文摘
背景。以铂为基础的化疗是治疗患者的首选诊断为肺小细胞癌(SCLC)。然而,许多病人表现出耐药性。因此,必须进一步研究这个治疗预后的生物标志物指示灵敏度。方法。我们收集和RNA序列执行45 SCLC样本珠江医院(Local-SCLC)。此外,我们使用一个公共群组从乔治等人作为验证队列(George-SCLC)。转化生长因子β信号通路(TGFB)激活状态决定根据相关ssGSEA得分。我们分析了免疫细胞比率,途径激活分数,和免疫相关基因在SCLC患者进一步阐明潜在的机制。结果。高TGFB通路的激活状态与预后改善SCLC患者铂类化疗(Local-SCLC: ,(95% CI, 0.13 - -0.84), ;George-SCLC: ,(95% CI, 0.28 - -0.98), )。免疫渗滤分析表明,TGFB-HIGH组有更多的巨噬细胞M1和Th1细胞,而M2巨噬细胞较少,Th2细胞,Treg细胞Local-SCLC队列中被发现。机械的分析表明,在STING-mediated TGBF-HIGH组调节免疫、细胞凋亡、细胞周期阻滞,以及在DNA损伤修复过程中表达下调。结论。SCLC患者表现出高TGFB通路的激活状态展示一种改进的预后与含铂化疗。可能潜在的机制可能与抑制抗肿瘤免疫增强和DNA损伤修复。
1。介绍
肺癌的第二种最常见癌症(11.4%)和全世界癌症相关死亡的主要原因(18%)(1]。小细胞肺癌(SCLC)被定义为一种罕见的肺癌,占大约15%的肺肿瘤的存在(2,3]。作为一个积极的神经内分泌肿瘤,其迅速发展和早期转移给SCLC异常高死亡率比其他常见的实体肿瘤,观察到的5年生存率很低(5 - 10%),和每年估计全世界有200000人死亡4- - - - - -6]。SCLC患者治疗的临床进展缓慢,与含铂化疗是目前最常见的治疗多数SCLC患者(7]。不幸的是,尽管大多数SCLC患者表现出良好的反应在早期阶段的化疗疗程,超过90%的患者对化疗产生抗药性,随后最终死于肿瘤复发8- - - - - -10]。因此,为了提高SCLC患者的化疗预后至关重要的生物标志物识别表明患者铂类化疗的敏感性,进一步探索相关的可能的潜在机制。
以铂为基础的化疗抵抗SCLC患者可以由许多因素引起的。例如,减少药物的吸收,提高药物输出,增强药物的代谢,并增加DNA损伤修复都可以导致阻力以铂为基础的化疗,导致贫困SCLC患者的预后结果(11,12]。目前,肿瘤免疫微环境的影响(时间)在化疗的疗效逐渐受到更多的关注(13,14]。研究表明,化疗中介导的抗肿瘤效应,激活免疫系统的一部分15]。许等人发现,T细胞免疫反应的激活能逆转肿瘤的药物抗性16]。此外,免疫细胞渗透可以有效地用来预测病人的化疗敏感性。Pfannstiel等人证实,用丰富的肿瘤浸润淋巴细胞亚型患者对化疗的反应表现出一种改进的(17]。
转化生长因子β信号通路(TGFB)可以证明一个肿瘤抑制的影响(18]。研究表明,TGFB通路能够抑制肿瘤细胞分裂和增殖抑制原癌基因表达(19]。张等人发现,高表达的TGFB1 SCLC患者的癌症相关的成纤维细胞(战乱国家)与有效抑制肿瘤的生长,增强对放疗的敏感性和抗肿瘤免疫(20.]。TGFB通路的影响在SCLC患者的化疗敏感性尚未研究的角度TGFB通路的激活水平。单样本基因集富集分析(ssGSEA)算法可以用来确定每个样本的途径激活水平,已用于一些研究调查的具体途径激活的预后影响患者的预后。例如,周等人用DDR及其subpathways ssGSEA评分,探讨影响DDR途径激活状态的转移移行细胞癌患者的预后21]。峰等人使用ssGSEA发现高趋化因子受体3通路的激活状态为患者提供了潜在的预后预测免疫抑制剂(检查站22]。
在这项研究中,RNA序列进行SCLC患者铂类化疗从广州医科大学第一附属医院,中山大学癌症中心,南方医科大学珠江医院(Local-SCLC)。此外,我们还得到另一个验证队列由乔治et al。23]。TGFB的影响途径激活水平SCLC患者的化疗预后研究基于ssGSEA算法。SCLC患者的免疫细胞比率和免疫相关基因进行了分析。可能的机制负责TGFB途径激活改善化疗预后是推断(GSEA)使用基因集富集分析,主成分分析(PCA)和ssGSEA。
2。方法
2.1。收购临床组表达谱和相关信息
