文摘

介绍。癌症基因组图谱(TCGA)项目和亚洲癌症研究小组(ACRG)最近分类胃癌分子亚型。然而,这些分类系统需要高成本和复杂的分子技术,防止他们在临床广泛使用。本研究的目的是生成的分子亚型胃癌使用常规诊断实践中现有技术在一系列的摩洛哥胃癌患者。此外,我们评估分子亚型之间的关联,临床病理特点和预后。方法。九十七例胃癌病例分类根据TCGA, ACRG和集成分类使用面板的四个分子标记(EBV, MSI、粘附和p53)。HER2状态和PD-L1表达式也被评估。分析了这些标记使用免疫组织化学(钙p53、HER2和PD-L1),原位杂交(EBV和HER2模棱两可的情况下),和复合PCR (MSI)。结果。我们的结果表明,该亚型呈现不同的临床病理特征和预后。EBV-positive胃癌症被发现只在男性患者。TCGA GS(分类),MSS / EMT (ACRG分类)和钙粘蛋白异常亚型(集成分类)提出了劳伦扩散组织学浓缩和往往是诊断在年轻的时候。MSI亚型与更好的整体存活率在所有分类(TCGA ACRG,集成分类)。最糟糕的预后观察EBV亚型(TCGA和集成分类)和MSS / EMT亚型(ACRG分类)。讨论和结论。我们报告一个可再生的和负担得起的胃癌子类型化的算法可以繁殖TCGA最近承认,ACRG,胃癌和综合分类,使用常规诊断技术。这些可以使用简化的分类不仅分子分类还在预测胃癌患者的预后。

1。介绍

胃癌是第五位最常见的癌症和第三世界范围内癌症相关死亡的主要原因,因此,一个重要的公共卫生问题(1,2]。根据2020年GLOBOCAN更新数据,胃癌发病率和第三名列第七摩洛哥死亡率(3]。虽然在诊断和治疗最新进展,临床结果往往是不可预测的,他们可以在患者之间差异很大。

了解胃癌发病机制的分子基础是一个关键阶段实现个性化治疗这种疾病。几种组织学分类系统用于定义全球胃癌。劳伦分类和世卫组织分类(2010)是最常用的,描述肠道,扩散,在劳伦和混合类型的分类和乳头状,管状,粘液性和粘性不良类型分类(4]。然而,这些分类系统小工具在临床实践所证明的那样,他们没有预后价值和没有治疗意义。

癌症基因组图谱(TCGA)网络和亚洲癌症研究小组(ACRG)提出了小说分类基于胃癌的分子分析。TCGA研究报告四个主要分子亚型:eb病毒(EBV)积极的肿瘤,肿瘤微卫星不稳定性(MSI),基因稳定的(GS)的肿瘤,肿瘤与染色体不稳定(CIN) [5]。2015年,ACRG提供了一种新的胃癌分子分类,也确定了四种分子亚型:MSI亚型,微卫星稳定与上皮间充质转变特性(MSS / EMT), MSS / TP53突变(MSS / TP53 +)和MSS / TP53野生型(MSS / TP53 -)6]。这样的分子分类大大扩展我们的见解异质性和分子胃癌的复杂性。尽管如此,在这些研究中使用高通量分析技术是昂贵的和在日常实践。

一些研究提出了简单胃癌的分类系统,用免疫组织化学(包含IHC)和EBV-encoded RNA原位杂交(EBER-ISH)技术可用在大多数全球病理实验室(7- - - - - -9]。除了TCGA ACRG分类,另一个分类系统,集成,TCGA和ACRG亚型,称为综合分类,提出了(8,10]。尽管这些研究已经成功地定义胃癌分子亚型,与临床病理的相关性特征和患者生存仍不清楚。

在这项研究中,我们旨在重现,TCGA的结果,ACRG和集成分类使用常规诊断实践技术97年一系列的胃癌从摩洛哥东北部。我们也评估分子亚型之间的关系,临床病理的特性,以及患者的生存。

2。材料和方法

2.1。病人

这项研究包括125例诊断为胃腺癌哈桑二世大学医院(摩洛哥非斯)在2014年1月和2018年12月之间。患者临床资料不完整或不足formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织被排除在研究( )。临床病理的数据是秘密地从医疗记录和检索匿名插入一个excel数据库上。

