circRNA hsa_circ_0005909通过miRNA-338-3p/SOX4通路预测非小细胞肺癌不良预后并促进其生长、转移和耐药gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba．环状rna (circRNAs)是调节各种癌症行为的强大因素。已有研究表明，环状RNA hsa_circ_0005909 (circ_0005909)在骨肉瘤中具有调节功能。然而，关于circ_0005909是否在非小细胞肺癌(NSCLC)的进展中具有潜在的作用，目前尚无其他研究。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba．RT-PCR检测circ_0005909在NSCLC中的表达。为了研究circ_0005909敲低后NSCLC细胞的特异性行为，我们采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测、菌落形成检测、Transwell检测和异种移植瘤模型检测。采用生物信息学和荧光素酶报告基因研究circ_0005909、miRNA-338-3p和SOX4之间的相关性。gydF4y2Ba结果gydF4y2Ba．在本研究中，我们组首先发现circ_0005909在NSCLC标本和细胞系中表达明显增加。临床研究表明，circ_0005909高表达与NSCLC患者预后不良相关。在功能上，抑制circ_0005909可抑制NSCLC细胞的增殖、转移和耐药。在机制上，circ_0005909可以作为miRNA-338-3p的海绵，miRNA-338-3p可以靶向SOX4。此外，miRNA-338-3p抑制剂逆转了circ_0005909沉默对NSCLC行为的抑制能力。gydF4y2Ba结论gydF4y2Ba．circ_0005909通过调节miRNA-338-3p/SOX4轴促进NSCLC的进展，这可能是NSCLC的治疗靶点。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

肺癌作为世界上最常见的恶性肿瘤之一，正迅速成为当今肿瘤相关死亡的主要原因[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．非小细胞肺癌(NSCLC)占新发肺癌病例的80% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]迄今为止，尽管临床和实验肿瘤学有了越来越多的发展，但许多患者在诊断时处于晚期，这导致了一种非常不利的局面，即非小细胞肺癌患者的预后仍然不令人满意[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．因此，为了提高非小细胞肺癌的预防、治疗和生存率，有必要进一步深入研究非小细胞肺癌进展的机制。gydF4y2Ba

环状rna (circRNAs)，以闭合环状结构为特征，不含5gydF4y2Ba帽和3gydF4y2Bapoly(A)尾，是一类非编码rna [gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．circrna主要来源于内含子或外显子，而外显子circrna主要在细胞质中表达，比线性rna表现出更好的稳定性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．近年来，越来越多的环状rna被证明通过海绵mirna参与基因表达调控[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．然后，越来越多的研究表明，circrna水平异常显著参与了各种肿瘤的癌变和进展，包括NSCLC [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．越来越多的研究揭示环状rna可能通过与mirna竞争性结合，在几种类型的肿瘤中作为抑癌基因或肿瘤启动子发挥作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．尽管越来越多的circrna在非小细胞肺癌中显示出异常水平，但它们在非小细胞肺癌进展中的功能和相关分子机制仍不清楚。gydF4y2Ba

环状RNA hsa_circ_0005909 (circ_0005909)是一种新发现的长度为371个核苷酸的环状RNA，来源于XPR1 mrna的反向剪接。最近，有报道称circ_0005909在骨肉瘤中明显过表达，其致癌作用也在细胞实验中得到证实[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．然而，circ_0005909在其他肿瘤中的表达和功能尚未被研究。在这里，我们组首次提供了circ_0005909在NSCLC中表达增加的证据。此外，我们还进一步探讨了circ_0005909对NSCLC行为的影响。gydF4y2Ba

2.材料和方法gydF4y2Ba

2．1．临床标本gydF4y2Ba

从2013年7月至2016年3月在潍坊人民医院接受手术的非小细胞肺癌患者中，共获得102份成对的非小细胞肺癌标本和配对的非癌标本。根据组织病理学评估，对非小细胞肺癌患者进行了诊断。本研究中使用的方案经伦理审查委员会批准所有患者均提供书面知情同意书。gydF4y2Ba

2．2.细胞培养和转染gydF4y2Ba

人非小细胞肺癌细胞株(H460, A549, Calu-3, sk - me -1)和正常人支气管上皮细胞(NHBE)由中国上海集和科技提供。这些细胞在含有10%胎牛血清(FBS, MedChemExpress，美国)的DMEM或RPMI 1640培养基(longza，浙江平生物，中国)中培养，37℃，5% COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在潮湿的培养箱中。gydF4y2Ba

