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体积 2021年 |文章的ID 9434944 | https://doi.org/10.1155/2021/9434944

应Yu Menghang Wang Jianan Wu Fandan孟,Yandong Tang Shujie王,于王,Hongliang Cui Xijun他Yabin涂,帮派Wang Xuehui蔡, ”猪圆环病毒的致病特性3型隔离来自黑龙江,中国”,疾病标记, 卷。2021年, 文章的ID9434944, 8 页面, 2021年。 https://doi.org/10.1155/2021/9434944

猪圆环病毒的致病特性3型隔离来自黑龙江,中国

Menghang王,1 应于,2 Jianan吴,1 Fandan孟,1 Yandong唐,1 Shujie王,1 于王,1 Hongliang崔,1 Xijun他,1 Yabin涂,1 帮王,1 和 Xuehui蔡1

1兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院、中国哈尔滨

2兽医学院、青岛农业大学、266109年青岛,中国

学术编辑器:中杰施
收到了 06年4月2021年
接受 2021年5月30日
发表 2021年6月25日

文摘

猪圆环病毒的临床结果3 (PCV3)感染仍然是有争议的。,小说PCV3隔离(PCV3-China / DB-1/2017)的分子表征24和27 k帽蛋白用于接种cesarean-derived正在逼近,colostrum-deprived小猪。九PCV3 DB-1接种仔猪表现出没有明显的临床症状或宏观损伤。PCV3广泛histotropism显示,包括心脏、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、扁桃体、肺和淋巴结中相比更高数量的病毒基因组的其他器官。从7天后PCV3 DB-1接种,小猪显示明显的免疫球蛋白抗体反应与PCV3 rCap-VLPs。累积的结果表明PCV3低致病性的趋势。

1。介绍

猪圆环病毒(PCV)是目前公认的四种类型(即。、PCV1和PCV2、PCV3 PCV4) [1- - - - - -7],PCV3最近承认从猪农场体验生殖失败和猪皮炎和肾病综合症——(生产)像2015年美国临床症状(3]。宏基因组测序分析显示,PCV3只有48%的氨基酸的身份代表26%蛋白质和氨基酸的身份限制蛋白质相比,PCV2 [3]。

PCV3第一份报告以来的2015年,几乎swine-producing国家在亚洲,欧洲,和美国相同的疾病,但临床表现高度变量从隐性的严重呼吸道疾病和肠道疾病,神经系统疾病,多系统炎症和生殖失败(8- - - - - -15]。在中国,有超过10个省份报道的出现这种病原体,主要集中在病原体的出现和循环猪群(16- - - - - -19]。受到病毒隔离和患病率在患病和健康的猪群,PCV3的临床意义不明确,需要进一步研究。

调查PCV3致病性的小猪,在这项研究中,我们使用一个PCV3隔离(PCV3-China / DB-1/2017 MH286898)接种cesarean-derived正在逼近,colostrum-deprived CDCD小猪。临床症状、病理变化、病毒载量、组织信使rna病毒,抗体PCV3 rCap-VLPs进行调查。这些结果表明,仔猪感染PCV3 DB-1发达没有明显的临床症状或宏观损伤。组织学病理观察显示淋巴细胞减少和一些淋巴结炎症细胞浸润,以及增厚肺部肺泡隔。PCV3复制检测肺和淋巴结的小猪用RNA原位杂交(RNAscope)。明显的免疫球蛋白抗体反应趋势对PCV3 rCap-VLPs出现在五的九DB-1接种仔猪。总之,我们的研究结果提供了一个进一步的解释有争议的PCV3感染的临床意义。

2。材料和方法

2.1。病毒

的PCV3 DB-1隔离(PCV3-China / DB-1/2017 MH286898)用于本研究从肺部孤立的两个10天大的小猪在一个商业的猪生产系统在黑龙江省,中国东北,通过三次PK-15细胞指之前(20.]。80年的ORF2序列代表PCV3完整基因组起源于野猪(NCBI)提供的下载进行系统发育分析。一致的突变氨基酸24和27帽蛋白的潜在分子标记的分类PCV3 [21]。序列对齐使用Clustal X程序与预设参数Clustal W (Lynnon有限DNAMAN软件)。系统发生的树被一个毫升方法推导出基于ORF2 1000引导程序复制到大型5.0。

