文摘

越来越多的证据表明,gasdermin D (GSDMD)介导pyroptosis信号通路发挥至关重要的作用,非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病机制。Jiangzhi Ligan汤(JZLGD)验证防止非酒精性脂肪肝,但其具体机制尚未确定。在这项研究中,建立了一个非酒精性脂肪肝模型在Sprague-Dawley老鼠高脂肪饮食(HFD)。12周后,JZLGD口头每天服用一次额外6周。我们调查了JZLGD对非酒精性脂肪肝大鼠的影响并确定GSDMD pathway-associated蛋白质探索这种效应是否与pyroptosis有关。我们的数据表明,JZLGD显著降低肝指数;血清脂质水平,改善肝功能参数和脂滴内容;和非酒精性脂肪肝。我们进一步发现,血清促炎因子interleukin-1水平β(il - 1β)、地震、肿瘤坏死因子-α显然,il - 6 JZLGD组下降。HFD老鼠对待GSDMD展出NLRP3 caspase-1,脂多糖(LPS),和caspase-11激活;然而,这些影响是削弱了JZLGD治疗。综上所述,JZLGD可能起到王亚南作用对大鼠非酒精性脂肪肝HFD模型通过调节GSDMD-mediated规范/经典之中pyroptosis通路。

1。介绍

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一个全球性的健康问题,其发病率迅速增加,特别是在美国,其患病率(20 - 30%1]。其在亚洲的流行是7 - 20%2]。在人们的饮食和生活方式的变化,非酒精性脂肪肝的发病率逐渐增加在年轻人群中,公共医疗系统造成负担。在一些患者中,非酒精性脂肪肝会进步肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌的风险增加。然而,潜在的非酒精性脂肪肝病理机制复杂,目前没有有效的药物(3),所以它是非常重要的来确定治疗非酒精性脂肪肝的治疗目标。

非酒精性脂肪肝的发病机制与脂质代谢紊乱,脂质积累,胰岛素抵抗,和炎症(4,5]。特别是,肝脏炎症是一个重要的病理生理过程非酒精性脂肪肝(6]。此外,一项研究表明,炎症激活导致肝胰岛素抵抗和肝病(7]。炎症的发生和发展将会加剧恶化的非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝进展为肝硬化。Pyroptosis是一种炎性细胞死亡与gasdermin D (GSDMD)执行分子(8]。乳沟GSDMD caspase-1和caspase-4/5/11导致质膜易位的氨基端片段,然后形成气孔直径(10 - 15海里),促进释放interleukin-1 pyroptotic细胞死亡β(il - 1β)和地震9,10,11]。一方面,caspase-1的激活需要NLRP3 inflammasome,识别不同的刺激包括其分子模式和内生有关分子模式向活性形式激活pro-caspase-1乳沟caspase-1 [12]。这个pyroptotic过程,这是由NLRP3 / caspase-1 / GSDMD,称为规范化pyroptosis通路。另一方面,经典之中的发生inflammasome-mediated pyroptosis取决于caspase-11/4/5识别和结合脂多糖(LPS),在这种情况下,复合激活GSDMD导致经典之中pyroptosis [13- - - - - -15]。最近的研究表明,pyroptosis介导肝细胞的死亡和加剧炎症和纤维化的过程在非酒精性脂肪肝的病理发展,已成为一个重要的潜在目标治疗非酒精性脂肪肝(16]。

中国传统医学(中医)理论,非酒精性脂肪肝的发病机制包括脾空虚,肝脏停滞,和phlegm-damp阻塞(17]。中医是有效治疗非酒精性脂肪肝,但很少有相关研究。Jiangzhi Ligan汤(JZLGD),中国古典草药配方,是一种广泛使用的处方在临床实践中。JZLGD由六种中药,包括泽泻东方(Zexie),丹参(丹参),黑醋栗托(Juemingzi) Curcumae基数(Yujin)、海藻(Haizao),荷叶(符合)。先前的实验表明,JZLGD调节脂质代谢,产生王亚南效果,有助于减肥。已经证明JZLGD扮演着一个重要的角色在非酒精性脂肪肝的治疗,但潜在的机制尚不清楚。Pyroptosis与炎症反应密切相关,在非酒精性脂肪肝的发展中扮演不可或缺的角色。在非酒精性脂肪肝会抑制pyroptosis保护肝脏免受炎症和延缓肝病的进展;因此,我们假设JZLGD有利影响的非酒精性脂肪肝的发展可能与规范化和经典之中pyroptosis通路有关。因此,建立了一个非酒精性脂肪肝大鼠模型来评估JZLGD对非酒精性脂肪肝的影响,探索潜在的分子机制。