对于多种因素的失调，小发夹RNA circ_0005909 (sh-circ_0005909)、miRNA-338-3p抑制剂(5gydF4y2Ba -gydF4y2BaGCAAAAAUUAGUGUGCGCCACC-3gydF4y2Ba ），gydF4y2Bamicrorna - 338 - 3 - p模仿(5gydF4y2Ba -gydF4y2BaUUUGAGCAGCACUCAUUUUUGC-3gydF4y2Ba ），gydF4y2Ba和他们的阴性对照(5gydF4y2Ba -gydF4y2BaCAGUACUUUCAGUGCCAUCACAC-3gydF4y2Ba ）gydF4y2Ba由贺武公司(上海，奉贤市)提供。为了提高circ_0005909的水平，将circ_0005909全长克隆到转基因的LV003慢病毒载体中(合物公司，上海，中国)。一个空的矢量作为控制。根据产品说明书，采用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，中国浙江杭州)瞬时转染A549和H460细胞。转染48小时后收获细胞。gydF4y2Ba

2．3.生物信息学分析gydF4y2Ba

为了探索circrna、mirna和靶mrna之间潜在的网络，我们使用CircInteractome预测miRNA-338-3p结合到circ_0005909上的位点，使用TargetScan预测miRNA-338-3p结合到3上的位点gydF4y2Ba -gydF4y2BaUTR SOX4。gydF4y2Ba

２.４.RNA提取和qRT-PCRgydF4y2Ba

总rna的收集，根据产品指南使用TRIzol试剂(Invitrogen公司，上海浦东)。采用PrimeScript RT Reagent Kit (Bio-Rad，中国闵行爱研生物)合成互补DNA。使用PrimeScript™RT试剂试剂盒(Bio-Rad, Aiyan生物学，闵行，中国)，1微克总RNA被逆转录，最终卷为25gydF4y2BaμgydF4y2Bal.使用ABI Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, China)进行RT-PCR检测lncrna和mrna的相对水平。采用U6和GAPDH作为内控。目的基因的相对表达量通过gydF4y2Ba方法。所有引物序列列于表中gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

2．5．核糖核酸酶R治疗gydF4y2Ba

总rna (15gydF4y2BaμgydF4y2Bag)添加或不添加4u·培养gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}rna酶R (Geneseed, Jisai Biology，广东科学城)。37℃孵育20分钟后，使用RNeasy MinElute Cleaning Kit (Qiagen, Nanjing, China)纯化收集的rna。最后，RT-PCR检测rna的表达。gydF4y2Ba

2.6。细胞计数试剂盒8 (CCK-8)检测gydF4y2Ba

将细胞重新悬浮并置于96孔板中，培养24小时 h、 四十八 h、 七十二 h、 和96 h、 分别加入细胞计数试剂盒-8试剂，2小时后测量每个孔的光密度值。gydF4y2Ba

2.7。集落形成实验gydF4y2Ba

A549和H460细胞在6孔板中以500/孔的密度培养14天。随后，细胞在4%多聚甲醛(Yubo，上海，中国)中固定，用0.1%结晶紫(TargetMol，静安，上海，中国)染色。最后，手工计数收集的细胞。gydF4y2Ba

2.8。EdU染色gydF4y2Ba

用EdU法测定细胞增殖。A549和H460分别接种于48孔板，然后用EdU培养基(上海固研)孵育上述细胞。将EdU染色试剂应用于染色细胞。A549和H460细胞在PBS洗涤三次后，在DAPI溶液中培养。通过倒置荧光显微镜获得图像。gydF4y2Ba

2.9。Transwell化验gydF4y2Ba

在上部的Transwell室，gydF4y2Ba 将转染的细胞接种。在下腔，我们组加入20%胎牛血清的培养基。采用基质(FS-79049，富盛生物，上海浦东)预涂膜。在顶部的房间里，gydF4y2Ba 细胞补充道。一天后，4%多聚甲醛固定，0.05%结晶紫染色(Beyotime，海淀，中国北京)。对侵入性细胞进行成像和计数。gydF4y2Ba