2.2。免疫组织化学和原位杂交

免疫组织化学(包含IHC)上执行FFPE组织部分使用不同的抗体:多克隆兔反c-erbB-2癌蛋白(克隆A0485 Dako;稀释1:600),Ventana anti-E-cadherin(36)鼠标主要单克隆抗体(可以使用),flex单克隆鼠标反p53蛋白(Dako克隆7;可以使用),鼠标anti-PD-L1单克隆抗体(克隆22 c3;可以使用)。通知(早期巴尔病毒RNA)探测器是用来确定EBV状态通过原位杂交(ISH)。通知希伯探测器检测到的伊什iView蓝色Ventana基准超仪器检测设备。

病例为HER2与已知的积极性,钙p53, EBV, PD-L1作为积极的外部控制。包含IHC结果解释如前所述[7,8]。p53蛋白、完全丧失或扩散(≥80%)和核染色解释为p53异常强劲。钙粘蛋白表达解释使用0到3分(0 =完全丧失;1 =细胞质表达;2 =和细胞质膜的表情;3 =膜表达)。得分0和1被认为是钙粘蛋白异常表达。被定义为积极PD-L1表达式 (11]。

CPS PD-L1染色细胞的数量(肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)除以总数量的可行的肿瘤细胞,乘以100。

希伯伊什,案件被认为是EBV +如果核显示正探头染色。HER2免疫反应性和解释根据霍夫曼的HER2基因扩增结果评分系统对胃癌12]。同时,例模棱两可的HER2包含IHC结果(包含IHC评分2 +)评估基因扩增的荧光原位杂交(鱼)。根据制造商的指示,与PathVysion HER2鱼进行了DNA探针工具包(雅培分子)。

2.3。微卫星不稳定性(MSI)分析

本系列是由PCR的MSI地位多路在我们最近的研究(13]。

2.4。生物标志物评估的理由

EBV-encoded小RNA(生)通过原位杂交检测(EBER-ISH)是黄金标准的评估EBV-infected细胞组织样本(14]。本系列中以前的MSI地位决定使用多重PCR组成五quasimonomorphic单核苷酸重复序列标记(NR21, NR24, NR27、BAT25 BAT26) (13]。这种方法允许准确评估肿瘤的MSI地位敏感性和特异性为100% (15]。而低音等人采用了一系列的多个附加标记(ERBB2 CCNE1,喀斯特,MYC,表皮生长因子受体,CDK6, GATA4, GATA6, ZNF217, CD44, JAK2, CD274, PDCD1LG2,…)区分GS和CIN亚型的存在与否广泛体细胞人类畸变(大会)5),在这项研究中,我们尊敬的两个亚型的钙粘蛋白免疫染色的原因如下:(1)TCGA的研究表明,GS肿瘤根据劳伦富含分散组织学分类(73%),表明GS肿瘤的遗传特性与扩散相关表型(5];(2)一些研究报道,异常的钙粘蛋白表达与分散在胃腺癌组织学16,17,有人建议,钙粘蛋白的损失是一个表型表达的遗传改变在弥漫型胃腺癌(背景突变)18];和(3)添加其他标记将对一个重大的挑战在日常实践中实现子类型化的算法。

一些研究报道,p53的免疫组织化学染色法可作为一个健壮的方法推断TP53突变在癌症的存在如果过度的标准是严格的应用19,20.),如本研究。

2.5。统计分析

使用SPSS统计分析v20.0软件(美国IBM SPSS统计,芝加哥,IL)。临床病理特征之间的相关性和胃癌亚型进行了分析使用卡方检验或Fisher精确检验。总生存期(OS)估计使用kaplan meier方法,和生存的差异在使用生存率较子类型检查。由单变量分析是重要的变量包括在多变量分析中。多元分析使用Cox比例风险回归模型。一个p值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。患者临床病理的特点

在此,我们分析了97个胃癌患者,包括59岁男性(60.8%)和38岁女性(39.2%)。诊断的平均年龄为59.8岁(范围:28 - 85),25例(25.8%)患者吸烟。3例患者(3.1%)出现一个胃溃疡历史,和7例(7.2%)出现胃切除术的历史。关于肿瘤的位置,31例贲门癌(32%),和66年(68%)noncardia癌症。肿瘤或中度分化62(63.9%)例,35(36.1%)例低分化。根据劳伦的分类、肠道肿瘤,65(67.1%)的患者和32例(32.9%)肿瘤扩散或混合。