2.2。动物的挑战

总共18 3个CDCD小猪(免费猪圆环病毒类型的2/3,猪细小病毒,古典猪瘟病毒,或假狂犬病病毒,证实了实时PCR)获得兽医研究所实验动物中心(哈尔滨,中国)。小猪被随机分为两组(9个小猪PCV3接种和模拟的另一个九仔猪感染)。小猪被安置在两个房间分别和保持生物安全二级条件下实验。小猪在virus-inoculation组鼻内(i.n)和肌内(坜)与PCV3隔离DB-1at挑战 分别基因组拷贝。其他九个小猪被用作控制和收到DMEM相同的方式。小猪每天监测临床症状和直肠温度。血样定期收集(0、7、10、14、17、21日和28 DPI)从小猪PCV3和血清学检测。三个小猪PCV3-infected组和阴性对照组是人道的安乐死在14日,21日和28日DPI。在验尸,组织部分(心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、扁桃体、和大脑)被固定在10%磷酸盐福尔马林的苏木精和伊红())和RNAscope检测病毒定量或储存在-70°C。

2.3。实时PCR定量病毒载量的组织

每个组织的总DNA是孤立使用Dneasy血液和组织迷你包(试剂盒)按照制造商的指示。TaqMan荧光定量PCR (q-PCR)进行组织病毒含量的确定PCV3收集了14岁,21日和28 DPI根据一项研究[22]。

2.4。组织病理学检查和RNA检测原位杂交(ISH)

组织样本在磷酸盐10%福尔马林固定,嵌入在石蜡,切成4μm部分,沾着他走时按标准程序。ISH-RNA执行使用RNAscope®2.5高清试剂盒(先进细胞诊断Inc .),目标的特定核苷酸序列PCV3病毒性mRNA (RNAscope®探针,目录没有。463961或530431)formalin-fixed石蜡包埋标本。样本可视化使用奥林巴斯BX43亮场显微镜(奥林巴斯公司(日本东京)。

2.5。血清学

血清抗体PCV3检测使用修改后的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)基于PCV3重组病毒样颗粒(一种)23]。光密度(OD)在450海里使用ELISA板读读者(PE、美国)。的血清OD450大于或等于截止值被认为是PCV3抗体阳性。

3所示。结果与讨论

ORF2序列的系统发育特征表明,PCV3 DB-1是第一个孤立的丙氨酸(A)和赖氨酸(K)在24和27 PCV3帽蛋白在NCBI数据库内。PCV3 DB-1共用一个核苷酸的身份~ 98.3 -99.8% PCV3 ORF2序列存入基因库®(包括80个代表序列(图)1(一))。的ORF2序列PCV3 DB-1展出最高(99.8%)核苷酸身份与MG868940 / MN605934 / MN605937和核苷酸身份最低(98.3%)与MK033235 / MK033209 / MG770384 / MK568469。帽蛋白氨基酸序列的差异分析PCV3 DB-1特定氨基酸和其他PCV3隔离显示五个网站,24 (A / V), 27 (K / R), 77 (S / T), 150 (I / L)和211 (E / K),分别为(图1 (b))。PCV3是一种新发现的病毒,但被发现回顾自1966年以来在中国(21),1967年在巴西(24),1996在西班牙13),和2006年在泰国25]。PCV3据报道在生殖失败的情况下(26,27)、生产和猪circovirus-associated疾病(PCVAD)在临床情况下28]。因此,进一步的研究是必要的评估如果PCV3 DB-1隔离A24和K27帽内可能有独特的表型性状,可以关联到特定的临床表现。

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图1
系统发育分析基于ORF2 PCV3代表序列的序列(a)。使用大型5.0毫升树是重建1000引导程序试验。沿着分支表示引导值的值。差异分析的限制蛋白质的氨基酸序列PCV3隔离(b)。Yellow-shaded氨基酸代表不同的氨基酸序列PCV3隔离。

