文摘
背景。骨关节炎(OA)和类风湿性关节炎(RA)是众所周知的关节残疾的原因。虽然他们表现出类似的临床特征包括慢性滑膜炎,发展到软骨和骨的破坏,提升者的发病机理和延续滑膜病变RA和OA之间仍然是难以捉摸的。客观的。本研究的目的是确定特定疾病中心基因,探索免疫细胞浸润,阐明底层机制与RA和OA滑膜病变有关。方法。基因表达谱(GSE55235 GSE55457、GSE55584和GSE12021)从基因表达选择综合进行分析。差异表达基因(度)被Bioconductor“LIMMA”包。度被确定基因本体论(去)和KEGG途径分析。构建蛋白质相互作用网络,识别候选基因通过使用字符串和Cytoscape中心。从GSE12021中心基因被验证。此外,我们采用CIBERSORT网站评估免疫细胞浸润OA和RA之间。最后,我们探讨了中心的水平之间的相关性基因和免疫细胞在OA和RA的相对比例。结果。我们确定了68度,这主要是富含免疫反应和趋化因子信号通路。六个中心基因的截止 通过ROC分析和相对的表达 成功被确定。与OA相比,RA滑膜组织由一个更高比例的7免疫细胞,而4免疫细胞被发现在相对较低的比例( )。此外,6的水平中心基因与11的相对比例密切相关免疫细胞在OA和风湿性关节炎。结论。我们使用生物信息学分析识别中心基因和探索免疫细胞的渗透滑膜组织的免疫微环境。我们的结果应该提供洞察滑膜病变的潜在的分子机制,为免疫治疗提供潜在目标的OA和风湿性关节炎。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)影响大约1%的人口,有女:男性的比例2.5:1,多数发生在40 - 70岁的成年人(1]。RA滑膜炎,滑膜炎症和增生,炎症细胞浸润,软骨和骨的破坏,以及其他系统性的特性,这可能会导致关节畸形,严重残疾,甚至过早死亡(2- - - - - -5]。骨关节炎(OA)是最常见的慢性退行性关节炎。膝盖是最常受影响的联合,有10%的男性和13%的女性年龄在60岁患有症状性膝关节OA和四分之一的OA患者残疾(6,7]。最近的研究显示,滑膜病变做出一个重要的角色在病变的OA和风湿性关节炎8,9]。免疫微环境在OA滑膜和RA是明显不同的。没有或小炎症细胞浸润在OA,在RA,有多种炎性细胞浸润和异常细胞因子的释放10]。这些临床特征构成一个重要的机械问题,迫切需要决定:为什么滑膜炎症延续?之间OA滑膜炎和风湿性关节炎的区别是什么?什么导致这些生物机制在OA和RA ?
随着生物信息学的发展技术,基于高通量微阵列平台已成为一种有效的工具来研究基因表达谱和探索各种疾病的分子机制(11]。滑膜组织是重要的组织在基因分析12]。之间的病理改变和免疫微环境的差异OA和RA滑膜组织可能高度相关的关键基因。滑膜组织的差异表达基因(度)将带来新的见解OA和RA的发病机制和精确的治疗目标。然而,关节炎的病理生理机制在RA和OA尚未彻底调查。有前途的生物标志物的诊断、预后和治疗反应OA和RA的缺乏。因此,本研究的目的是采用生物信息学分析,识别度,筛选出有前途的生物标志物和分析途径和免疫之间的渗透模式OA和RA,这可能阐明发病机制的理解,发生,发展,因此提供新策略的诊断、预防和治疗。
2。材料和方法
2.1。微阵列数据收集和工作流
本研究的工作流程如图1。基因表达谱(见S1在补充材料)(GSE55235, GSE55457、GSE55584 GSE12021)从基因表达综合下载(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[13,14]。总共有81的数据集包括滑膜样本,包括36 OA组织样本和45 RA(表样本1)。平台注释信息下载到匹配的基因探针与基因的名字,和“上海广电”的一揽子Bioconductor应用删除批处理效果。此外,原始数据集被执行背景校正和归一化预处理使用R(版本4.0.2)删除识别和复制的基因。
2.2。识别差异表达基因(度)
R包微阵列数据的线性模型(limma)一直是一个流行的工具,它用于确定度从微阵列和RNA序列数据集15]。这里,R包“limma”应用到地理数据集(GSE55235、GSE55457 GSE55584)筛选基因满足下列标准:Benjamini-Hochberg调整值(adj。 )< 0.05和 。的值调整控制错误发现率(16]。基因满意的标准被指定为度和可视化为热图通过使用“pheatmap”包和火山的一个阴谋,使用R的“ggplot2”包。
2.3。十字路口的基因的功能注释
执行基因本体论注释和京都基因和基因组的百科全书(KEGG)基因浓缩的十字路口,我们利用R包“clusterProfiler”和“org.hs.eg。db”[17- - - - - -19]。去注释浓缩条件确定根据生物过程(BP),细胞组件(CC)和分子功能(MF)识别的生物属性,和KEGG浓缩分析是用来确认关键信号通路与交叉口相关基因。一场小雨。 被设置为阈值显著性水平。