3.2。TCGA分类

,TCGA研究胃癌分为四个分子亚型:EBV, MSI, GS, CIN (5]。复制这个分类中,我们使用一种算法分析的基础上的三个标记:EBV, MSI和钙粘蛋白(图1(一))。首先,我们确定了EBV亚型基于EBER-ISH积极性。然后,所有MSI-H肿瘤分为MSI亚型。剩下的两个亚型区分了钙粘蛋白免疫染色。肿瘤与钙粘蛋白异常表达分为GS亚型,剩下的病例分为CIN亚型,如前所述[8,10]。97例胃癌病例,巴尔病毒亚型(图6 (6.2%)2 (b)MSI亚型),13例(13.4%),28 (28.9%)GS亚型,50 (51.5%)CIN亚型。

胃癌患者的主要临床病理的特点根据TCGA亚型在表中做了总结1。EBV胃癌症观察只在男性,33%有胃溃疡。

在MSI亚型,69%的患者原发肿瘤位于地区以外的贲门(远端胃)。MSI肿瘤显示更高PD-L1表达式与EBV相比,GS, CIN肿瘤。GS肿瘤诊断更频繁地在年轻患者(平均年龄56年)和主要表现出扩散组织学(57%)。肿瘤与异常p53表达(图2 (f))更频繁(62%)相比,CIN亚型与其他亚型(EBV MSI的33%,38%,和39% GS亚型)。这个CIN亚型特点是肠道肿瘤的比例增加(80%)。我们的数据显示,9/97(9.3%)的患者HER2 +,其中大部分来自CIN亚型(5/9,55.6%)。在肠道肿瘤( ),40/65(61.5%)在CIN亚型分类,其次是MSI亚型(11/65;16.9%)、GS亚型(11/65;16.9%)和巴尔病毒亚型(3/65;9.2%)。diffuse-mixed肿瘤( ),17/32(53.1%)在GS亚型分类,其次是CIN亚型(10/32;31.2%),巴尔病毒亚型(3/32;9.4%),MSI亚型(2/32;6.2%)。

3.3。ACRG的分类

胃癌ACRG的分类分为四个临床相关的分子亚型:MSI, MSS / EMT,海量存储系统(MSS)中/ p53 -和MSS / p53 + (6]。分析了MSI、粘附和p53在97年胃癌症,和ACRG分类是使用一个简化的近似子类型化算法(图1 (b))。我们首先确定了MSI肿瘤。肿瘤的海量存储系统(MSS)中,钙粘蛋白immunoexpression被用来识别海量存储系统(MSS)中/ EMT肿瘤上皮异常表达的特征。随后,p53免疫染色用于分类其余病例在海量存储系统(MSS)中/ p53 - (p53表达异常)和MSS / p53 + (p53表达正常)。结果表明,MSI胃癌构成了13.4%的情况下( );海量存储系统(MSS)中/ EMT胃肿瘤病例的29.9%(代表 );海量存储系统(MSS)中/ p53 -肿瘤统计病例的34% ( )和MSS / p53 + 22.7%的情况下( )。

临床病理的特点总结了ACRG亚型相关表2。MSS / EMT肿瘤在年轻患者更常见(平均年龄55岁)和展出大部分由劳伦扩散组织学分类(58.6%)。

胃切除术历史报告只有在海量存储系统(MSS)中/ EMT(13.8%)和海量存储系统(MSS)中p53 +(13.6%)亚型。在我们的群体中,6/97(6.2%)例EBV +。EBV感染的存在限制了MSS病例(3.4% / EMT在海量存储系统(MSS)中,在海量存储系统(MSS)中/ p53 - 6.1%,和13.6%在海量存储系统(MSS)中p53 / +)。HER2阳性的MSI的1/13(7.7%),2/29(6.9%)的海量存储系统(MSS)中/ EMT, 3/33(9.1%)的海量存储系统(MSS)中/ p53, 3/22(13.6%)的海量存储系统(MSS)中/ p53 +肿瘤。PD-L1积极性被更频繁地在MSI亚型(50%)。在肠道肿瘤( ),27/65(41.5%)的海量存储系统(MSS)中/ p53 -, 15/65(23.1%)海量存储系统(MSS)中/ p53 +, 12/65(18.5%)海量存储系统(MSS)中/ EMT, MSI和11/65 (16.9%)。diffuse-mixed肿瘤( ),17/32(53.1%)海量存储系统(MSS)中/ EMT, 7/32(21.9%)海量存储系统(MSS)中/ p53 +,海量存储系统(MSS)中/ p53 - 6/32 (18.7), MSI和2/32 (6.3%)。