在动物实验研究中,临床的PCV3 DB-1模拟接种cesarean-derived正在逼近,colostrum-deprived小猪被监控。在实验的四个星期,直肠温度没有明显差异(图2(一个)(图),体重收益2 (b))之间的PCV3 DB-1和模拟接种仔猪。没有明显的宏观损伤被发现在肺部、脾脏、淋巴结(肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结),扁桃体,心脏、肝脏、肾脏、大脑和尸体剖检时14岁,21日和28日DPI。

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图2
直肠温度(a)和体重增长PCV3-inoculated (b)和mock-inoculated小猪。无显著差异的直肠温度和体重增长PCV3-inoculated和mock-inoculated团体之间的小猪被发现在四个星期的实验。 (误差)温度或身体体重增加。

TaqMan荧光定量PCR (q-PCR)来确定执行病毒载量的器官PCV3-inoculated小猪如前所述[22,29日]。准确的检测极限的Ct截止是37岁PCV3积极的诊断样本(22]。PCV3病毒基因组中检测出所有相关的组织,包括肺、脾、淋巴结(肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结),扁桃体,心、肝、肾、大脑;结果表明,PCV3各种histotropism(表1)。在这些组织中,最高水平的PCV3病毒基因组检测肺(Ct 32.1, 102.6723.3副本/ g)、肺(Ct, 105.41拷贝/ g)和腹股沟淋巴结(Ct 26.0, 104.81拷贝/ g)在14 DPI, 21 DPI,分别和28 DPI。这一发现表明,PCV3可以复制它的病毒基因组相比,肺和淋巴结更有效的其他组织。然而,PCV3不能通过不断PK-15细胞(20.),是否可以通过PCV3不断在其他细胞系值得进一步调查。
Ct值(本/ g) 14 DPI 21 DPI 28 DPI 控制
组织 心 32.2 (102.65) 29.7 (103.51) 31.0 (103.09) - - - - - -
肝 32.4 (102.64) 27.2 (104.29) 28.9 (103.79) - - - - - -
脾 32.2 (102.65) 26.6 (104.51) 27.7 (104.14) - - - - - -
肺 32.1 (102.67) 23.3 (105.41) 26.3 (104.53) - - - - - -
肾脏 33.1 (102.40) 29.7 (103.51) 30.3 (103.38) - - - - - -
大脑 32.4 (102.64) 30.4 (103.37) 30.2 (103.39) - - - - - -
ILN 33.6 (102.36) 25.8 (104.86) 26.0 (104.81) - - - - - -
SLN 33.2 (102.40) 27.5 (104.19) 26.6 (104.51) - - - - - -
MLN 33.6 (102.37) 28.3 (103.94) 27.9 (104.10) - - - - - -
扁桃体 33.1 (102.40) 31.3 (103.01) 30.4 (103.37) - - - - - -
MLN:肠系膜淋巴结,ILN:腹股沟淋巴结,SLN:颌下淋巴结;-:高于Ct截止值;每个数字代表的平均Ct值(本/ g)产生至少三次检测。
表1
病毒的动态分布的器官PCV3——mock-inoculated小猪。

进一步描述器官病变引起PCV3 DB-1感染、肺和淋巴结检查在微观层面上的组织病理学损伤。)染色的PCV3 DB-1-infected小猪显示淋巴细胞减少,炎性细胞浸润结合的淋巴结(图3(一个)),以及上皮细胞增生,炎症细胞浸润,肺泡隔增厚在肺部(图3 (c))。相应地,PCV3复制的淋巴结(图中检测出4(一))和肺(图4 (c)由伊什)检测。没有明显的病理损伤出现在mock-infected小猪(数字3 (b)和3 (d)),以及消极的信号在淋巴结(图4 (b))和肺(图4 (d))mock-inoculated小猪。

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图3
组织病理学病变淋巴结(a, b)和肺(c, d)从PCV3——mock-inoculated小猪。小猪感染PCV3 DB-1隔离显示少量淋巴细胞减少,炎性细胞浸润在淋巴结(a),上皮细胞增殖,炎症细胞浸润,肺泡隔增厚在肺部(c),没有明显的病理观察病变淋巴结(b)和肺(d)的mock-inoculated小猪。
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图4
RNAscope原位杂交的淋巴结(a, b)和肺(c, d)从PCV3——mock-inoculated小猪。的PCV3 DB-1感染仔猪出现积极信号淋巴结(a)和肺(c),没有明显的积极信号观察肺淋巴结(b)或(d)的mock-inoculated小猪。

