文摘

在坟墓的疾病(GD)治疗,坟墓的眼病(去)往往被忽视,因为只有在GD年初温和的眼部症状出现。因此,我们等压标签进行相对和绝对定量(iTRAQ)分析和测量相关的内分泌激素来识别的诱发因素。血清样本3轻度GD患者,3 GD患者iTRAQ但没有去分析了。基于他们的临床数据,60例GD患者分为自由吧,去组。所有患者随访7个月。他们的眼部条件和相关生化指标的变化都被记录下来。iTRAQ结果表明RhoA表达式是调节和显著相关紧密连接通路和免疫力。发生的变化和RhoA从基线到7个月,发生和RhoA基线水平,TRAb效价水平GD患者组之间的显著不同。ELISA和免疫印迹RhoA TRAb,发生在去病人的血清样本显示重大upregulation,升高血清RhoA以及TRAb水平的轻微的阶段。在7个月,血清RhoA和发生水平升高。 RhoA is a potential biomarker for mild GO. In GD patients, if an elevated serum RhoA level is accompanied by an elevated TRAb or FT3 level, GO is highly likely to occur, even when obvious ocular symptoms are absent.

1。介绍

甲状腺机能亢进(GD)是一种自身免疫性甲状腺疾病和成人甲状腺机能亢进的主要原因。发病率约3%,女性为0.5%,男性(1,2]。Graves眼病(去)是最常见的extrathyroidal表现。大约25% -50%的GD患者眼部受累(3,4]。大多数患者有甲状腺机能亢进,但少数情况下可能不足或euthyroid [5- - - - - -7]。大约90%的患者显示症状的眼睑收缩,这是一个最初的症状和疾病早期的迹象8,9]。大约3%到5%的患者会出现严重的疾病,包括严重的炎症,眼睛疼痛,该人群角膜溃疡或压缩视神经病变(CON) [3,4,10,11]。是经常被忽略的出现由于只存在轻度眼症状在早期阶段。

蛋白质组学是一个大规模、高通量和系统研究蛋白质的组成和功能的特定类型的细胞,组织或体液。高质量蛋白质分离和识别技术结合充分利用生物信息学反映蛋白质的组成和表达水平的变化作为一个整体,这有助于识别相关疾病的形成和发展,探讨疾病发生和发展的过程。生物机制和临床相关研究以及研究和开发新的药物靶点等,被广泛使用12- - - - - -14]。近年来,高通量质谱已经实现,用于检测血清蛋白质的研究,揭示许多分子生物标志物的价值。

在过去的几十年里,走的发病率有增加的趋势。会严重影响视力,导致失明和抑郁症在大多数病人。因此,在温和的早期治疗阶段的疾病可能会导致一个更好的预后。本研究的目的是确定风险因素导致的发病,为其早期诊断是非常重要的。我们观察到GD患者的内分泌激素水平的变化,发现可能的早期诊断标志物的蛋白质组学,向反对的早期诊断和预防视力损害造成的。我们试图为改进的诊断和治疗提供新思路和评估预后。

2。材料和方法

2.1。主题

我们收集的临床资料并对GD病人血清样本的天津医科大学总医院从2018年6月到2019年10月。我们随机采集静脉血中3例轻度阶段第一次被诊断为复杂GD(实验组)和3诊断使用GD不去(对照组)治疗在天津医科大学眼科医院从2020年1月至2020年10月。本研究通过天津医科大学眼科医院基金会制度审查委员会2020号(REC肯塔基州(L) -01)和遵循赫尔辛基宣言的原则。书面知情同意了所有研究对象。研究参与者没有经济补偿。

GD的诊断标准如下(1,2):(1)临床诊断甲状腺机能亢进,(2)弥漫性甲状腺肿大(触诊和b超证实了),在某些情况下缺乏甲状腺肿,(3)眼球突出和其他浸润眼迹象,(4)前胫骨黏液水肿,和(5)TRAb TSAb, TPOAb积极性。上述标准,项目(1)和(2)是必不可少的诊断、项目(3),(4),(5)诊断的辅助因素。

去诊断标准如下(5):(1)轻度去通常涉及一个或多个下列症状:轻微的眼睑收缩(< 2毫米),轻微软组织损伤, mm相同的人口和性别,没有复视或间歇复视,和角膜暴露可改善润滑剂,和(2)中度到重度通常有以下两个或两个以上的症状:眼睑 毫米,中度或严重的软组织损伤,眼球突出≥相同的人口和性别正常价值3毫米,和持续或间歇性复视。

