文摘
结直肠癌(CRC)是一种最积极的癌症预后差,死亡率高。CRC的发病机制的研究是一个首要任务提供有效的诊断和预后CRC的策略。COPS3 COP9信号身体的蛋白质亚基(CSN),与发展密切相关的多种类型的肿瘤。然而,很少有研究在结肠COPS3腺癌的作用(COAD)。这项研究调查了COPS3对扩散的影响,能动性,EMT的结直肠癌细胞及相关机制。COPS3 COAD中高度表达。COPS3镇压的损耗可行性和刺激COAD细胞的凋亡。损耗的COPS3镇压的能动性和EMT过程COAD细胞。机械,我们发现COPS3可以调解MEK / ERK通路,因此影响COAD细胞的过程。我们认为COPS3可以作为一种很有前途的COAD目标。
1。介绍
结直肠癌(CRC),作为一个最激进的癌症预后差,导致大量的死亡世界,影响数以百万计的人每年1,2]。CRC主要影响远端直肠、乙状结肠、降结肠[3]。越来越多的CRC风险因素最近报道,如老化、不健康的饮食、吸烟、肥胖、缺乏运动、炎症性肠病,遗传因素(4]。CRC治疗包括手术、化疗和放射治疗(5,6]。然而,由于CRC的详细机制发展不完全理解,CRC的5年生存率很低,尤其是在后期(7]。因此,更好地了解CRC的发病机制是一个首要任务提供有效的诊断和预后的策略CRC患者。
COPS3 COP9信号身体的蛋白质亚基(8),位于染色体区域17 p11.2 deubiquitination作用和多种蛋白激酶活动流程(9]。COPS3是与肿瘤发展密切相关10,11]。击倒COPS3显著降低肺转移的骨肉瘤细胞在小鼠模型,表达下调MEK和ERK信号,并抑制EMT 90 kDa核糖体S6激酶(RSK),减少转移的骨肉瘤细胞(12]。此外,COPS3损耗抑制肿瘤生长在裸小鼠通过阻断细胞周期进展(13]。然而,很少有研究在结直肠癌COPS3的角色,尤其是结肠腺癌(COAD)。
细胞MEK / ERK信号通路各人类肿瘤中起着重要的作用,参与细胞增殖、生存、新陈代谢和细胞迁移14]。例如,sophorine抑制肿瘤发生结直肠癌的表达下调MEK / ERK / VEGF通路(15]。上皮间充质转化(EMT)是一种生物过程中,肿瘤细胞失去上皮特性和获得间充质标记,使肿瘤细胞更多的移动和入侵16]。EMT钙粘蛋白表达减少和增加N-cadherin或波形蛋白的表达17]。EMT的过程是由转录因子和某些途径。
本研究调查的影响COPS3扩散,迁移,入侵,EMT的结直肠癌细胞及相关机制。我们的数据显示,COPS3人类COAD细胞中高度表达,影响生存能力,能动性,EMT COAD细胞通过MEK / ERK通路。我们认为COPS3可以作为一种很有前途的COAD目标。
2。材料和方法
2.1。抗体,引物,质粒
使用的抗体anti-COPS3(1: 500稀释,ab231344 Abcam), anti-E-cadherin(1: 1000稀释,ab76055 Abcam), anti-N-cadherin(1: 1000稀释,ab76011 Abcam), anti-Vimentin(1: 500稀释,ab8978 Abcam), anti-MEK(1: 1000稀释,178876,Abcam), anti-p-MEK(1: 1000稀释,ab278564 Abcam), anti-ERK(1: 1000稀释,ab184699 Abcam), anti-p-ERK(1: 500稀释,ab201015 Abcam),和反β肌动蛋白(1:2000稀释,60008 - 1 - ig Proteintech)。
定量PCR引物序列COPS3向前,5 - - - - - -GCGAGGAAUUGGCAUCCUUTT-3和反向,5 - - - - - -AAGGAUGCCAAUUCCUCGCTT-3 。定量PCR引物序列GAPDH是5 - - - - - -TCCGCCGTGTGTACGTCATT-3和5 - - - - - -TCCGCCGTGTGTACGTCATT-3 。
siRNA COPS3和控制核从Riobio购买(中国)。
2.2。细胞培养
正常细胞系NCM460和4 COAD细胞系,包括SW480 HCT116、lovos, DLD-1,都从写明ATCC购买。这两种细胞在DMEM维护,补充10%的胎牛血清,37°C 5%孵化有限公司2孵化器。
2.3。免疫印迹分析
样本细胞溶解的裂解缓冲(中国•瑞帕,Beyotime),然后由10% sds - page实验;顺序,总蛋白质转移到PVDF膜(美国微孔)。然后,PVDF膜被使用5%奶粉TBST缓冲区和抗体。与TBST洗3次后,膜与二级抗体治疗45分钟。每个污点然后使用ECL可视化工具包(通用电气、SA)。