2.10。荧光素酶报告实验gydF4y2Ba

3gydF4y2Ba -gydF4y2Ba扩增SOX4的UTR，并克隆到pGL3/荧光素酶载体(SOX-Wt)下游。然后是突变体gydF4y2Ba -gydF4y2Ba扩增SOX4的UTR，并克隆到pGL3/荧光素酶载体(SOX-Mut)下游。构建circ_0005909野生型(circ_0005909_Wt)和突变型(circ_0005909_Mut)报告载体并插入pGL3。A549和H460细胞共转染荧光素酶报告载体和miR-NC或miR-338-3p。一天后，细胞被裂解。应用双荧光素酶报告系统(Promega，中国北京海淀)检测荧光素酶的相对活性。gydF4y2Ba

2.11。亚细胞分离gydF4y2Ba

根据制造商说明书，使用PARIS试剂盒(Life Technologies, Haidian, Beijing, China)进行核和胞质部分分离。gydF4y2Ba

2.12.RNA下拉分析gydF4y2Ba

商业合成的生物素标记miRNA-338-3p购自中国浙江杭州晨华生物科技有限公司，转染A549和H460细胞48 h。然后，根据产品指南，使用Dynabeads M-290 Streptavidin (Sigma-Aldrich, Nanjing, Jiangsu, China)孵育细胞裂解液。用TRIzol纯化相互作用的RNA复合物。采用RT-PCR检测circ_0005909的水平。进行了三个独立的实验。gydF4y2Ba

2.13。免疫印迹分析gydF4y2Ba

采用RIPA buffer (medchemexpress, Pudong, Shanghai, China)从NSCLC组织和细胞系中提取总蛋白。采用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime)定量检测蛋白浓度。在之前的研究中描述了western blot的具体步骤。本实验采用抗SOX4的一抗(1:10 00，固多生物，上海浦东)。以GAPDH作为对照。gydF4y2Ba

2.14。体内肿瘤生长试验gydF4y2Ba

用sh-circ_0005909或sh-NC转染A549细胞。BALB/c裸鼠皮下注射细胞(gydF4y2Ba ，gydF4y2Ba雌性，5-6周龄;赛野生物，江苏苏州)。动物实验经潍坊市人民医院动物护理使用委员会批准。在指定时间检查肿瘤体积，计算公式如下:gydF4y2Ba ．gydF4y2Ba七周后，小鼠被杀死，收集的肿瘤被称量并收获用于后续研究。gydF4y2Ba

2.15。统计分析gydF4y2Ba

所有数据采用SPSS 15.0软件进行分析。为了探究两组(或>两组)之间的差异，学生的gydF4y2Ba -gydF4y2Ba检验或单因素方差分析(ANOVA)，然后进行LSD事后检验。分类因素的差异采用卡方检验。生存测定采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。采用Cox回归模型进行单变量和多变量分析。的值gydF4y2Ba 被认为是重要的。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

３．１．circ_0005909在非小细胞肺癌中表达增加gydF4y2Ba

首先，我们采用RT-PCR检测circ_0005909在NSCLC中是否有异常表达。如图所示gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba， circ_0005909在NSCLC标本中的表达明显高于匹配的非癌标本。与NHBE细胞相比，4个NSCLC细胞系中circ_0005909的水平升高(图)gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba）.为了研究circ_0005909的环状特性，我们进行RNase R处理，发现在A549和H460细胞中，RNase R处理后，circ_0005909的表达没有变化，而GAPDH的水平明显下降(图)gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba）.通过荧光亚细胞分割，我们观察到更大比例的circ_0005909在细胞质中(图gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

３.２．circ_0005909高表达预示NSCLC患者预后不良gydF4y2Ba

circ_0005909表达水平相对中位数分为高或低。卡方检验提示circ_0005909高表达与肿瘤淋巴结转移(TNM)分期相关(gydF4y2Ba ）gydF4y2Ba及远处转移(gydF4y2Ba ）gydF4y2Ba(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.为了进一步探讨circ_0005909异常在NSCLC标本中的预后价值，我们组进行了Kaplan-Meier生存分析，发现circ_0005909高表达的患者总生存期较低表达的患者短(gydF4y2Ba ，gydF4y2Ba数字gydF4y2Ba1 (f)gydF4y2Ba）.更重要的是，多因素分析显示circ_0005909高表达与总生存率独立相关(gydF4y2Ba ；gydF4y2Ba95%置信区间:1.138—-3.667;gydF4y2Ba ；gydF4y2Ba表格gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