实验组的入选标准如下:(1)早期诊断的GD眼病,(2)眼病诊断为轻度,(3)规定对GD口服甲巯基咪唑治疗,和(4)没有治疗眼病。

对照组的入选标准如下:(1)早期诊断的GD没有眼病和(2)口服甲巯基咪唑治疗GD规定。

排除标准如下:(1)甲状腺机能亢进引起的结节性甲状腺肿、甲状腺癌,高功能腺瘤、甲状腺炎、甲状腺切除术(2),(3)原发性甲状腺功能减退,(4)轨道炎症要,眼眶蜂窝织炎,和轨道肉芽肿、怀孕等,(5)。

患者分为两组基于改变眼睛的条件:一个自由(36例)组和组(24例)。所有患者甲巯基咪唑GD。根据EUGOGO [5),所有患者去组根据CAS进行评估。没有病人得分高于3。因此,没有一个病人被认为在活动性疾病阶段。因为这些病人第一诊断内分泌部、眼部疾病的表现可能不明显。

2.2。相对和绝对量化等压标签(iTRAQ)蛋白质谱分析

外周静脉血液收集患者尽快去释放疾病和离心分离血清,立即被储存在-80°C。丰富的蛋白质被据的指示ProteoMiner™工具(Bio-Rad实验室、美国)。根据BCA蛋白质进行了量化方法,和sds - page。样本减少,烷基化,保持酶的水解。同位素质量标签iTRAQ试剂用于标签和高pH值反相分离。最后,蛋白质样品进行了分析使用nanoupgraded反相chromatography-TripleTOF™5600。

2.3。ELISA

使用血清分隔符管,血液样本可以凝结了两个小时在室温下或在一夜之间在4°C离心20分钟 。刚做好的血清立即化验或存储在整除在-20°C或-80°C,供以后使用。实验根据制造商的协议发生的酶联免疫试剂盒(LEVELOP,无锡,中国)和TRAb酶联免疫试剂盒(GTX公司中国上海)。

2.4。西方墨点法

全血样品在4°C离心机 20分钟。血清样本添加到血清蛋白提取和离心机 在4°C 10分钟。蛋白质(30μg)是由sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad实验室、美国)。膜清洗1 - 2分钟在0.1% Tween-20 (TBST) (Solarbio,北京),阻塞(脱脂奶粉5%)在37°C 1小时,和孵化主要抗体RhoA (Abcam 1: 5000年,英国),一夜之间在4°C。与TBST三次洗涤后,细胞膜孵化了一只兔子/鼠标二级抗体室温1小时和暴露。

2.5。生化指标检测

血从早上禁食的病人。化学发光免疫测定用雅培试剂和仪器被用来测量自由甲状腺功能。化学发光免疫测定使用德国西门子试剂和仪器用于TPOAb和TgAb检测。电化学发光免疫测定使用罗氏试剂和仪器被用来检测TRAb。参考价值的范围是2.63 ~ 5.70发生pmol / L, 9.01 ~ 19.05为FT4 pmol / L, 0.350 ~ 4.940μU / L TSH, 0.00 ~ 1.75 IU / L TRAb, TPOAb 0.00 ~ 35.00国际单位/毫升,0.00 ~ 40.00 TgAb国际单位/毫升。因为TPOAb的测量范围为10 ~ 1000国际单位/毫升,a 国际单位/毫升被认为是1000国际单位/毫升,同样,作为TgAb的范围是20 ~ 3000国际单位/毫升,a 国际单位/毫升被认为是3000国际单位/毫升。

2.6。数据收集

我们进行了一项7月龄随访记录病人的血清样本和临床数据从2018年6月到2019年10月。年龄、性别、治疗甲状腺疾病,甲状腺机能亢进的历史,和每月的thyroid-related激素水平(发生、FT4、TSH、TRAb TPOAb,和TgAb)收集、相关生化指标和各种眼睛的发生时间测量迹象。

2.7。统计分析

分析使用SPSS 23.0版和GraphPad棱镜为Windows 8.0版本。所有数值数据符合正态分布表示为 。数据不符合正态分布作为中位数(四分位范围),和枚举数据为百分比。的Mann-Whitney测试是用于比较的年龄。双尾确切概率测试应用于比较计数数据。Mauchly Greenhouse-Geisser的测试和校正方法用来确定甲状腺激素水平显著差异之间的连续数据组。斯皮尔曼等级相关系数是用来确定不同的激素或抗体效价的水平两组相关的发生。ROC曲线被吸引到评估是否激素或抗体水平预测发病机制在特定截止的水平。ROC曲线下的面积(AUC)是诊断价值进行评估。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。人口和眼科的数据