2.4。细胞生存能力分析
CCK-8, COAD细胞被镀成96 -孔板(1000细胞/)和维护完全增长媒体24小时37°C。细胞暴露在CCK-8试剂在37°C 1.5 h。相对细胞生存能力评估与微型板块分光光度计在450 nm (Bio-Rad,美国)。
细胞集落形成试验,COAD被镀成24-well板块(1000细胞/)完成增长和维护媒体14 d在37°C。随后,这些细胞被孵化0.2%结晶紫和清洗,然后,细胞由荧光显微镜拍摄(德国蔡司)。
2.5。细胞凋亡检测
细胞转染48 h后用PBS。随后,这些细胞被固定预冷70%乙醇在-20°C 1 h。随后,这些细胞被沾propidium碘(π)和FITC-labelled膜联蛋白V在4°C 10分钟,和细胞凋亡水平被BD流式细胞仪测量口径。
2.6。体内肿瘤生长试验
实验过程都是按照标准中规定的实验动物管理局(http://www.most.gov.cn)。雌性BALB / c裸小鼠(8-week-old;重量,~ 20 g)从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司没有老鼠死在研究过程中。总共10无胸腺的裸小鼠随机分为控制( )和转染( )组。HCT116稳定转染的细胞shRNA质粒被注入女性裸体小鼠的右翼。2周后,肿瘤的体积估计每个星期,和连续7周的肿瘤生长曲线进行了计算。最后根据方程计算肿瘤体积: 。
2.7。统计数据
数据表示为 。统计学意义的差异是由学生的评估测试和 被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。COPS3 COAD中高度表达
我们第一次发现COPS3的表达水平COAD TCGA组织通过分析数据库。我们注意到的记录每百万COPS3原发肿瘤组织( )高于正常( ),表明高表达在COAD(图1(一))。COPS3 mRNA水平增加,表明COPS3高表达可能是转录。然后我们发现COPS3的表达在正常细胞系NCM460和4 COAD细胞系,包括SW480 HCT116、lovos, DLD-1,通过qPCR和免疫印迹分析。我们发现COPS3 COAD中高度表达的细胞株在信使rna和蛋白质水平(数字1 (b)和1 (d))。因此,我们认为COPS3 COAD中高度表达。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。COPS3损耗抑制的可行性COAD细胞和刺激细胞凋亡
然后,COPS3可行性和细胞凋亡的影响COAD转染的细胞被评估包括SW480和HCT116 COAD核的细胞。qPCR和免疫印迹证实的转染核COPS3的表达减少,控制和NC-siRNA组相比,在这些细胞信使rna和蛋白质水平(数字2(一个)和2 (b))。通过CCK-8化验,我们发现COPS3消融减少OD值在450 nm波长,表明细胞活力的抑制(图2 (c))。进一步通过集落形成,我们发现的击倒COPS3 HCT116和SW480细胞数量也减少了殖民地(数字2 (d)和2 (e))。此外,FCM分析表明COPS3导致的损耗SW480和HCT116细胞的凋亡,凋亡细胞的比例增加(数据2 (f)和2 (g))。我们进一步发现的表达裂解caspase-3和bcl - 2控制COPS3核细胞,进一步证实了之前的结论(图2 (h))。因此,COPS3损耗抑制的可行性COAD细胞和刺激细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。的击倒COPS3抑制COAD细胞的能动性
然后我们发现的影响COPS3 COAD细胞的能动性。我们发现它的消融24小时时间点处伤口宽度增加,SW480和HCT116细胞(数字3(一个)和3 (b))。因此我们认为损耗COPS3抑制COAD细胞迁移。进一步,我们发现其可拆卸的抑制SW480和HCT116细胞的入侵,入侵细胞的数量减少(数字3 (c)和3 (d))。因此,COAD3击倒抑制COAD细胞的能动性。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。击倒COAD COPS3镇压了EMT的细胞
因为以前我们显示COPS3 COAD3细胞生存能力和迁移的影响,然后研究在COAD细胞EMT过程中的作用。我们发现几个EMT标记的表达。通过免疫印迹分析,我们发现COPS3击倒增加钙粘蛋白的蛋白质含量的差别,对这些N-cadherin和波形蛋白,SW480和HCT116细胞(图4)。因此,消耗COAD COPS3镇压EMT过程的细胞。