2.4。建设(PPI)网络和蛋白质间交互作用的识别候选基因中心
检索的搜索工具相互作用基因(字符串;https://string-db.org)是一个在线数据库预测之间的直接和间接关系的蛋白质(20.]。十字路口基因选择与最小建立PPI网络交互 和隐藏断开连接的节点(21]。最大小团体中心(MCC)、学位和亲密算法,被认为是最有效的方法来计算中心节点,用于确定候选基因中心使用“cytoHubba”插件Cytoscape(3.7.2章版)(22,23]。这三个算法的交叉基因被认为是候选基因中心,被可视化为一个UpSetR图使用R的“UpSetR”包。
2.5。识别基因由GSE12021验证中心
评估候选基因的准确性,接受者操作特征(ROC)曲线分析应用使用R包“pROC”GSE12021 [24]。中心基因识别与验证的标准 和相对表达水平 wilcoxTest。
2.6。免疫测定渗透和中心的相关基因和免疫细胞在OA和RA滑膜组织
在线分析工具CIBERSORT (https://cibersort.stanford.edu/),一个常用的工具来评估22的相对内容类型的免疫细胞,应用于评估的免疫微环境OA和RA组织(25- - - - - -28]。这些免疫细胞的比例,计算标准的意义值< 0.05,可视化为小提琴情节中使用“vioplot”包R .最后,中心基因表达之间的相关性和差异性办公自动化(OA)和RA滑膜组织中免疫细胞的比例是由使用R包“ggExtra”和“ggpubr”(截止的 )。
2.7。统计分析
原始数据的整理、统计分析和可视化的统计结果是由使用报告语言(Perl版本5.32.1)和R软件(版本4.0.2)。
3所示。结果
3.1。的识别度
68度OA和RA筛选从GSE55235之间GSE55457 GSE55584数据集,包括45调节和23个基因表达下调(见S2在补充材料)。火山情节和热图揭示集群之间的关系度OA和RA样本数据所示2(一个)和图2 (b),分别。
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3.2。十字路口的功能富集分析基因
度的去分析,BP-enriched条款体液免疫反应,lymphocyte-mediated免疫力,和B细胞活化;CC-enriched条款是免疫球蛋白复杂,外部的质膜,和MHC蛋白复合物;和MF-enriched条款抗原结合,免疫球蛋白受体结合,趋化因子活动(图3(一个))。KEGG富集分析表明这些基因在cytokine-cytokine受体相互作用,大大丰富了类风湿性关节炎,趋化因子信号通路(图3 (b))。
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3.3。建设PPI和识别候选基因中心
68度的蛋白质相互作用网络构造如图4(一)。十大基因被确定最大小团体中心(MCC),学位,分别和亲密算法(见S3在补充材料)。七个候选人中心来自这三个常见的基因算法筛选包括地蜡,CXCL3, CXCL9, CXCL10, CXCL13 NPY1R, POU2AF1(图4 (b))。
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3.4。基因识别的中心
GSE12021来验证这些候选基因中心。7通过ROC分析候选基因的结果可视化(图5)。六个基因(CXCL3 CXCL9、CXCL10 CXCL13, NPY1R,和POU2AF1), AUC分数超过0.80和相对表达水平 wilcoxTest,被视为中心基因(图6)。此外,六个中心基因的表达水平所示S4在补充材料。
3.5。分析免疫渗透
使用CIBERSORT网站,我们计算亚种群的相对比例不同的免疫细胞在OA和RA滑膜组织(图7(一))。与OA的样品相比,RA滑膜组织由一个更高比例的7免疫细胞(浆细胞、CD8 + T细胞CD4 +幼稚T细胞,激活记忆CD4 + T细胞,滤泡辅助T细胞,T细胞γδ,和M1巨噬细胞),而4免疫细胞(T细胞监管,M2巨噬细胞、树突细胞休息,休息和肥大细胞)是相对较低的比例(图中发现的7)。此外,6的水平中心基因与11的相对比例密切相关免疫细胞在OA和RA(数字8和9)。CXCL3的表达呈正相关休息在OA树突细胞,而这是负相关,休息树突细胞在类风湿性关节炎(数字8(一个)和9(一个))。
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4所示。讨论