３．３．circ_0005909沉默对NSCLC细胞增殖和转移的抗肿瘤作用gydF4y2Ba

为了研究circ_0005909在NSCLC行为中的潜在作用，我们下调了circ_0005909的表达。RT-PCR检测表明sh-circ_0005909在A549和H460细胞中均有转染效果。而转染sh-circ_0005909后，XPR1 mRNA的表达保持不变(图)gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba）.CCK-8的生长曲线表明，circ_0005909沉默明显抑制了A549和H460细胞株的细胞增殖和菌落形成(图)gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba）.我们还探索了circ_0005909对NSCLC细胞化疗耐药的影响，发现抑制率随着ADM浓度的增加而被抑制，circ_0005909的沉默降低了ADM对A549和H460细胞的抑制作用(图)gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba）.此外，菌落形成和EdU检测表明，circ_0005909的下调导致细胞生长减少(图)gydF4y2Ba2 (e)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (f)gydF4y2Ba)进一步的体内实验显示，circ_0005909基因敲除降低了肿瘤体积和重量（图gydF4y2Ba2 (g)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba2(我)gydF4y2Ba）.此外，我们还探索了circ_0005909失调是否会影响A549和H460细胞的潜在转移。Transwell实验显示，敲低circ_0005909后侵袭性A549和H460细胞明显减少(图)gydF4y2Ba2 (j)gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

3．4．海绵miRNA-338-3p在非小细胞肺癌中的作用gydF4y2Ba

许多研究表明，细胞质环状rna可能通过miRNA海绵的功能调节各种基因的表达[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．我们已经证明circ_0005909在细胞质中富集，提示它可能通过作为一个ceRNA来发挥其功能。使用CircInteractome软件，我们观察到miRNA-338-3p可能与circ_0005909结合的概率较高(图)gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)以前，一些研究表明miRNA-338-3p是一种肿瘤抑制因子，提示circ_0005909可能通过海绵状miRNA-338-3p促进NSCLC进展[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．因此，我们选择miRNA-338-3p进行进一步研究。RT-PCR显示，miRNA-338-3p在肿瘤标本和细胞株中的表达均明显降低(图)gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba）.Cancer Genome Atlas (TCGA)数据集也显示，在NSCLC标本中miRNA-338-3p表达下调(图)gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba）.miRNA-338-3p模拟物明显降低了circ_0005909-WT的荧光素酶活性(图)gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba）.此外，根据RNA下拉实验，circ_0005909在miRNA-338-3p组中富集(图)gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba)此外，在sh-circ_0005909转染的A549和H460细胞中，miRNA-338-3p的表达明显增加（图gydF4y2Ba3 (g)gydF4y2Ba）.然后通过救援实验研究circ_0005909与miRNA-338-3p之间的直接作用。RT-PCR结果显示，在A549和H460细胞中，miRNA-338-3p沉默明显逆转了circ_0005909沉默对miRNA-338-3p表达的促进作用(图)gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba）.CCK-8检测显示，circ_0005909沉默降低了A549和H460细胞的增殖，sh-circ_0005909+miRNA-338-3p抑制剂组的细胞活力明显高于sh-circ_0005909组(图)gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)在菌落分析和Edu分析中，也观察到类似的结果（图gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba）.Transwell实验表明sh-circ_0005909抑制细胞侵袭，恢复了circ_0005909和miRNA-338-3p的双重抑制(图)gydF4y2Ba4 (e)gydF4y2Ba）.根据我们的发现，circ_0005909可能通过海绵吞噬miRNA-338-3p促进NSCLC进展。gydF4y2Ba

3．5．Circ_0005909通过海绵miRNA-338-3p促进SOX4表达gydF4y2Ba

使用在线工具(TargetScan)，我们观察到SOX4可能是miRNA-338-3p的潜在靶标(图gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba）.基于TCGA数据集，我们观察到SOX4表达在肺癌标本中明显上调(图)gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba）.在我们的队列中也观察到类似的SOX4过表达(图)gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba）.此外，RT-PCR还显示SOX4在四种NSCLC细胞中的表达均高于NHBE细胞(图)gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba）.荧光素酶报告基因检测显示miRNA-338-3p模拟物降低了SOX4-WT的相对荧光素酶活性(图)gydF4y2Ba5 (e)gydF4y2Ba）.miRNA-338-3p沉默导致SOX4明显上调，而miRNA-338-3p过表达则相反(图)gydF4y2Ba5 (f)gydF4y2Ba）.最后，修复实验显示miRNA-338-3p的上调逆转了circ_0005909过表达对SOX4表达的显著促进作用(图)gydF4y2Ba5 (g)gydF4y2Ba）.gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

