK Jurkat细胞中高度表达。因此,我们抑制DEK Jurkat细胞表达调查卡片的作用和底层机制在细胞对阿霉素的反应。我们也探讨了角色的DEK Jurkat细胞的致瘤性小鼠模型。我们的研究结果表明,DEK沉默可能增加的敏感性Jurkat细胞阿霉素治疗,作为一种很有前途的治疗方法管理DOX-resistant t。

2。材料和方法

2.1。细胞系

293 t, Raji SU-DHL-4、Daudi Nalm6, Jurkat, Panc-1, U937、曲泽、MCF-7细胞系(上海细胞库)。高糖DMEM (SH30022.01B Hyclone)是用于文化293 t, Panc-1, MCF-7细胞系。剩余的血液肿瘤细胞培养在rpmi - 1640行中(SH30809.01B Hyclone)。所有的细胞系在37°C和5%孵化有限公司2。

2.2。基因击倒

shrna针对卡片和消极的控制(争夺,可控硅)向量是从Genomeditech购买的。shRNA序列如下:shDEK-1, 5 - - - - - -GCCAGTGCTAACTTGGAAGAA-3 ;shDEK-2 5 - - - - - -GCCTGAAATTCTGTCAGATGAA-3 ;和争夺,5 - - - - - -GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 。Jurkat细胞系是慢病毒感染上层清液,然后分析在体外增殖,细胞生存能力、集落形成细胞周期和细胞凋亡。

2.3。rt - pcr

总RNA提取Jurkat细胞转导48 h后,使用Quick-RNA™Microprep工具包(美国CA Zymo欧文分校)。PCR进行LightCycler 96 PCR系统(罗氏生命科学,印第安纳波利斯,美国)。引物如下:GAPDH,向前,5 - - - - - -CTCTGATTTGGTCGTATTGGG-3 ,和反向,5 - - - - - -TGGAAGATGGTGATGGGATT-3 ;DEK,向前,5 - - - - - -AACTGCTTTACAACAGGCCAG-3 ,和反向,5 - - - - - -ATGGTTTGCCAGAAGGCTTTG-3 。DEK的相对表达式计算使用2- - - - - -ΔΔCt方法(24]。

2.4。集落形成实验

Jurkat细胞被播种到12-well板涂有琼脂糖顶部底部(1.2%和0.6%)的密度 细胞每口井和转导与慢病毒载体表达争夺成分或shDEK。经过14天的文化,殖民地的数量统计4 x使用倒置显微镜的放大(AE2000;Motic,中国)。

2.5。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

Jurkat细胞被播种在96孔板 细胞每口井和转导与慢病毒载体表达争夺成分或shDEK。在72 h后转导细胞生存能力是决定使用CCK-8 (Dojindo、日本)。然后,使用标在450纳米的光密度。

2.6。细胞凋亡分析

我们的种子 细胞每在6-well板和成长在37°C中含有强力霉素或PBS为4小时。然后,细胞被洗3次PBS和继续培养细胞孵化器。细胞被洗3次与PBS和收集,然后resuspended在100年μl 1 x绑定缓冲,沾膜联蛋白在室温下V-APC十分钟,然后沾propidium碘(PI)在室温下在黑暗中5分钟(BD生物科学)。

2.7。细胞周期分析

溴脱氧尿苷(美国BD生物科学BrdU)和PI双染色检测细胞周期分布。 细胞被播种和孵化3μg / ml BrdU 6-well 2小时的盘子。细胞被收获,与70%乙醇混合,一夜之间和固定在-20°C。样本处理根据APC-BrdU抗体(BioLegend),和π的解决方案是添加5分钟前流式细胞术分析。

2.8。西方墨点法

Jurkat慢病毒感染细胞收获5天后在里帕转导和细胞溶解后裂解缓冲(PC101 Epizyme生物技术)。然后,蛋白质样本混合1 x SDS (LT101S;Epizyme生物技术),煮10分钟,然后受到PAGE凝胶电泳。实验中使用的主要抗体包括卡片(E4S5J;细胞信号技术),GAPDH (D16H11;细胞信号技术),TP53 (7;细胞信号技术),原癌基因(ab32072;Abcam),到(A11136;ABclonal)、CDK6 (13331;细胞信号技术),CDKN1A (A1483; ABclonal), CDKN2A (ab151303; Abcam), caspase-3 (9662; Cell Signaling Technology), BCL2L1 (A19703; ABclonal) at 4°C, and HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit,7074S, anti-mouse; 7076S,Cell Signaling Technology) at room temperature for 2 h. The target protein was detected by using Omni-ECL™-enhanced chemiluminescent liquid (SQ101; Epizyme Biotech) and quantified using ImageQuant LAS 4000 mini (GE).