的去释放组相似年龄诊断和性(补充表1)。

3.2。结果iTRAQ

我们从3随机采集静脉血GD患者(实验组)和3 GD患者(对照组)没有去匹配的性别与年龄和iTRAQ蛋白质执行概要分析。作为皮尔森系数对照组和实验组样本之间大于0.86,数据是重要的和可重复的。

主成分分析的蛋白质定量结果,对照组和实验组显然聚合成不同的集群,表明蛋白表达在实验组与对照组明显不同(图1(一))。

我们检测到1552个蛋白。与对照组相比,实验组显示229个差异蛋白质表达 。其中,129个蛋白质调节和100对实验组的表达下调。其中,最重要的是调节蛋白质YBX3, RAB3GAP2, APOC3, GCA, CSRP2,最重要的是表达下调的蛋白质POLA1,大声叫嚷,ETFB RNMT, MAGED4(数字1 (b)和1 (c))。

更好地研究的生化过程的发生和发展,我们进行基因本体论差异蛋白质的分析,主要从三个方面:细胞组件,分子功能和生物过程。分析了调节蛋白质。这些有针对性的蛋白质在细胞组件的功能主要涉及焦关节粘连和细胞基质。分子功能方面主要是细胞粘附分子绑定和肌动蛋白绑定。生物过程,浓缩等过程的肌动蛋白聚合解聚作用,细胞粘附,观察neutrophil-mediated免疫力。表达下调微分蛋白质(图1 (e)),细胞大多是细胞质和细胞外基质成分。分子功能主要涉及抗原绑定和丝氨酸肽链内切酶的活动,和生物过程的蛋白质激活级联,补体的激活和急性炎症。

通过KEGG分析(数据1 (f)和1 (g)),调节微分蛋白质参与信号通路如肌动蛋白细胞骨架调节,血小板活化,致病性大肠杆菌感染,紧密连接,transendothelial白细胞的迁移。表达下调的蛋白质主要是参与补充凝血级联,金黄色葡萄球菌感染,朊病毒疾病。我们还执行基因集富集分析( )差异蛋白质的定量数据(数据2(一个)和2 (b))。结果显示紧密连接中丰富和调节信号通路,与KEGG结果一致。的主要浓缩蛋白质也类似于KEGG结果,包括YBX3 TJP2, RhoA, RAC1, MYL12A, MYH9 F11R, CTTN。这些蛋白质都是在去调节。

皮尔森相关分析显示高相关的蛋白质的表达参与GSEA紧密连接通路(图2 (c))。高的相关性,比如RhoA RAC1, F11R, TJP2,表明这些蛋白质可能在功能上相似。此外,微分紧密连接相关蛋白的蛋白质相互作用分析表明RhoA中心的交互(图2 (d))。接下来,我们利用免疫印迹检测两组血清样本中RhoA(图2 (e))和计算灰度值(图2 (g))。应用ELISA检测发生和TRAb(图2 (f))。结果表明,RhoA、发生和TRAb水平显著高于去组比自由吧。

3.3。RhoA的变化、发生、FT4、TSH水平

释放组,24例(66.7%)甲状腺功能减退,回归正常甲状腺功能水平发生在12 (33.3%)。去组,20例(83.3%)甲状腺功能减退,和4经验回归正常甲状腺功能水平(16.7%)。总的来说,甲状腺激素水平的变化记录两组患者连续7个月(数字3 (b)- - - - - -3 (d)),血清RhoA水平评估ELISA(图3(一个))。我们进行重复测量数据的方差分析发生、FT4、TSH, RhoA在不同的时间点。Mauchly球形的测试在每组上执行的因素,然而,数据不满足假设范围( ,补充表2)。因此,调整值使用Greenhouse-Geisser校正法(补充表2和3)。重复测量的发生之间的相关性、FT4 TSH, RhoA数据检测。消除激素之间的相互作用和时间后,发生,FT4,和RhoA水平自由吧,组在统计学上意义重大,TSH虽然没有明显差异。然而,每月发生、FT4 RhoA去组水平高于自由组。

3.4。基础水平的变化、端点值,Thyroid-Related激素和RhoA水平的差异

两组,我们计算不同的激素和RhoA水平基线和随访端点之间波动(表进行评估1)。数值数据符合正态分布表示为 ,和参数 - - - - - -测试使用。数据不符合正态分布作为中位数(四分位范围),和Mann-Whitney测试使用。基底的水平之间的差异和端点值是显著RhoA和发生而FT4或TSH水平。

