文摘
PIWI-interacting rna (piRNAs)是小非编码rna扮演重要角色在生殖系发展和致癌作用。在这项研究中,我们使用小RNA转录组研究的深度测序piRNA表达式在六个肾透明细胞癌(ccRCC)组织和与相邻正常组织,发现六piRNAs ccRCC组织调节和十六个表达下调。加入其中,piRNA - 31115 (NCBI号码:DQ571003)是最调节piRNA ccRCC组织与匹配相邻正常组织。实时定量PCR(存在)是用来证实pir - 31115表达其他ccRCC组织( )和ccRCC细胞系。此外,功能分析表明,沉默的pir - 31115抑制ccRCC细胞增殖,运动性、侵袭性。机械的调查表明,pirna - 31115可能激活epithelial-mesenchymal过渡(EMT)通过PI3K / AKT信号通路。因此,pir - 31115可能代表一个ccRCC致癌基因的发展。
1。介绍
肾细胞癌(RCC)是最常见的一种泌尿系统恶性肿瘤,占大约2%到3%的成人恶性肿瘤(1,2]。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是最常见的类型的碾压混凝土,占所有RCC病例的60%到85% (3]。目前的成像方法,如计算机断层扫描(CT),已经能够检测到越来越多的小肾群众;然而,ccRCC是阴险的,约30%的患者会出现局部侵犯及远处转移病灶,即使他们被发现4,5]。因此,这些ccRCC病人已经失去了彻底的手术切除的机会和展示的五年生存率低。因此,一个更好的预测ccRCC病人潜在的个性化治疗策略是急需的。
piRNAs一类小能力非编码rna的核苷酸,可以绑定到匹威Argonaute家族的蛋白质来完成他们的监管功能,导致一个沉默的形成蛋白质复合体,沉默互补序列(6]。一方面,转座因子PIWI-piRNA复杂可以沉默(te)维护生殖系基因组完整性在转录和转录后的层面,这是相关的生物起源和不同物种之间可能是守恒的函数(7]。另一方面,PIWI-piRNA复杂主要描述为功能发展的癌症通过表观遗传修饰DNA甲基化和组蛋白修饰(8]。燕等人透露,pir - 823的直接监管机构DNA甲基转移酶3 a和3 b(种能阻碍DNMT3B DNMT3A和);pir - 823减少全球的抑制甲基化在多发性骨髓瘤和恢复启动子的甲基化的CpG岛p16 (9]。综上所述,piRNAs中扮演重要角色的规定通过TE基因表达沉默和表观遗传修饰。
根据大量研究,piRNAs有丰富的生物功能和参与各种生理和病理过程的癌症,如多发性骨髓瘤(9),膀胱癌(10],乳腺癌[11),和胃癌12]。这些发现表明piRNAs可以作为小说预后生物标志物,可能代表一种重要的治疗目标肿瘤(13]。在这项研究中,我们使用小RNA深测序探索的影响piRNA ccRCC和确定了小说piRNA, pir - 31115年尚未报道的致癌基因ccRCC的发展。
2。方法
2.1。人类ccRCC组织样本
所有的ccRCC组织和匹配相邻正常肾组织取自病人tumorectomies的泌尿外科暨南大学第一附属医院(广州华侨医院;广州,中国)在2014年和2018年之间。手术后,我们收集 远离肿瘤。所有的样本被放置在RNA-later和冷藏一夜之间在4°C,之后他们在液态氮冷冻。至少两个临床病理学家证实了组织学和病理学诊断。所有样本的获得与适当的从患者知情同意和批准的暨南大学第一附属医院伦理委员会。
2.2。小型图书馆RNA制备、测序和数据分析
总金额的3μg总RNA /样本作为输入材料的小RNA图书馆。测序库生成使用NEBNext®多路小核糖核酸库预备组Illumina公司®(美国内)遵循制造商的建议,和索引代码添加到属性序列中每个样本。简单地说,一个内3SR适配器是直接并专门绑定3microrna年底,siRNAs, piRNAs。后3结扎反应,SR RT底漆杂化的多余3SR适配器(3后,保持自由结扎反应)和单链DNA适配器变成一个双链DNA分子。这一步很重要,防止adaptor-dimer形成。此外,dsDNAs不是结扎基质由T4 RNA连接酶1,因此,不结扎5SR适配器在随后结扎的一步。一个5 - - - - - -终端适配器绑定到5microrna的两端,siRNAs piRNAs。然后,反应合成第一链cDNA M-MuLV逆转录酶(-)的前体。PCR扩增都使用了LongAmp Taq 2 X大师,Illumina公司SR底漆,指数(X)底漆。PCR产品提纯8%聚丙烯酰胺凝胶(100 V, 80分钟)。DNA片段对应140 ~ 160个基点(小非编码RNA + 3的长度和5适配器)康复并溶解在8μl洗脱缓冲。最后,图书馆质量评估2100年安捷伦生物分析仪系统使用DNA高敏感芯片。index-coded样本的聚类进行cBot集群生成系统使用TruSeq SR集群装备v3-cBot-HS (Illumina公司)根据制造商的指示。集群生成后,图书馆准备被测序的Illumina公司Hiseq 2500/2000平台,和50个基点单头读取生成。