2.9。动物模型

107Jurkat可控硅细胞组或DEK击倒(KD)组注入皮下组织的成年女性BALB / c裸小鼠在100年一个卷μl为在活的有机体内肿瘤的生长研究。移植后30天,安乐死老鼠在每组肿瘤体积计算如下: 和肿瘤的大小进行了分析(23]。所有动物实验进行按照同济大学医学院的标准。

2.10。统计分析

所有的数据都显示为 ,和分析使用Prism 8.0执行。

未配对的双尾学生的 - - - - - -测试是用于数据分析。FCS表达10软件分析流式细胞仪数据流。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。DEK Jurkat细胞中高度表达

确定卡片表达在白血病,化验进行在不同白血病细胞系使用rt - pcr和免疫印迹。Raji细胞系表达最低的卡片被选为急性白血病和淋巴瘤细胞株中控制测试。Jurkat细胞系表现出最高水平的DEK信使rna和蛋白质(图1)。这些细胞系,这些结果表明,DEK高度参与t的发展。结果人类蛋白质的分析(https://www.proteinatlas.org/ENSG00000124795-DEK/tissue显示的DEK mRNA转录水平不同的癌症细胞系和正常组织(补充图S1)。因此,实验的卡片使用Jurkat细胞表型和功能进行了验证。

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图1
DEK高度表达Jurkat t细胞。(a) DEK Jurkat mRNA的表达情况,Daudi, Nalm6 Raji SU-DHL-4,细胞被rt - pcr分析。(b)蛋白表达水平的卡片,Jurkat GAPDH Daudi Nalm6 Raji SU-DHL-4,细胞。(c)量化DEK,蛋白质水平的光密度分析。 , ,和 。
3.2。shRNA-Mediated DEK击倒有效地抑制细胞增殖

我们使用了DEK-KD组和可控硅组在Jurkat细胞进行细胞增殖实验。如数据所示2(一个)和2 (b),shDEK有效地抑制DEK mRNA和蛋白表达Jurkat细胞而争夺成分。DEK的细胞增殖试验表明,可拆卸的显著抑制Jurkat细胞增殖与可控硅集团开始2天后转导(2天: ,每天4和6: ;图2 (c))。集落形成试验表明,殖民地由DEK-silenced细胞数量显著低于殖民地的数量由可控硅集团( 和 vs。 ; ;图2 (d))。一致的结果中观察到殖民地(图的大小2 (e))。这些数据表明,击倒的DEK抑制白血病细胞增殖和集落形成。因此,卡片是一个小说l所有治疗的目标。

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图2
DEK沉默有效地抑制细胞增殖。(a) DEK mRNA水平相对于GAPDH Jurkat细胞三种不同的慢病毒感染(可控硅,shDEK-1, shDEK-2)通过rt - pcr检测。(b)西方墨点法进行有效确认shDEK撞倒DEK Jurkat细胞蛋白表达。(c)细胞增殖试验。细胞人数统计(0,2,4,6天后转导。数据表示为 。 与可控硅; 。(d)集落形成试验。殖民地的数量由Jurkat细胞数在转导后14天。(e)殖民地的代表图像由DEK KD Jurkat细胞后14天。 和 。
3.3。DEK抑制Jurkat细胞对阿霉素的反应增加

我们对待可控硅Jurkat细胞和DEK-silenced Jurkat细胞与强力霉素,然后进行细胞生存能力,细胞凋亡和细胞周期分布。CCK-8分析的结果进一步表明,与负控制相比,击倒的DEK显著降低Jurkat细胞的细胞生存能力的强力霉素从0到10μ米(IC50可控硅集团:9.306 nM, IC50 shDEK集团:3.744 nM;图3 (f))。DEK-KD Jurkat细胞组的凋亡率 和 ,相比之下, 可控硅组如图3(一个)和3 (b)(shDEK-1: ,shDEK-2: )。阿霉素治疗后,DEK KD组的凋亡率 和 相比之下, 可控硅组(shDEK-1: ,shDEK-2: ;数据3(一个)和3 (b))。总之,这些结果证明,DEK沉默增加Jurkat通过强力霉素诱导细胞凋亡的细胞。