3.5。甲状腺抗体效价的变化在第一个GD的诊断

因为TRAb水平略有变化在短期治疗和TPOAb和TgAb不受抗甲状腺药物,我们比较两组患者的抗体滴度第一诊断使用Mann-Whitney GD测试。TRAb效价的差异( )是统计学意义(图4(一)),而对于TPOAb和TgAb浓度( )没有(图4 (b)和4 (c))。

3.6。相关分析的甲状腺激素及相关抗体

甲状腺激素水平,抗体滴度,和RhoA水平进行了分析使用斯皮尔曼等级相关分析,揭示基底RhoA水平积极相关的发病率。此外,基底RhoA水平越高,病人更容易发展。此外,RhoA端点值之间的差异和基础水平负相关的发病率。的绝对值大于当时RhoA端点值和较小的区别基础水平,这样的患者可能发展。此外,基底发生水平将积极与发病率,基底发生水平越大,越倾向病人发展中去。发生端点值和基底之间的差异水平负相关,与一个较小的区别发生端点值和基础水平表明更大的绝对值和可能去发展。TRAb浓度起初诊断GD也积极相关的发病率,和大的TRAb值患者倾向于发展。相反,FT4, TSH、TPOAb TgAb水平没有与发病(表2)。

3.7。RhoA的诊断意义,发生、FT4、TSH、相关抗体出现

我们使用特异性水平轴和敏感性作为纵轴产生ROC曲线评价甲状腺激素的诊断意义,RhoA和相关抗体。结果表明,基底发生水平,基底RhoA水平,和基底之间的区别发生水平和发生端点值和基底之间的区别RhoA RhoA端点值和诊断值(绝对值)显示的差异(图5(一个))。当病人被诊断出患有GD, TRAb浓度也有诊断价值优于发生。然而,FT4 TSH、TPOAb TgAb水平表现出没有诊断价值(图5 (b)和表2)。

4所示。讨论

走是一种自身免疫性疾病和一个共同的轨道的疾病,影响视力眼动和外观。严重损害生活质量。去的发生率大约是16个女性和3男性每100000人(11]。大多数GD患者忽略了由于温和的眼部症状,和治疗往往集中在GD,延误诊断和治疗。因此,我们旨在识别生物标志物早期诊断通过iTRAQ分析。我们研究了GD患者最近诊断为去确定诱发影响因素的发生。我们使用iTRAQ WB和识别表达RhoA显著增加,验证在60个病人,发现表达RhoA GD和去组显著高于GD组在最初的阶段(基底 , )。

Ras同族体家庭成员(RhoA)是一种低分子量G蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶Rho-associated激酶(岩石)的一个主要下游效应器RhoA [15]。研究表明RhoA扮演重要的角色在细胞粘附、迁移、转化,与我们KEGG分析的结果是一致的。例如,魏et al。16)的体外模型研究去发现RhoA参与这些过程。RhoA /岩石信号通路还参与myofibroblasts诱导分化的TGF -β。的发病机理,轨道的中心目标是成纤维细胞免疫反应和参与炎症和重塑的过程中轨道结缔组织和眼外肌肉。去共享抗原的自体免疫反应是由甲状腺和轨道之间,主要涉及灯泡背后的结缔组织和眼外肌肉。基于轨道组织的免疫组织化学实验的患者(17,18),Weetman et al。19]报道的渗透大量的淋巴细胞,中性粒细胞,血清细胞,和粘多糖沉积,主要在脂肪细胞和肌间的空间,淋巴细胞T细胞。它也被发现,Th1 / Th2平衡参与的发展,后期转向Th1主导地位的(20.]。RhoA是广泛表达细胞质蛋白质属于小GTPase家庭和发挥监管作用在先天和适应性免疫。例如,许多科学家已经证明,Th0细胞分化成四个主要的子组(Th1、Th2, Th17 Treg)时执行函数初始T淋巴细胞进入外围的双重信号被激活抗原递呈细胞(21- - - - - -23]。亚群发挥最重要的作用在调节T细胞反应,防止过度免疫反应,这是有害的主机(21]。RhoA是核心蛋白T细胞迁移(23),研究T特异性敲除小鼠RhoA表明RhoA对T细胞增殖至关重要,活化和迁移。因此,我们推测,RhoA影响的平衡Th1 / Th2细胞打断Th0细胞分化,促进发病机理。