2。材料和方法

2.1。材料

戊巴比妥钠(57-33-0)从TCI购买上海;裂解缓冲免疫印迹和免疫沉淀反应(IP)分析(P0013)从Beyotime购买生物技术。蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(没有EDTA, 100×原液在DMSO) (B14002)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(100×原液)(B15002)从Bimake购买。河鼠il - 1β酶联免疫试剂盒(GN-R30172),河鼠地震-酶联免疫试剂盒(GN-R30168),大鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒(GN-R31092),河鼠il - 6酶联免疫试剂盒(GN-R30201)购买获得生物。LPS检测设备(H178)是购自南京建成生物工程研究所。单克隆鼠标anti-GSDMD (sc - 393581)和anti-caspase-11 (sc - 374615)购买的圣克鲁斯生物技术。兔单克隆anti-GSDMD-N(93709)从细胞信号技术购买。多克隆兔anti-caspase-1 (nbp1 - 45433)和anti-NLRP3 (nbp2 - 12446)从罗福斯购买生物制品。兔单克隆anti-ASC (EPR10402 (B))从Abcam购买。单克隆鼠标反β肌动蛋白(A5316)购买的σ。山羊anti-rabbit (AP132P)和山羊anti-mouse第二抗体(AP124P)从默克公司购买。

标仪、电泳仪、电影传输装置,和凝胶成像系统获得Bio-Rad(美国),LEICADNLB2双目显微镜从徕卡,Shandon325石蜡切片机是来自英国Shandon公司fall-automatic生化分析仪是来自Bio-Rad(美国)。

2.2。动物模型

男性Sprague-Dawley老鼠(5 - 6周, g)从湖南SJA购买实验动物有限公司和适应了7天。老鼠保持在一个受控的环境温度( °C)和相对湿度( )在12/12 h光/暗周期;水是可以随意。本研究回顾和批准的湖南中医药大学动物实验伦理委员会和按照他们的建议进行。

2.3。JZLGD

JZLGD由泽泻东方(Zexie)(10克),黑醋栗托(Juemingzi)(30克),丹参(丹参)(10克),Curcumae基数(Yujin)(10克),海藻(Haizao)(30克)和荷叶(符合)(10克)。所有组件都是购自湖南中医药大学第一医院,在8个卷的水浸泡30分钟,煮1 h,和过滤。六卷的水被添加,样本煮1 h和过滤。我们混合成分和集中混合使用旋转蒸发器在2 g / ml 65°C和存储在4°C。使用前,用生理盐水稀释至所需浓度。

2.4。模型建立

根据一项研究,老鼠接受高脂肪饮食(HFD)(40千卡%脂肪,20千卡%蔗糖,和2%胆固醇),12周患非酒精性脂肪肝。HFD研究提供的饮食,Inc .(批号:D09100301)。

2.5。实验设计

Sprague-Dawley老鼠被随机分为5组:正常对照组、非酒精性脂肪肝模型组,三个JZLGD-treated非酒精性脂肪肝组(收到2.3,4.6,和9.2克/公斤体重,分别)。在正常对照组大鼠喂养正常饮食(ND, 0.275 ppm胆固醇、脂肪5.1%,蛋白质23.5%,和50.3%碳水化合物),而其他组的大鼠在实验期间收到HFD ( )。在JZLGD-treated 12周后,大鼠非酒精性脂肪肝组JZLGD服用不同剂量的口服填喂法一次每日一段6周;其他两组的老鼠被给予相同剂量的生理盐水。食物摄入量每天监测,每周体重测量。干预后,大鼠腹腔注射安乐死的1%戊巴比妥钠(40毫克/公斤体重)。每个老鼠的血液和肝脏迅速删除了进一步的研究。

2.6。肝指数

18周后,体重和肝脏重量测量,下面的公式是用来确定肝脏指数: 。

2.7。组织病理学

组织病理学分析,我们收集了从每个大鼠肝组织部分相同。组织部门与冰冷的生理盐水洗一次或两次,保存在4%多聚甲醛。组织是切成薄片的厚度4μm和沾hematoxylin-eosin ())。三个练习病理学家那些失明的研究设计进行组织病理学检查。气球样变性分数和非酒精性脂肪肝活动得分(NAS)记录。评分标准是按照美国国立卫生研究院的指导方针在非酒精性脂肪肝炎临床研究网络。

2.8。生物化学分析

血液样本在3000转离心10分钟分离血清。我们使用fall-automatic生化分析仪评价血清肝酶的活动(丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)、血清甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、游离脂肪酸(FFA)。