我们收集的样本SCLC患者铂类化疗从广州医科大学第一附属医院,中山大学癌症中心,南方医科大学珠江医院(Local-SCLC)和执行RNA序列。详细的样品处理方法中可以找到林等人的研究(24]。另一个群SCLC患者接受以铂为基础的化疗是来自乔治等人的研究(George-SCLC) [23]。临床资料和样品RNA-seq数据选择包容。Local-SCLC队列和George-SCLC队列包括45和在这项研究中,68名病人。
2.2。预后和药物敏感性分析预测
包含在转化生长因子的基因β信号通路(TGFB)从MSigDB获得数据库(25)(补充表1)。使用GSVA ssGSEA分析R包(26)确定TGFB通路的激活水平的基础上获得ssGSEA得分。SCLC患者分为低激活组(TGFB-LOW)和高活化组(TGFB-HIGH)基于ssGSEA的平均分数。kaplan meier (km)生存分析是用来确定的预后影响TGFB途径激活。基于样本的转录组数据,pRRophetic算法(27)是用来预测每个样本对顺铂治疗的反应。
2.3。免疫渗滤和代谢活动的分析
IOBR包(28)是用于执行史诗、MCPcounter和伊势亚分析免疫细胞免疫微环境的渗透。此外,IOBR R包包含许多肿瘤免疫和细胞代谢相关的基因集。我们使用了IOBR包执行PCA算法为了确定TGFB-HIGH和TGFB-LOW团体之间的差异在这些基因集。
2.4。富集分析
根据测序后基因使用limma R值获得微分表达式分析包(29日],GSEA分析,然后使用clusterProfiler R包执行(30.]。此外,GSVA R包(26)被用来执行ssGSEA分析。基因本体论的条目(去),京都基因和基因组的百科全书(KEGG)和Reactome被用于分析。条目的值 被认为是具有统计学意义。
2.5。统计分析
的Mann-WhitneyU测试是用来比较两组之间的连续变量。的使用kaplan - meier (km)方法和生存率较生存分析。单变量和多变量COX比例风险模型被用来确定临床相关参数的影响和TGFB途径激活分数的预后。time-dependent-ROC由timeROC R包(31日]。斯皮尔曼相关系数用于相关分析。值, 被认为是具有统计学意义。箱线图绘制使用ggplot2 R包(32]。统计测试都是双面的。数据1和2创建与BioRender (BioRender.com)。进行了统计检验和视觉分析使用R软件(版本4.1.2)。
3所示。结果
3.1。激活的TGF -β信号通路与改进的SCLC患者的预后相关
图中展示了我们工作的流程图1。SCLC患者两组分为低激活组(TGFB-LOW)和高活化组(TGFB-HIGH)根据ssGSEA TGFB通路的分数。临床统计TGFB-LOW和TGFB-HIGH组之间Local-SCLC队列和George-SCLC群组被发现没有统计上的不同( ,补充表2和3)。生存分析显示,在这两个军团,TGFB-HIGH组表现出更好的总生存期(OS) (Local-SCLC: ,(95% CI, 0.13 - -0.84), ,图3(一个);George-SCLC: ,(95% CI, 0.28 - -0.98), ,图3 (b))。TGFB通路激活状态和临床信息包含在单变量和多变量COX模型。Local-SCLC队列,TGFB通路的激活是一个独立的预后危险因素( ,图3 (c))。George-SCLC队列,单变量COX模型表明,高TGFB通路的激活与SCLC患者改善预后与含铂化疗( ,图3 (d))。Time-dependent-ROC显示的1 - 3年的auc TGFB ssGSEA得分0.755和0.785在Local-SCLC George-SCLC 0.630和0.601,分别为(补充图1)。我们还分析了影响TGFB通路中的基因SCLC患者的操作系统。Local-SCLC队列,大多数基因TGFB对操作系统有保护作用;然而,在George-SCLC队列,只有两个基因对操作系统有显著保护作用(补充表4)。此外,TGFB-HIGH组表现出显著降低估计IC50值George-SCLC队列以铂为基础的化疗药物( ,补充图2)。
(一)