眼球突出的逐步发展,严重可能会导致不完整的眼睑闭合,干角膜上皮的表皮脱落,暴露角膜炎、角膜溃疡,甚至角膜穿孔。肥厚性眼外肌肉压迫视神经,从而导致视神经病变,甚至失明。岩石抑制剂已被证明促进角膜细胞增殖和修复(24,25]。时候喜欢et al。26发现细胞凋亡可以激活ρ/摇滚内磷酸化信号通路在角膜内皮细胞,细胞粘附的损失可以诱导细胞凋亡。岩石抑制剂可以抵消细胞粘附的损失通过激活粘着斑复杂。抑制ρ/摇滚的途径也可以促进轴突再生和功能修复中枢神经系统。Yu et al。27)建立了兔视神经损伤模型和ρ/摇滚抑制剂fasudil管理。视网膜神经节细胞的状态是在模型组比生理盐水组和地塞米松组,表明ρ/摇滚的抑制信号通路在一定程度上能促进视神经修复。此外,我们观察到在60 GD患者增加TRAb与GD患者相比。GD的特点是抗体的存在TSHR [28- - - - - -30.]。TSH-receptor抗体(TRAbs)分为促甲状腺(TSAbs) thyroid-blocking (TBAbs)和中性中性(Abs)抗体。研究已经证明了GD密切临床和时间关系,这表明一个共同致病抗原在甲状腺和轨道4,5,31日]。TRAb是一个自身抗体导致GD [32],TRAb水平可能有一定的临床价值之间的关系在决定GD和去33]。在我们的研究中,平均TRAb效价GD的释放集团起初诊断为4.58 (IU / L),而去组患者的效价是13.07 (IU / L),表明诊断意义(数字2 (c)和3 (b))。我们的研究结果是一致的与发表的一些研究报告(34,35]。它也表明TSAb水平和TBII可能相关的发病率和严重程度,对前者有更多意义(34,36]。目前,相信表面缺乏CD28 CD4 +和CD8 + T细胞亚群在外周血的原因,患者容易免疫介导性疾病(37,38]。的CD28 GD患者的血清是高于正常人,和内源性干扰素-水平γ和细胞因子il - 6在GD患者高于自由病人,与正相关TRAb [37- - - - - -41]。

TSH对甲状腺功能是最敏感的指标。T3和T4水平通常受到结合蛋白和白蛋白的影响,发生、FT4能反映甲状腺功能。在随访后,我们发现基底发生水平和基底之间的差异水平和端点值有诊断价值,基于Mann-Whitney测试结果( , ; , )。尽管如此,没有统计上显著的差异FT4的端点和TSH和基底的水平。因此,一个真正的代表应评估甲状腺功能的使用血清FT4水平代替血清发生水平。然而,在我们的研究中,发生水平去病人的血清显示阳性结果显著不同于自由患者的血清,这可能是因为发生在早期阶段比FT4更敏感。我们收集病人血清在GD的早期阶段,并且比FT4发生可能更容易应对。因此,GD患者显著升高发生在早期阶段更容易开发,因此,这样的增加发生很容易被检测到。

根据我们的研究,我们推测RhoA去是一个潜在的生物标志物可能发挥重要作用在T细胞的分化和迁移和促进的发病机制。我们还发现,GD患者显著增加TRAb和发生在早期阶段更容易发展。TRAb是一个自身抗体,脂肪组织中高度表达的患者和积极的分泌内源性正相关γ和细胞因子il - 6 (42]。因此,我们推测,RhoA TRAb促进发展的免疫水平,但它们之间是否有直接的关系需要更详细的证据

5。限制

患者相对较少满足入选标准,一些患者被排除在外,因为追踪损失,依从性差,和其他口服药物的使用。这些因素可能会影响实验的结果。因此,研究样本量不足的限制,我们将致力于扩大通过继续收集相关的医疗记录。同时,基于当前达成的结论我们样本大小是一致的与他人,表明这个实验的结果是可信的,尽管限制。

6。结论

RhoA是一个潜在的生物标志物的轻微的阶段。如果在GD患者的血清海拔RhoA伴随着海拔TRAb或发生,极有可能发生,即使没有明显的眼部症状。我们的研究提供了一种新的早期诊断的生物标志物,我们希望它能让患者去诊断和治疗在未来更及时的方式。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Sidi赵、施Shuangshuang Wanchen杨的贡献同样这项工作和分享第一作者。

确认

这项研究得到了天津市教育委员会科技项目(没有。2020 kj176)、科技项目天津滨海新区卫生保健委员会(没有。2019 bwkz009),成都医疗科研项目成都市政卫生委员会。

补充材料

补充表1:人口和眼科研究参与者的数据,即。,自由组。补充表2:Mauchly球形检验的甲状腺激素水平在两组。补充表3:重复测量数据的方差分析两组。(补充材料)