NSCLC进展中新型调节剂的识别对于靶向治疗的改进非常重要[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．许多研究表明，circrna在miRNA抑制和肿瘤发生中具有调节功能，包括NSCLC [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．例如circ_0074027在NSCLC中高表达，其过表达通过海绵miRNA-2467-3p增加RHOA表达，明显促进了NSCLC细胞的转移[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．circNDUFB2在非小细胞肺癌中显示出低水平，其强制表达明显导致通过稳定igf2bp和激活抗肿瘤免疫抑制非小细胞肺癌细胞生长和侵袭的能力[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．这些发现鼓励我们进一步识别其他功能环状rna。在本研究中，我们小组识别了一种新的与NSCLC相关的circRNA, circ_0005909，它在NSCLC标本中明显过表达。临床分析显示circ_0005909高表达提示NSCLC患者预后不良。在功能上，我们观察到circ_0005909的沉默抑制了NSCLC细胞的增殖和转移能力以及耐药，提示circ_0005909可能是NSCLC的治疗靶点。此前，circ_0005909在骨肉瘤中的肿瘤促进作用也有报道[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．因此，circ_0005909的有效性和特异性是否存在串扰有待进一步研究。gydF4y2Ba

在机制分析方面，大量研究表明环状rna通过作为miRNA海绵调节肿瘤进展[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．也就是说，circrna可以结合mirna抑制其表达，竞争性地抑制mirna与其潜在的靶向基因之间的相互作用，从而调节肿瘤进展。例如，据报道circ_0110757通过海绵miRNA-1298-5p增加了神经母细胞瘤中替莫唑胺的耐药性[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．循环RNA RHOT1通过miR-106a-5p/STAT3轴促进乳腺癌转移和抑制ferroptosis [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．此前，circ_0005909被证实在骨肉瘤中海绵化miRNA-338-3p和miR-936，从而促进骨肉瘤的进展[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．这些发现表明circ_0005909是骨肉瘤潜在的治疗靶点。然而，circ_0005909是否也通过海绵miRNAs表现出其对非小细胞肺癌进展的影响尚未被研究。我们的研究证明，circ_0005909与miRNA-338-3p结合降低其表达，提示在NSCLC细胞进展中存在新的circRNA/miRNA轴。近年来，在包括NSCLC在内的多种肿瘤中，miR-338-3p的高表达及其促进肿瘤细胞生长和侵袭的作用已被频繁报道[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27gydF4y2Ba］．本课组进一步报道circ_0005909敲低对NSCLC细胞增殖和转移能力的抑制作用可被miRNA-338-3p抑制逆转，提示circ_0005909可能海绵miRNA-338-3p促进NSCLC细胞的不可控行为。gydF4y2Ba

SOX4是SOX (SRY-related HMG box)基因家族的成员，该家族由参与细胞和器官分化以及各种类型肿瘤进展的转录因子组成[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．许多研究表明，SOX4表达在超过22种恶性肿瘤中明显上调，并在恶性表型中作为致癌基因[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．重要的是，已有多项研究证明SOX4在NSCLC中表达增加，促进了NSCLC的肿瘤生长和迁移[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]在这项研究中，我们还发现非小细胞肺癌中存在高水平的SOX4。有趣的是，生物信息学分析显示miRNA-338-3p可以靶向SOX43gydF4y2Ba -gydF4y2BaUTR。根据RNA下拉实验和荧光素酶报告基因的数据，我们观察到它们可以靶向结合，miRNA-338-3p可以抑制SOX4的表达。另一方面，抢救实验证明miRNA-338-3p过表达逆转了circ_0005909过表达对SOX4水平的明显抑制。这些结果提示circ_0005909作为一种ceRNA，通过调节miRNA-338-3p/SOX4信号轴促进NSCLC的生长、侵袭和转移。gydF4y2Ba

综上所述，目前的数据描述了NSCLC中circ_0005909/miRNA-338-3p/SOX4轴，提示circ_0005909促进了NSCLC的进展。因此，circ_0005909是NSCLC患者的候选生物标志物和治疗靶点。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

根据合理要求，可从通讯作者处获得用于支持本研究结果的数据。gydF4y2Ba

利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称不存在相互竞争的利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

宋鹤梅和张晓燕为手稿发展了概念，并设计了研究。和梅宋和丹孟进行了实验。宋鹤梅和王金平进行了数据分析并讨论了结果。论文由张晓燕、宋和梅、丹孟撰写，全体作者参与了论文的编辑工作。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

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