微阵列技术和高通量技术,重要的方法来探索基因的表达水平,使更深入地理解复杂疾病的内在分子机制的29日- - - - - -31日]。越来越多的证据表明,滑膜病变的发病机理和发展起到关键作用的OA和风湿性关节炎32,33];因此,很有必要识别关键基因不同监管和他们的目标路径。在这项研究中,六个中心基因(CXCL3、CXCL9 CXCL10, CXCL13, NPY1R,和POU2AF1),具有优良的特异性和敏感性,成功地确定了生物信息学分析。中心之一,CXCL3基因在我们的研究中,一个属于CXC-type neutrophil-activating趋化因子趋化因子家族,发现子宫宫颈癌(UCC)组织中高度表达。此外,过度CXCL3可能促进肿瘤发生的UCC的潜力。(34]。在我们的研究中,我们发现CXCL3和休息树突细胞的表达的相关性在OA和RA滑膜组织正好相反的,这可能给洞察OA和风湿性关节炎的免疫微环境。C-X-C主题趋化因子10 (CXCL10),称为干扰素γ全身蛋白质10,据报道,增加炎症细胞的迁移能力由CXCR3。Cxcl10 - / -和Cxcr3 - / -小鼠,F4/80渗透到滑膜巨噬细胞和CD4 T细胞在WT老鼠相比显著降低(35]。CXCL13是许多免疫细胞的趋化因子包括调节性T细胞,滤泡性T细胞和B细胞。系统性硬化患者的血清CXCL13水平异常升高,反映,CXCL13异常激活免疫系统的作用[36,37]。,此外,CXCL9 CXCL10 CXCL11 / CXCR3轴据报道,调节免疫细胞激活,免疫细胞的分化、迁移和迁移,导致焦点目标(38,39]。神经肽Y Y1受体(NPY1R),确定为小说外围血液生物标志物,可预测乳腺癌患者的预后和转移40]。的另一个研究报告说,增加表达NPY1可能促进软骨基质降解和软骨细胞肥大,影响办公自动化的发展(41]。POU2AF1称为B细胞转录共激活剂被发现有显著相关性疾病进展通过评估基因表达在RA患者全血(42]。值得注意的是,这些先前的研究增加中心基因被识别的可信度在我们的研究中。
此外,功能性浓缩度的分析表明,中心基因主要富集在免疫反应信号通路。我们探索了免疫细胞浸润和中心之间的相关性基因和免疫细胞在OA和风湿性关节炎。与OA滑膜相比,7的比例在RA滑膜组织中免疫细胞类型的增加和4类型的免疫细胞减少。先前的研究表明,免疫细胞可能产生各种可溶性介质影响疾病进展(43]。其他研究人员已经发现,有微分组织学滑膜炎的严重程度,免疫细胞的比例,出现不同程度的免疫细胞渗透,和微分upregulation基因B和T细胞激活/函数在类风湿性关节炎的不同阶段(44,45]。渗透不同免疫细胞及其程度的渗透与OA和RA的临床阶段有关吗?不同的免疫细胞的比例在滑膜相关临床预后?这些微分参数提供指导的临床治疗OA和风湿性关节炎?这些问题需要在将来的研究中调查。
虽然我们的研究提供了新中心基因之间的潜在生物标志物OA和RA,必须承认我们的研究的局限性。首先,我们的研究主要集中在数据挖掘和分析,和结果,而初步;虽然用于初步筛选,他们必须验证分析方法和更大的组织。此外,考虑到不一致的深度和广度不同的测序平台的数据集,我们选择从只有GPL96平台数据集进行分析和验证。因此,应该收集更多的数据从不同的平台,获得更多确凿的证据来支持我们的结果。此外,筛查中心基因受到不同的样本大小和计算方法46]。最后,由于缺乏相关的临床信息,中心基因的表达水平在不同临床阶段,免疫细胞浸润的程度不能探索。我们认为,解决上述限制可能会提供更深刻的结果。
5。结论
我们利用生物信息学分析筛选出68度和6中心OA和RA滑膜组织之间的基因。我们发现不同类型的免疫细胞浸润在OA和RA滑膜组织,这些中心基因是高度相关的炎症细胞浸润滑膜组织的免疫微环境。我们相信,这项研究的结果增加我们的理解底层的分子发病机制之间的OA和RA滑膜组织,因此为更好的治疗提供新的检测和定位方法。
数据可用性
可用的数据集分析在当前研究基因表达的综合(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
范太阳和剑林周贡献本文同样。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(81672154)。
补充材料
补充1。S1(补充材料1):GSE55235数据集,从GEO GSE55457, GSE55584, GSE12021下载。
补充2。2 S2(补充材料):68度的列表。S3(补充材料3):不同的算法来确定候选基因中心列表中使用“cytoHubba”插件Cytoscape(3.7.2章版本)。S4(补充材料4):这些中心基因的表达水平(CXCL3、CXCL9 CXCL10, CXCL13, NPY1R,和POU2AF1)从数据集GSE55235 OA / RA, GSE55457, GSE55584。