3.5。COPS3 MEK / ERK通路COAD细胞介导的
然后,我们调查的可能机制COPS3影响COAD进展。先前的研究表明COPS3 MEK / ERK通路的影响,这可能调解扩散,能动性,EMT在几种类型的肿瘤细胞(12]。然后我们发现在COAD细胞COPS3能否调解这一途径。通过免疫印迹分析,击倒COPS3 MEK和ERK的磷酸化水平降低SW480和HCT116细胞(图5)。因此,我们认为COPS3可以调解MEK / ERK在COAD细胞。
3.6。COPS3损耗抑制肿瘤的生长在活的有机体内
进一步确认是否COPS3缺乏能够抑制肿瘤的生长,体内化验了。通过注入COPS3缺乏HCT116细胞裸鼠,我们测量和计算肿瘤的生长曲线。与我们的假设一致,肿瘤的体积COPS3-depleted组明显低于阴性对照组(图6(一))。隐蔽地识别COPS3 siRNA的沉默效率,我们发现COPS3在肿瘤组织的表达通过包含IHC小鼠和免疫印迹分析,数据显示,与阴性组相比,蛋白质含量的COPS3被有效地抑制COPS3 siRNA COPS3损耗组(数字6 (b)和6 (c))。我们进一步发现钙粘蛋白的表达、Erk p-Erk, Mek p-Mek通过免疫印迹,数据进一步证实了我们之前的结论(图6(d))。因此,COPS3消耗体内抑制肿瘤的生长。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
CRC是一种常见的消化道恶性肿瘤发生在结肠(18]。CRC早期症状更不明显,常常已在进展期看医生,现在常用的补救措施(2]。提高手术切除率,降低复发率,提高存活率,中级和高级CRC的治疗是手术的基础上,辅以化疗、免疫治疗、中医和其他支持疗法(18]。最近,靶向治疗取得了一系列积极进展和巨大潜力改善晚期结直肠癌患者的存活率19]。然而,有新的CRC治疗和治疗靶点。在这里,我们注意到COPS3 COAD中高度表达。它影响了可行性、运动性和EMT COAD细胞。我们认为它可以充当COAD的目标。
通过一系列在体外实验中,我们得出的结论是,COPS3人类COAD细胞中高度表达。我们进一步证实了其对生存能力的影响,能动性,EMT COAD细胞的过程。COPS3是一个重要的致癌基因参与转移的骨肉瘤(9]。COPS3损耗可以抑制肺癌和肝癌细胞的生长和诱导细胞凋亡13,20.]。之前的研究也显示,在连接Raf-1 COPS3起到了至关重要的作用/ MEK / ERK通路和自噬调控在骨肉瘤12]。损耗COPS3可以抑制前列腺癌的进展通过降低磷酸化p38 MAPK和损害EMT (21]。此外,COPS3的过度表达可能导致透明细胞肾细胞癌的进展(ccRCC)通过调节phospho-AKT,细胞周期蛋白D1, Caspase-3 [22]。的消融COPS3抑制肺癌细胞的扩散通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的刺激(13]。这些研究与我们的研究结果证实,COPS3可以作为癌症的前景目标。
COPS3被广泛的多种生物功能显示(10]。COP9S3扮演了一个角色在调节小鼠卵母细胞减数分裂通过调节强积金活动和保护退化(23]。COPS3是早期胚胎生存所需的稳定的蛋白质沉积在小鼠卵母细胞(24]。COPS3也将促进细胞外基质和细胞核之间的通信(25]。因此,我们猜测COPS3可能诱发deubiquitination下游蛋白质或蛋白质激酶活性,因此调解COAD的进展。然而,精确的机制需要进一步研究。
MEK / ERK信号通路可以促进多种类型的癌症的进展,包括COAD [26]。MEK / ERK通路被发现影响增殖,凋亡,能动性的肿瘤和影响EMT过程(12]。多个蛋白质或药物影响COAD进展通过这个途径。例如,Verticillin可能增加BIM / mcl1比克服abt - 737电阻COAD细胞通过这个途径(27]。这些研究都证实,MEK / ERK通路可以作为一种很有前途的COAD的目标。
总之,我们注意到COAD COPS3高表达的细胞。COPS3促成了可行性、运动性和EMT COAD细胞通过MEK / ERK通路。因此,我们认为COPS3可以作为COAD的目标。
数据可用性
本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。
的利益冲突
作者认为没有利益冲突的披露。
作者的贡献
验钞谢设计研究和监督数据收集、之江魏分析数据和解释数据,和太极准备出版的手稿,手稿的草案。所有作者都阅读和批准了手稿。