3.4。综合分类

病例分为5个亚型根据EBV的结果,MSI,钙和p53分析使用逐步分类算法所显示先前的研究(图1 (c))[7,8,10,21]。97胃癌症,EBV积极性在6例(6.2%),MSI在13例(13.4%),钙粘蛋白异常表达在28例(28.9%),p53异常表达在31例(31.9%),正常和p53表达19例(19.6%)。

病人的临床病理的特点根据综合亚型分类总结表3。在巴尔病毒亚型,33%的患者先前胃溃疡史,66%低分化肿瘤,100%是男性。MSI患者增加PD-L1表达(50%)和劳伦肠道肿瘤的优势(84.6%)。

钙粘蛋白亚型患者确诊在年轻的时候和有优势的扩散/混合肿瘤(60.7%)。缺乏PD-L1这个亚型表达特征。p53异常的患者好/中度分化肿瘤(83.9%)和吸烟史(32.3%)。正常胃癌症与p53表达更频繁的在老年患者(平均年龄65岁)和劳伦肠道肿瘤(73.7%)。HER2 +三个9(33.3%)例发现亚型。在肠道肿瘤( ),26/65(40%)显示p53表达异常,14/65(21.5%)表现出正常p53表达,11/65 (16.9%)MSI, 11/65(16.9%)显示钙粘蛋白异常表达,EBV和3/65 (4.6%)。diffuse-mixed肿瘤( ),钙粘蛋白异常表达在17/32(53.1%),其次是p53表达异常在5/32(15.6%)、正常p53表达在5/32 (15.6%)、EBV感染在3/32(9.4%),和MSI表型在2/32 (6.2%)。

3.5。生存分析

从初始诊断病人随访日期直到死亡,追踪损失,或学习截止日期(2020年9月30日)。从97年最初的胃癌患者,随访数据来自79名(81.4%)患者,而18例(18.6%)患者失访。平均随访时间为17个月(范围:0 - 78个月)。操作系统中位数时间为11个月(95%可信区间;7.4 - -14.7),5年生存率为7.2%。

根据TCGA分类,kaplan meier生存曲线表明,MSI亚型有最好的预后,CIN和GS紧随其后,而EBV +子类型表现出最糟糕的预后(生存率较, )(图3(一个))。我们的研究结果表明,ACRG亚型也与病人相关的操作系统。最糟糕的操作系统被认为在海量存储系统(MSS)中/ EMT肿瘤,其次是海量存储系统(MSS)中/ p53 -, MSS / p53 +, MSI肿瘤(生存率较, )(图3 (b))。此外,操作系统的集成分类子类型进行了分析。

最好的观察预后MSI亚型。相比之下,EBV亚型显示最糟糕的预后。患者p53正常、p53异常和钙粘蛋白异常亚型中间预后(生存率较, )(图3 (c))。

单变量分析表明,扩散/混合类型的劳伦分类、胃切除术的历史,历史的胃溃疡,TCGA分类(EBV与MSI、GS和CIN), ACRG分类(MSS / EMT vs . MSI, MSS / p53、p53和MSS / +),和集成分类(EBV与MSI,上皮异常,p53异常,和p53正常)与不良预后相关( )在我们的人口(表4)。多变量分析表明,胃溃疡的历史( ;95%置信区间,1.13 - -17.45; )和,TCGA亚型( ;95%置信区间,1.52 - -32.58; )胃癌患者生存的独立预后因素(表吗5)。

4所示。讨论和结论

在目前的研究中,我们分类,首次使用商业访问摩洛哥胃癌症成分子亚型生物标志物和技术可在常规诊断实践。我们调查了胃癌分子亚型之间的关联,临床病理的特点,和病人的总生存期。结果表明,扩散/混合类型的劳伦分类、胃切除术的历史,历史的胃溃疡,TCGA分类(EBV与MSI、GS和CIN), ACRG分类(MSS / EMT vs . MSI, MSS / P53、P53和MSS / +),和集成分类(EBV与MSI,上皮异常,P53异常,和P53正常)在我们的人口与不良预后相关。

TCGA EBV亚型被报道在胃癌和综合分类。全球EBV-positive胃癌症的患病率差别很大(从0%到23.6%不等),约10%的平均速度(22,23]。

一项研究在287年摩洛哥胃癌病人报告EBV积极性率为28% (24相比),这是非常高的利率(6%)发现在我们的研究中。作者检测EBV感染使用聚合酶链式反应的技术,这项技术还将在周围检测EBV感染淋巴细胞,不是从肿瘤细胞,导致假阳性结果(22]。我们的研究使用金本位EBER-ISH方法的精确检测EBV感染(14]。以前在一些研究报告,我们注意到男性的优势在EBV亚型(21,25- - - - - -28]。与其他研究EBV积极的联系和更好的预后(29日,30.),我们发现EBV-positive预后最差的肿瘤患者。这种差异可能是由于小样本大小(97名患者)。