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3.2。分析Iimmune-Rrelated Ggenes和Iimmune Iinfiltration
我们比较了两组之间的一些免疫相关基因的表达。Local-SCLC队列中,我们观察到的高表达的基因包括CXCL9 CXCL10,云母,IFIT2, TNFRSF4, IRF7 TGFB-HIGH组(所有 ,图4(一))。也观察到类似的结果George-SCLC队列(所有 ,图4 (b))。我们进一步分析了coexpression TGFB通路中的基因与免疫相关基因,可以发现TGFB通路中的基因有很强的正相关与免疫相关基因在Local-SCLC队列(补充图3, ),而在George-SCLC队列,这有很强的正相关关系主要是发生在RHOA, TGFB1和TGFBR2(补充图3 b, )。
(一)
(b)
接下来,我们评估两组免疫细胞浸润。Local-SCLC队列,巨噬细胞、巨噬细胞M1和Th1细胞被发现TGFB-HIGH组高于TGFB-LOW组,而Th2细胞亚群,M2巨噬细胞低于TGFB-LOW组(所有 ,图5(一个))。George-SCLC队列,有更多的B细胞、CD4 + T细胞M1巨噬细胞、NK细胞和髓系树突状细胞TGFB-HIGH组比TGFB-LOW组(所有 ,图5 (b))。PCA分析基于IOBR包内置的几种基因设置显示TGFB-HIGH组两个组别有更高的细胞毒性细胞、类MHC I, I型干扰素反应比TGFB-LOW组(所有 ,图6(一);补充图4)。
(一)
(b)
(一)
(b)
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3.3。通路富集分析和代谢活动分析
两个组别进行功能富集分析。ssGSEA结果显示细胞对顺铂的反应,STING-mediated诱导宿主免疫反应,激活免疫反应,I型干扰素生物合成的过程中,抗原处理和表示,和多种免疫细胞激活通路都显著调节TGFB-HIGH组(所有 ,图6 (c),补充图4摄氏度)。
GSEA结果表明Local-SCLC队列,有丝分裂细胞周期阻滞等途径,细胞凋亡,吞噬,ferroptosis, necroptosis,内在和外在的细胞凋亡均显著地调节TGFB-HIGH集团( , ,图7(一),补充图5 a - b),而DNA修复、DNA复制监管、和notch信号通路显著下调TGFB-HIGH组( , ,图7 (b))。GSEA浓缩导致George-SCLC群组验证我们的发现Local-SCLC队列( , ,图7 (c); , ,图7 (d))。在化疗耐药性肿瘤代谢的作用近年来吸引了越来越多的关注(33,34]。我们检查了相关的差异基因集内置IOBR包在两个军团。我们观察到甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢,果糖和甘露糖代谢和烟酸和烟酰胺的代谢调节TGFB-HIGH组两个组别(所有 ,图6 (b),补充图4 b)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
我们的研究显示,高TGFB通路的激活状态与更好的预后显著相关SCLC患者以铂为基础的化疗。我们分析了免疫相关基因的表达,以及在SCLC患者免疫细胞浸润。我们发现病人TGFB-HIGH组的特点是一个抗肿瘤免疫微环境,促进和增强以铂为基础的化疗药物的细胞毒性与癌症。富集分析进一步表明,改善预后观察TGFB-HIGH组可能归因于STING-mediated I型干扰素的分泌和合成免疫激活,联同一个DNA修复和增强细胞凋亡的能力减弱,随后所有的提升了SCLC的敏感性,以铂为基础的化疗。因此,我们推断高TGFB通路的激活状态可能会加强SCLC患者铂类化疗的敏感性通过激活免疫力,抑制修复、促进细胞凋亡(图2)。