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图3
击倒的DEK促进阿霉素(阿霉素)诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞Jurkat细胞。(a, b)细胞处理车辆或强力霉素72 h在慢病毒感染后5天,然后,我们通过流式细胞仪检测细胞凋亡。(汉英)流式细胞术分析细胞周期进行检查阶段Jurkat细胞的分布。在可控硅(f)细胞生存能力和DEK KD组被CCK-8检测。数据表示为 。 , , ,和 ;shDEK-1 shDEK-2与可控硅或shDEK-1 +阿霉素和shDEK-2 +阿霉素与可控硅+阿霉素; 。可控硅:争夺RNA。

BrdU是合成胸苷模拟合并在S期细胞DNA复制的25]。DNA变性后,细胞染色允许BrdU公司,和任何其他靶细胞表面染色和/或细胞内的目标。细胞的s阶段DEK KD Jurkat细胞 和 与 在可控硅细胞G0 / G1期细胞的比例DEK KD组 和 与 可控硅的细胞3 (c)和3 (d)( ),和G2 / m期细胞的比例DEK KD组 和 与 在可控硅Jurkat细胞(shDEK-1: ,shDEK-2: )。与阿霉素治疗,s阶段细胞的比例 和 KD组 可控硅组(数字3 (c)和3 (e)shDEK-1: ,shDEK-2: )。这些结果表明,在正常生长条件下,DEK沉默导致减少在S期细胞分布,细胞逮捕在G0 / G1期,细胞周期阻滞于G2 / M期与强力霉素治疗。

3.4。DEK调节细胞凋亡和细胞Cycle-Related基因

DEK的贡献在癌症的发展过程中涉及到改变TP53 CDKN1A,原癌基因和其他细胞凋亡和细胞cycle-related基因(13,26]。在黑色素瘤,DEK沉默大大增加细胞凋亡,通过强力霉素治疗衰老和TP53和CDKN2A水平没有影响但对CDKN1A和caspase-3水平有显著的影响(13]。如数据所示4(一)- - - - - -4 (d),DEK沉默并不影响TP53的蛋白表达,原癌基因,或CDKN2A不管阿霉素的存在与否,与可控硅。然而,DEK沉默显著抑制BCL2L1蛋白表达在正常情况下( )并进一步减毒BCL2L1蛋白表达被压抑的阿霉素( )。相比之下,击倒的DEK进一步加强DOX-induced caspase-3蛋白表达( ;数据4(一)和4 (c))。关于细胞cycle-related基因,击倒的DEK显著抑制CDK6表达式在强力霉素,分别与可控硅集团(相比 )。DEK沉默也进一步加强DOX-induced upregulation CDKN1A表达式( ;数据4 (b)和4 (d))。这些数据表明,DEK沉默提高阿霉素的敏感性Jurkat细胞通过调节细胞凋亡,细胞cycle-related基因TP53 / CDKN2A c-Myc-independent方式。

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图4
表达的细胞凋亡,细胞cycle-related Jurkat细胞的蛋白质。(a, b)进行免疫印迹分析测量可控硅的蛋白质含量,shDEK-1或shDEK-2表示。(a, b)代表墨迹图所示。(c) (a)的量化。(d) (b)的量化。GAPDH是作为内部控制。数据表示为 。 , , , 与可控硅; 。可控硅:争夺RNA。
3.5。DEK沉默降低肿瘤发生Jurkat细胞的能力

调查DEK压制体内的影响,我们建立了一个肿瘤模型通过皮下注射DEK-silenced Jurkat细胞或控制细胞在成年女性BALB / C裸小鼠。DEK KD组肿瘤体积 和肿瘤重量 ,而可控硅组肿瘤体积 和肿瘤重量 (数据5(一个)- - - - - -5 (c), )。DEK KD老鼠不那么咄咄逼人,显示较小的肿瘤大小比我们注射的老鼠可控硅Jurkat细胞。

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图5
在活的有机体内肿瘤发生的研究能力。击倒的DEK抑制的增长Jurkat在小鼠细胞来源的肿瘤。(一)肿瘤细胞来源于Jurkat的形象。(b, c)肿瘤重量和卷在接种后30天与消极的控制或shDEK Jurkat细胞转导。 与可控硅, 。可控硅:RNA的争夺;KD:击倒。

4所示。讨论

t是一个严重的血液肿瘤和高度耐化疗,在成人和儿童中均可发生,高复发(27,28]。DEK发挥着潜在的作用在造血和特异表达在急性髓系白血病和慢性淋巴细胞白血病(14,15];然而,DEK参与t仍然未知。