2.9。评估血清il - 1β地震,TNF -α,il - 6水平

血从腹主动脉和离心获得获得血清。血清il - 1的含量β地震,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),il - 6 ELISA测定根据制造商的指示。

2.10。血清水平有限合伙人

从腹部静脉血液得到,在室温下放置30分钟,离心分离血清。血清LPS水平测量工具根据制造商的指示。首先,样本添加到antibody-coated enzyme-labeled井,然后,添加了标记抗原。混合物在室温下是孵化1 h。后来,盘子洗了PBST三次,avidin-HRP补充道,在37°C和盘子被孵化1 h。吸光度测量450海里。标准曲线绘制计算有限合伙人的浓度。

2.11。免疫印迹分析

我们从每组随机选择五个老鼠,和100毫克的同一段肝组织收集。然后,1毫升里帕缓冲区包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒了。均化后冰玻璃均质器30分钟,肝组织匀浆是离心获得蛋白质。蛋白质浓度由BCA分析决定。为每个组,40岁μg蛋白质被下面的实验。蛋白质样品被sds - page分离和转移到PVDF膜。阻塞后5%的脱脂牛奶TBST 1 h,一夜之间,膜被孵化在4°C以下主要抗体:anti-NLRP3 (1: 1000), anti-apoptosis-associated speck-like蛋白质包含一张卡片(ASC) (1: 1500), anti-caspase-1 (1: 500), anti-caspase-11 (1: 500), anti-GSDMD (1: 1000), anti-GSDMD n端(GSDMD-N) (1: 1000), anti-IL-1β(1:1000),anti-IL-18(1: 1000)和反β肌动蛋白(1:5000)。与TBST洗膜后,膜的孵化与二次抗体室温1 h。蛋白质的乐队是可视化与西方明亮的发射极耦合逻辑。最后,数量一个软件被用于蛋白质的定量分析。

2.12。统计分析

分组数据用SPSS 22.0进行分析。比较两组是由双尾学生的 - - - - - -测试。比较三个或更多人群进行单向方差分析。结果表示为 (SD)。GraphPad Prism 6.0软件被用于统计评估。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。JZLGD减少肝脏指数和血清脂质水平

评价治疗效果的JZLGD HFD-fed大鼠非酒精性脂肪肝,我们测量了体重、肝重、肝指数、血清脂质水平,和肝功能参数。体重、肝重、非酒精性脂肪肝组肝指数明显高于对照组。6周后,JZLGD干预(图1)、体重、肝重和肝指数在JZLGD-treated明显改善非酒精性脂肪肝组,这证明JZLGD块非酒精性脂肪肝的发展。与这些观察血清分析结果一致。血清TG、TC、FFA和HFD-fed老鼠的低密度脂蛋白水平显著高于控制老鼠。HFD组相比,血清TG、TC、FFA,低密度脂蛋白水平在JZLGD-treated大大改善非酒精性脂肪肝组。高血清ALT和AST水平与非酒精性脂肪肝相关进展;的确,HFD老鼠的ALT和AST水平高于控制老鼠。治疗JZLGD血清ALT和AST水平降低,表明JZLGD可以防止老鼠HFD-induced肝损伤。

3.2。JZLGD减轻肝组织的病理形态学和炎症

进一步证实JZLGD对非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏组织病理学的影响,我们)进行染色,NAS和不断膨胀的得分记录。如图2正常组,肝小叶完好无损,和肝细胞索排列有序的方式,以中央静脉为中心的径向安排。肝细胞多边形的形状,大而圆核位于集中在肝细胞中。少量淋巴细胞浸润,没有fibroproliferation观察肝血窦和集中的地区。HFD组肝细胞无序排列,伴随着气球样变性,炎症细胞的浸润,明显的肝脂肪变性,肝细胞肿胀和圆的,大的脂滴。不同程度的脂肪变性的观察JZLGD-treated非酒精性脂肪肝组,但是气球样变性是降低的价格相比HFD组。这些特点暗示HFD喂养可以诱导非酒精性脂肪肝和肝脂肪变性。在JZLGD治疗,肝脂肪变性和脂质积累逐渐减少。JZLGD治疗也有效地减少了不断膨胀的分数和非酒精性脂肪肝大鼠的NAS,浓度的方式。这表明JZLGD有积极对肝脏有保护作用。