高TGFB通路的激活状态的特征是一种免疫相关基因表达模式,有利于化疗。我们观察到特定的免疫相关基因的高表达(如CXCL9 CXCL10, TNF) TGFB-HIGH组。以前的研究已经指出这些基因之间的关系,以铂为基础的化疗的疗效。CXCL9 [35]和CXCL10 [36)能有效地抑制血管生成,增强肿瘤细胞的凋亡和免疫渗透,加强以铂为基础的化疗药物的抗肿瘤免疫治疗。吴et al。37]证明体外云母可以增强化疗药物的抗肿瘤活性增强tumor-killing NK细胞和T细胞的活性。此外,研究表明,IL-32 [38)和肿瘤坏死因子(39可以增强cisplatin-induced细胞凋亡。Upregulation IFIT2逆转有顺铂耐药性的表型(40]。此外,TNFSF10高表达患者对化疗的反应通常表现出良好的(41),而TNFRSF4与化学敏感性和卵巢癌患者预后良好42),IRF7调节患者化疗反应组(43]。IL-7、il - 12和IL-27 TGFB-HIGH组高度激活的信号通路,和研究表明,他们可以增强化疗药物的抗肿瘤反应44- - - - - -46]。因此,一个高TGFB通路的激活状态可能会改善在SCLC患者对化疗的反应影响免疫相关基因的表达。
高的激活TGFB途径表达免疫微环境有利于化疗药物的抗肿瘤效果观察。时间可以影响化疗药物的抗肿瘤作用[13,14]。我们的研究结果显示,SCLC患者TGFB-HIGH组表现为免疫激活和微分免疫细胞浸润。γ/δT细胞可以增强carboplatin-induced细胞毒性与先进的膀胱癌细胞(47]。细胞毒性淋巴细胞和NK细胞可以通过分泌抑制肿瘤恶化穿孔素和granzyme杀死异常细胞48,49]。亚群可以抑制抗肿瘤免疫反应,和一个低程度的Treg渗透TGFB-HIGH组促进免疫抑制效应的消除(14,50]。关于辅助T细胞,upregulation Th1 Th2 TGFB-HIGH组的差别,对这些帮助化疗药物对抗肿瘤细胞(50]。不同表型的巨噬细胞对化疗产生不同的影响结果。我们观察了巨噬细胞M1和M2巨噬细胞TGFB-HIGH组相比Local-SCLC TGFB-LOW集团。一般来说,M1巨噬细胞抑制肿瘤的生长,而M2巨噬细胞促进肿瘤进展通过抑制免疫反应(51,52]。最后,B细胞渗透呈正相关,长期无病生存在接受化疗的患者53]。基于上述研究结果,我们推测抗肿瘤免疫微环境特征观察TGFB-HIGH组可能导致以铂为基础的化疗的疗效和活动来消除肿瘤。
DNA修复的抑制,与增强的细胞凋亡状态TGFB-HIGH组中观察到,增强以铂为基础的化疗药物的抗肿瘤效果。GSEA浓缩的结果分析表明,TGFB-HIGH组特点是细胞周期阻滞,减少修复DNA损伤的能力,并增强多个细胞死亡途径和更大的吞噬作用。附属的治疗机制,顺铂破坏肿瘤细胞DNA的platinum-DNA加合物的形成,导致细胞周期阻滞和复制抑制。如果DNA损伤repair-related途径能够成功修复DNA损伤所引起的以铂为基础的化疗,肿瘤可以避免死亡,从而开发药物抗性。相反,DNA损伤修复能力薄弱导致细胞无法完整的DNA损伤修复,进而导致肿瘤细胞的死亡以各种形式,导致肿瘤对化疗药物的敏感性,从而发挥抗肿瘤效应(11,54]。因此,在这项研究中,观察到的低DNA修复功能和细胞凋亡增加TGFB-HIGH组促进小细胞肺癌患者中顺铂的抗癌效果。
高TGFB通路的激活状态可能增强的抗肿瘤效应通过激活刺途径以铂为基础的化疗。ssGSEA分析表明,SCLC患者TGFB-HIGH组了一个调节反应顺铂以及高STING-mediated免疫反应途径的激活状态。研究表明,以铂为基础的化疗可以提高抗肿瘤免疫反应的激活刺通路(55]。注册会计师的感官异常的存在细胞质DNA,可以转换为cGAMP允许它绑定到刺痛。cGAMP-STING复杂然后激活TBK1-IRF3信号诱导轴I型干扰素的分泌,进而激活先天免疫。I型干扰素包含多个抗癌特性,因此可以成功地抑制肿瘤恶化[56]。作为抗原递呈细胞,DCs可以呈现抗原T细胞和驱动肿瘤抗原T细胞的形成。刺激活诱导的I型干扰素生产丰富costimulatory活动增强抗肿瘤功效的DCs和增强他们的能力cross-present抗原T细胞(57]。因此,我们推断,改善预后TGFB-HIGH组STING-mediated免疫激活密切相关。
TGFB-HIGH组的代谢变化也可能是SCLC患者化学敏感性的一个可能的原因。赵等人发现抑制丝氨酸新陈代谢可以减少有毒,proapoptotic以铂为基础的化疗对胃癌细胞的影响通过染色质密度增加,从而促进耐药性(58]。冈萨雷斯等人证明了甘露糖的结合与传统化疗可以使肿瘤细胞对化疗敏感的影响[抗凋亡蛋白的水平59]。魏等人发现,烟酰胺逆转乳腺癌细胞的抗阿霉素通过抑制SIRT1 / Akt通路(60]。因此,代谢变化可能也有助于解释结果改善化疗治疗小细胞肺癌患者的预后方面高TGFB通路的激活状态。