许多研究把重点放在了细胞因子的表达(29日]。值得注意的是,据报道,在大多数肿瘤中卡片是过表达的不同的起源,和肿瘤发生是促进通过促进细胞自我更新和增殖,抑制细胞凋亡,恶性肿瘤细胞的分化、衰老(8,9]。DEK-targeted抑制被认为是一种有效的治疗策略不同的恶性肿瘤由于其频繁upregulation在人类恶性肿瘤被认为是一种癌基因(30.]。

在这项研究中,Jurkat细胞治疗阿霉素诱导细胞凋亡,细胞生存能力下降,细胞周期阻滞。与负控制相比,击倒的DEK提升DOX-induced细胞凋亡细胞和细胞增殖而进一步减少s阶段与阿霉素Jurkat细胞,伴有显著改变细胞凋亡和细胞cycle-related基因的表达。DEK沉默对TP53-related没有影响细胞凋亡和CDKN2A-induced Jurkat细胞衰老与强力霉素治疗。因此,DEK超表达可以抑制TP53的活动和CDKN2A Jurkat细胞通过替代机制。DEK作为转录辅阻遏物抑制NF -κB信号,NF -κB可以参与恶性造血细胞系的细胞凋亡过程作用于CDKN1A [28]。CDKN1A在G1 / S细胞周期蛋白直接有效地抑制角色转变,包括CDK2、CDK3,到,和CDK6,但它能抑制其他已知CDKs差(11,12]。因此,还需要进一步的研究来确定DEK作用于CDKN1A Jurkat细胞通过NF -κB。

细胞凋亡是一个复杂的生物过程,和化疗药物常用于杀死肿瘤细胞治疗肿瘤。抗癌药物的广泛应用,调节异常的凋亡通路已被证明在药物抗性中发挥不可替代的作用。通过bcl - 2抗凋亡蛋白BCL2L1调节凋亡细胞死亡。BCL2L1与化学抗性的表达增加t [31日]。与我们的结果一致,可拆卸的DEK减毒BCL2L1 Jurkat细胞的表达,并与阿霉素效果更明显。这些结果表明,DEK沉默提高Jurkat细胞化疗药物的敏感性。

Caspase-3是一个著名的proapoptotic标记。在细胞凋亡Proapoptotic caspase-3经常被激活。DEK沉默激活肿瘤细胞的凋亡procaspase-3 caspase-9和随后的乳沟和激活,然后开辟不同的细胞内源性底物导致细胞死亡32,33]。因此,DEK沉默可能增强DOX-induced激活细胞凋亡的线粒体途径通过激活caspase-9然后caspase-3 Jurkat细胞。符合在体外数据,可拆卸的卡片也抑制的增长Jurkat细胞来源的肿瘤在小鼠模型中,表明DEK在治疗t是一个有前途的治疗目标。

总之,DEK的删除在强力霉素治疗导致的过度caspase-3 BCL2L1的差别,对这些指示它的作用在调节细胞凋亡;CDK6水平降低,CDKN1A的表达增加,表明它在调节细胞周期中的作用。这些结果表明,抑制DEK表达式结合强力霉素治疗是所有可能的治疗策略。一般来说,这些数据表明,DEK沉默在t细胞增加他们对阿霉素的敏感性和t可能作为小说的治疗目标。

5。结论

总之,DEK Jurkat中高度表达的细胞,促进细胞增殖和体外集落形成。DEK沉默可以促进DOX-induced细胞凋亡和细胞周期阻滞,从而增加治疗Jurkat细胞对阿霉素的敏感性。尽管底层机制和DEK对正常细胞的影响需要进一步的研究,我们的研究结果表明,廉价的卡片是小说,潜在的治疗方法来克服耐阿霉素在所有治疗。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

所有实验和程序进行了符合道德原则的同济大学医学院和接收道德同济大学动物伦理委员会的批准。

书面知情同意当时从所有参与者获得获得同意参与。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

WZ,艾尔和JX提供生物材料和试剂,和通用汽车和ZZ修订后的手稿。XT负责设计并进行实验和分析数据的文章写作。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

我们感谢同济大学医学院的研究人员在协助执行实验。本研究由科技部支持的中华人民共和国(批准号2021 yfa1100800)和中国国家自然科学基金(批准号81770151)。

补充材料

补充图S1: DEK高度表达的肿瘤细胞系。(补充材料)