我们还检测到相关炎症因子评估和HFD喂养的老鼠的肝脏炎症程度。更高的il - 1β地震,TNF -α,观察HFD大鼠的血清il - 6水平相对于正常组。JZLGD-treated NAFLD大鼠il - 1β地震,TNF -α和il - 6水平明显下降,说明JZLGD抑制肝细胞炎症和防止非酒精性脂肪肝的发展。

3.3。JZLGD抑制GSDMD和GSDMD-N的表达

GSDMD关键蛋白质的水平,这是最终的执行者和pyroptosis的关键因素,是衡量免疫印迹分析。此外,其活性形式的水平,GSDMD-N,肝组织也被评估。如图3在肝脏,GSDMD和GSDMD-N水平显著高于非酒精性脂肪肝组与对照组相比,证实了我们的猜想,非酒精性脂肪肝的发生是pyroptosis密切相关。此外,在JZLGD治疗、GSDMD的水平和肝脏中GSDMD-N JZLGD-treated NAFLD组显著降低。这种效应是浓度。因此,JZLGD可以有效防止pyroptosis和保护肝细胞的过程。

3.4。JZLGD抑制NLRP3的水平,ASC Caspase-1, il - 1β,地震

进一步探索的影响JZLGD GSDMD-mediated规范pyroptosis通路,我们测量的水平NLRP3, ASC caspase-1,适配器蛋白质。如图4、蛋白表达水平的NLRP3 caspase-1, ASC在肝组织中明显高于HFD组与正常组。中、高浓度的JZLGD显著降低NLRP3, caspase-1, ASC蛋白质水平。我们还研究了促炎因子il - 1的水平β地震,pyroptosis通路的下游。的il - 1β和地震- HFD老鼠的蛋白质含量高于正常的老鼠,和JZLGD成功抑制il - 1的表达β和地震。这些结果与我们之前的研究是一致的。

3.5。JZLGD抑制Caspase-11和有限合伙人的表达

我们还测量了caspase-11的水平和有限合伙人,这是有关GSDMD-mediated模非酒精性脂肪肝的途径。如图5caspase-11在肝脏组织的蛋白质表达和血清LPS水平都显著高于HFD组与正常组相比。这表明GSDMD-mediated模通路也起着重要的作用在非酒精性脂肪肝的发展。在JZLGD治疗,肝caspase-11水平和血清LPS水平显著降低。

4所示。讨论

非酒精性脂肪肝正迅速发展成肝癌和肝硬化的主要原因,但没有批准治疗药物(18]。相反,JZLGD是multi-ingredient药影响多个途径,及其对非酒精性脂肪肝的治疗效果治疗已经有据可查的(19,20.]。在目前的研究中,机制的影响JZLGD使用HFD-induced NAFLD,探讨非酒精性脂肪肝大鼠模型。

HFD老鼠表现出增加体重、肝重、和肝指数;JZLGD治疗后,这些指标是有效地改善。此外,JZLGD调节血脂水平。ALT和AST活动也往往是低JZLGD-treated老鼠,这表明JZLGD导致非酒精性脂肪肝的预防和减轻HFD-fed老鼠。随后,组织学检查显示,JZLGD明显减轻肝脏脂滴。此外,NAS和不断膨胀的得分减少JZLGD-treated HFD老鼠,这表明JZLGD可以减缓脂质积累。所有这些发现说明JZLGD确实施加有益的治疗对非酒精性脂肪肝的影响。

HFD显著增加肝脏炎症因素如il - 1的表达β地震,TNF -α,il - 6。JZLGD治疗明显降低这些水平与非酒精性脂肪肝模型组相比,这表明JZLGD变弱肝细胞炎症。非酒精性脂肪肝的发病机制为核心,炎症反应中起着重要的作用在非酒精性脂肪肝的发生和发展21,22]。因此,我们推测,JZLGD的保护作用与非酒精性脂肪肝可能是介导的抗炎反应。最近的研究表明,pyroptosis可以被视为一个潜在的治疗目标,作为炎症性和可控细胞死亡的方法23)加速肝脏炎症和纤维化的过程(24,25]。值得注意的是,pyroptosis非酒精性脂肪肝的发展是一个关键的致病的因素(23,26,抑制inflammasome-dependent GSDMD-mediated细胞pyroptosis可以减弱肝脏损伤肝脏疾病(27]。因此,我们关注JZLGD pyroptosis在这项研究的影响。我们第一次发现的主要执行人蛋白质GSDMD,这是一个通用的基板上还存在炎症。其裂解形式GSDMD-N充当pyroptosis执行人,触发pyroptosis和加剧的释放促炎因子il - 1β并通过GSDMD毛孔(地震24]。此外,激活的抑制GSDMD块非酒精性脂肪肝的发展。因此,GSDMD被认为是一个潜在的目标治疗非酒精性脂肪肝(9,28]。在这里,我们的实验数据表明,GSDMD蛋白表达及其活性形式GSDMD-N HFD-induced NAFLD大鼠显著增加,这是与以往的研究一致9),进一步证实GSDMD扮演重要的角色在非酒精性脂肪肝的发生和发展。然而,JZLGD治疗逆转HFD-induced GSDMD增加和GSDMD-N表达表明JZLGD可以调节GSDMD的激活,从而达到治疗非酒精性脂肪肝的目的。