MSI亚型在所有三个分类(TCGA ACRG,集成分类)。我们样本MSI的百分之十三(13%),包括频率范围内发表在《文学(8.2 - -37%)31日]。一些研究报道的重要性MSI状态预测实体肿瘤的反应anti-PD1 / PD-L1免疫疗法(32- - - - - -35]。MSI亚型有最好的整体存活率在所有分子分类(TCGA ACRG,集成分类)。类似的结果在其他研究报告(6,10,36]。改进的MSI胃癌患者的生存可以解释这些肿瘤的重要的T细胞浸润。事实上,MSI +肿瘤的特点是框移突变,产生异常的肽,可以提交给细胞毒性T淋巴细胞(37,38]。

,TCGA和ACRG的研究报道一种独特的亚型特点是低细胞粘附和突变的数量最少,分别命名为GS和MSS / EMT (5,6]。正如所料,GS和MSS / EMT亚型共享相似的钙粘蛋白异常亚型分类集成。在我们的群体中,GS, MSS / EMT和钙粘蛋白异常子类型提出了劳伦扩散组织学浓缩和往往是诊断在年轻的时候。

此外,GS、MSS / EMT和钙粘蛋白异常亚型有不良预后。这些结果是一致的与那些在以前的研究报告(5- - - - - -7,36,39]。

在TCGA亚型中,CIN亚型是最大的在我们的群体中,有51.5%的病例。这组为特征的高频异常p53表达和被发现富含劳伦的肠道肿瘤,海量存储系统(MSS)中对应/ p53 - (ACRG分类)和p53异常亚型(集成分类)。这类似于在一些研究结果报告(5,36]。与先前的研究一致,我们的数据表明,CIN肿瘤是HER2过度丰富。因此,这些病人可能有资格获得的一个子集(曲妥珠单抗治疗40]。

我们的研究结果表明,TCGA分类可以更好地预测胃癌患者的预后比ARCG和综合分类。的确,胃溃疡,TCGA分类和历史的整体生存的独立预后因素。

本研究的主要限制是相对较小的样本量;只有97 GC病人从一个单一的机构已经包括在内。此外,一些患者失访。尽管有这些限制,力量在于临床可行性的方法及其在预测胃癌患者的预后价值。

总之,我们提出了一个可再生的和负担得起的胃癌子类型化的算法可以繁殖TCGA最近承认,ACRG,胃癌和综合分类,使用技术在常规诊断。我们的结果表明,这些简化分类不仅可以采用分子分类而且对预测胃癌患者的预后。

数据可用性

处理过的数据可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

当地的伦理审查委员会批准了本研究的医学和药学学院费/哈桑二世大学医院(参考号:18/17)。

同意

书面知情同意了之前所有的患者纳入研究。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

确认

作者感谢所有成员的哈桑二世大学医院的病理解剖学实验室,Fez-Morocco而言,他们对这项工作的贡献。这项研究胃癌论文项目的一部分,由医学和药学学院费(FMPF)和哈桑二世大学医院费,通过Sidi穆罕默德本Abdellah大学呼吁研究项目的范围下2017/2018。Barretos肿瘤医院的内部资金部分支持本研究。这项工作已经由国家基金资助,通过的基础科学和技术(FCT)项目兴趣库/ 50026/2020和UIDP / 50026/2020;和项目北- 01 - 0145 -菲德尔- 000013和北- 01 - 0145 -菲德尔- 000023,由北葡萄牙地区运营项目(北2020),葡萄牙2020年合作协议下,通过欧洲区域发展基金(ERDF)。MVP是企业管理学院对位Ciencia e Tecnologia基金会支持(FCT),在科学的范围内工作。SPC是收件人的FCT博士奖学金(2020.05779.BD)。NJP被接受者UMove(我)伊拉斯谟ICM KA107项目2018米尼奥大学奖学金做,布拉加,葡萄牙。

补充材料

图2(补充材料):免疫组织化学分析:(G) HER2阴性,HER2阳性(H),(我)PD-L1负面,(J) PD-L1积极(放大×400)。(补充材料)