为了更好地理解引发的体液免疫反应PCV3 DB-1挑战,anti-PCV3抗体效价的血清样本进行间接ELISA基于PCV3重组rCap-VLPs [23]。在整个实验过程中,免疫球蛋白抗体反应不同的个体(图中5)。四个九PCV3 DB-1-inoculated小猪显示一个明显的免疫球蛋白抗体反应7(3/4)或10 DPI (1/4)。一个小猪从14 DPI(1/9),其他四个小猪(4/9)显示没有或轻微的28天内免疫球蛋白g血清转化实验。引发的体液免疫反应PCV3 DB-1不同于PCV3 63911隔离,cesarean-derived接种诱导超过1/2,colostrum-deprived小猪(5/8)和增加IgM抗体反应对PCV3帽蛋白7至14 DPI;然而,没有明显的免疫球蛋白g血清转化中检测出任何感染仔猪在28天研究期间(20.]。我们的研究之间的区别和上述研究[20.),有一个趋势对PCV3帽蛋白免疫球蛋白抗体反应。在我们的研究中,5个9 PCV3 DB-1接种仔猪免疫球蛋白抗体反应显示一个明显的趋势。间接ELISA方法在我们的研究基于PCV3重组rCap-VLPs [23,30.]可能节约构象表位和有能力检测免疫球蛋白抗体PCV3的构象表位。抗体的PCV3 rCap-VLPs出现在小猪与特定的免疫状态可能是炎症因素提醒免疫细胞对病毒感染;然而,这些抗体可以中和PCV3是否需要进一步调查。


图5
检测免疫球蛋白抗体PCV3 rCap-VLPs抗原。免疫球蛋白抗体反应(意味着OD450值)检测到PCV3 rCap-VLPs间接ELISA在3个CDCD小猪( )实验后接种与PCV3隔离DB-1或消极的控制(0 - 14 dpi, ;程度dpi, ;第21至28 dpi, )的感染。 (误差)的特定抗体所示。

自猪圆环病毒(PCV3)首次报道从猪的农场在美国,PCV3已经发现猪农场在世界各地。那些报告,临床症状由PCV3感染似乎高度变量:母猪生殖失败和PDNS-like临床症状(3];临床病例从3到10周仔猪多系统和心脏炎症(31日];还是小猪感染PCV3 DNA克隆发展PDNS-like疾病和死亡率(40%32];6周大CDCD猪不起眼的视觉临床表现在实验条件下(20.];和野猪感染PCV3自然显示不致病的但非常普遍(30%)(33]。因为有大量的数据表明PCV3感染可以导致不同的临床结果(不同临床症状)或亚临床症状(无症状)在国内猪(10,12,16,17,28,34- - - - - -37],PCV3致病性已成为争议,需要实验数据来减少这种有争议的学术问题。在我们的研究中,结果PCV3接种CDCD小猪表明PCV3感染不能引起明显的临床症状和病理变化。出现临床症状和疾病的严重程度可能会影响到猪的免疫状态(38,39),压力因素,导致全身炎症(40,41),或与其他猪同时感染病原体(42,43]。累积在我们的研究结果表明,PCV3低致病性的趋势。PCV3之间的协同作用和细菌/病毒合并感染是否有必要进一步研究[44,45]。

总之,小猪接种由PCV3 DB-1隔离24和27 k的分子特征表现出没有明显的临床症状或宏观损伤。然而,这种隔离显示广泛的histotropism,肺和淋巴结中含有较高数量的病毒基因组检测器官,以及感染诱发明显的免疫球蛋白抗体PCV3 rCap-VLPs。这些结果暗示PCV3 DB-1分离趋势低致病性的小猪。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

动物实验协议是动物伦理委员会批准的哈尔滨兽医研究所的中国农业科学院(CAAS)批准号码sy - 2018 - sw - 003。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Menghang王,应于吴Jianan贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持兽医生物技术国家重点实验室的基金会的资助(批准号SKLVBP2018002)和青岛农业大学的博士基础,中国(6631120019)。

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