如图6GSDMD蛋白质裂解生成GSDMD-N,根据促炎caspase-1和caspase-4/5/11通过规范化和经典之中inflammasome信号通路(29日]。Caspase-1规范化pyroptosis途径的启动因素,及其激活需要NLRP3 [30.]。此外,caspase-1直接pro-IL-1劈开β和pro-IL-18产生成熟的细胞因子和控制他们的分泌物诱导pyroptosis [31日]。的表达水平NLRP3 caspase-1, il - 1β,地震是关键指标评价的激活NLRP3 inflammasome [32,33]。我们的结果表明,NLRP3、ASC caspase-1, il - 1β,地震在HFD-induced NAFLD大鼠水平升高,这表明NLRP3 inflammasome也在非酒精性脂肪肝。JZLGD治疗减少NLRP3, ASC caspase-1, il - 1β地震的水平,这表明机制JZLGD在HFD-induced NAFLD大鼠的影响可能与NLRP3 / caspase-1 / GSDMD-mediated pyroptosis途径。

除此之外,在经典之中pyroptosis信号通路,GSDMD caspase-11劈裂,caspase-11直接由LPS激活(34,35]。我们的结果表明,该级别的裂解caspase-11 HFD-induced NAFLD大鼠肝组织的显著增加,而在JZLGD治疗组,我们观察到一个意义caspase-11水平降低,这意味着JZLGD可以通过抑制调节激活GSDMD caspase-11的表达。以往的经验显示,紊乱的肠道菌群和肠粘膜的损伤会导致解散肠道革兰氏阴性杆菌,导致有限合伙人的释放到门静脉,加重肝脏炎症和加速非酒精性脂肪肝进展(36,37]。妮可等人表明HFD可能诱发的变化甚至障碍的肠道菌群的结构,和Moreira等人的研究表明,HFD可以导致肠道菌群失衡,导致增加血清LPS水平(38,39]。此外,一些研究表明,JZLGD可以调节肠道菌群和干预与非酒精性脂肪肝的发展(40]。在这里,我们的数据表明,有限合伙人内容非酒精性脂肪肝大鼠肝门静脉的显著增加,和JZLGD治疗能显著降低。基于上述结果,我们推测,JZLGD可以调节非酒精性脂肪肝大鼠的血清LPS水平,防止激活caspase-11 GSDMD,从而减少释放促炎因子和衰减非酒精性脂肪肝的过程。这些发现说明JZLGD治疗预防脂肪变性、炎症和pyroptosis HFD老鼠,这可能与有限合伙人/ caspase-11 GSDMD-mediated pyroptosis途径。

5。结论

总之,我们的研究结果表明,规范化和经典之中pyroptosis通路被激活在HFD-induced非酒精性脂肪肝大鼠。JZLGD抑制NLRP3 / caspase-1 / GSDMD-mediated规范化pyroptosis通路和有限合伙人/ caspase-11 / GSDMD-mediated经典之中pyroptosis通路,在HFD-fed NAFLD大鼠施加有益的影响。在未来的研究中,具体机制JZLGD调节pyroptosis需要阐明。例如,JZLGD降低血清LPS水平通过改变肠道通透性?进一步调查的具体的作用机制GSDMD可能导致有效的药物来治疗非酒精性脂肪肝的发展。

数据可用性

摘要本研究期间生成的数据都包含在本文和结果如图。

信息披露

这手稿曾作为预印本在线发表在研究广场(doi: 10.21203 / rs.3.rs - 250732 / v1)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

完唐构思研究和设计实验。康康,小周、江魏和紫薇戴秉国进行实验。康康,小周,灵灵王,魏江分析数据并起草了手稿。完唐,灵灵王,小周回顾和修订后的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。康康,小周、江魏和灵灵王同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由湖南省教育科学研究基金支持部门(18 b244号和18 b252)和一流的基础医学学科建设项目在13日湖南中医药大学的五年计划(06)。