5。结论
在这项研究中,我们发现高TGFB通路的激活状态可以作为生物标志物预测对SCLC患者以铂为基础的化疗敏感性。TGFB-HIGH组表现出不同的免疫相关基因模式和免疫细胞浸润状态TGFB-LOW组。机械的分析表明,改进的SCLC患者的预后TGBF-HIGH组增加STING-mediated I型干扰素分泌,增强抗肿瘤免疫力,减少DNA损伤修复、增强细胞凋亡。
缩写
| TGFB: | 转化生长因子β信号通路 |
| TGFB-HIGH: | 高转化生长因子激活状态β信号通路 |
| TGFB-LOW: | 低活化转化生长因子的状态β信号通路 |
| SCLC: | 小细胞肺癌 |
| 时间: | 肿瘤免疫微环境 |
| GSEA: | 基因集富集分析 |
| ssGSEA: | 单样本基因集富集分析 |
| 主成分分析: | 主成分分析 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| 走: | 基因本体论 |
| 操作系统: | 总生存期 |
| NK: | 自然杀伤细胞 |
| 亚群: | 调节性T细胞 |
| 干扰素: | 干扰素 |
| DCs: | 树突细胞 |
| 战乱国家: | 癌症相关成纤维细胞 |
| Th: | 辅助T细胞 |
| IL: | 白介素 |
| 中华民国: | 接受者操作特性 |
| AUC: | 曲线下的面积。 |
数据可用性
期间产生的所有数据或分析本研究包括在发表的这篇文章(https://www.cbioportal.org/study/summary?id=sclc_ucologne_2015)。所有其他相关数据可从这项研究的作者。
伦理批准
患者/参与者提供了他们的书面知情同意参加本研究,这里的研究已经完成符合赫尔辛基宣言和伦理委员会批准了南方医科大学珠江医院。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
Anqi林和Lingxuan朱负责数据管理,调查,正式的分析,资源、软件、验证、可视化、写初稿,审查和编辑。爱民江还负责数据管理、调查、正式的分析,资源、验证、可视化、写评论,和编辑。获刑也谅解备忘录管理调查,写评论,编辑。剑张和彭罗概念化,负责融资收购,项目管理,资源,写评论,编辑和监督。所有作者的文章和批准提交的版本。爱民江朱Lingxuan Anqi林,对这项工作同样做出了贡献,分享第一作者。
确认
这项工作得到了广东省自然科学基金(批准号2018 a030313846和2021 a1515012593)和中国国家自然科学基金(批准号。81802257,81871859,81772457,82172750,,82172811)。
补充材料
补充1。补充表1:包含在转化生长因子基因的名字β信号通路。
补充2。补充表2:SCLC患者的临床统计Local-SCLC队列TGFB-HIGH和TGFB-LOW组。
补充3。补充表3:SCLC患者的临床统计George-SCLC队列TGFB-HIGH和TGFB-LOW组。
补充4。补充表4:单变量COX回归分析TGFB通路中的基因在两个组别。
补充5。补充图1:时间ROC分析预测1 -和3年OS在Local-SCLC SCLC患者组(a)和George-SCLC组(b)。
补充6。补充图2:预测IC50值George-SCLC SCLC患者的队列。
补充7。补充图3:基因之间的相关性在Local-SCLC TGFB通路和免疫相关基因群(a)和George-SCLC组(b)。 ; ; ; 。
补充8。补充图4:PCA和ssGSEA分析SCLC患者George-SCLC队列。(一)PCA分析George-SCLC队列的几种途径。(b) PCA分析George-SCLC相关通路的队列。(c)在George-SCLC ssGSEA队列的结果。 ; ; ; 。
补充9。补充图5:GSEA浓缩导致Local-SCLC队列中没有显示的主要文本。