原始数据(生读)fastq格式首先通过定制的perl和python脚本处理。适配器序列和劣质读取被获得清洁读从原始读。小RNA标记映射到piRNABank (http://pirnabank.ibab.ac.in/),屏幕和注释使用Bowtie1 piRNAs。归一化和测试之间的微分表达式piRNA肿瘤和匹配正常肾组织进行使用DESeq2 R / Bioconductor包。
2.3。细胞系的培养和治疗
人类ccRCC细胞系(CAKi-1 CAKi-2 786 o、ACHN和769 p)和永生化正常肾上皮细胞系,HK-2,从美国购买类型文化(美国马纳萨斯写明ATCC)集合。786 o, ACHN rpim - 1640年和769 p维护媒介(生物产业、以色列)补充10%胎牛血清(的边后卫;青霉素、链霉素生物产业、以色列)和1%(生物产业、以色列)。CAKi-1 5和CaKi-2细胞培养介质(生物产业、以色列)补充与青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。HK-2 DMEM / F-12培养基培养细胞(生物产业、以色列)补充与青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。所有的细胞培养在湿润孵化器(美国热费希尔科学)有限公司为5%2在37°C。
2.4。提取RNA,反转录聚合酶链反应(rt - PCR)和定量实时PCR(存在)
总RNA分离试剂盒(生活技术,美国)根据制造商的指示。对RT - pcr, RNA是反向转录cDNA用随机引物使用miScript II RT工具包(试剂盒、希尔登,德国)。rt - PCR反应进行使用Bio-Rad T100 PCR(美国Bio-Rad)。量化piRNAs,执行中存在使用试剂盒miScript SYBR绿色PCR技术(希尔登,德国)。U6作为内部控制。所有的分析使用ABI 7500定量实时PCR仪(美国生活技术)。的方法被用来计算不同基因的相对表达水平。的引物序列pir - 31115是5 - - - - - -AGCCTGAGCAACATAGCGAG-3 。
2.5。细胞转染
pir - 31115抑制剂,能控制抑制剂合成(上海,中国)。击倒的pir - 31115表达通过pir - 31115抑制剂(5 nmol)转染使用Lipofectamine 2000(美国英杰公司)根据制造商的指示,和一个控制抑制剂被用作控制。转染后细胞收集48 h。pir - 31115表达水平是由存在决定的。
2.6。CCK-8化验
细胞增殖能力评估的细胞计数Kit-8 (CCK-8;Dojindo、日本)。约 转染CaKi-1和786 o 96 -孔板细胞培养。在0、24、48和72 h, 10毫升CCK-8试剂添加到每个好然后在37°C孵化2 h。450纳米的光密度每好测试的自动标(美国热费希尔科学)。所有化验都至少重复三次。
2.7。伤口愈合实验
CaKi-1 786 o细胞培养6-well盘子和挠20μl confluency吸管提示后达到80 - 90%。细胞培养在孵化器37°C 24 h血清5或rpim - 1640中,成像在0 h和24小时通过一个奥林巴斯IX51显微镜(日本奥林巴斯)。
2.8。Transwell-Migration和入侵检测
约 转染CaKi-1和786 o细胞被置于上部腔体24-well板块(美国纽约康宁)有或没有人工基底膜(美国纽约BD生物科学),而500年μl中有20%的边后卫是放置在较低的房间作为化学引诱物。钱伯斯是孵化24 h,在37°C和4%多聚甲醛固定细胞,然后沾0.1%结晶紫为30分钟。细胞迁移的数量或入侵五随机计算字段在一个奥林巴斯IX51倒置显微镜(日本奥林巴斯)。所有化验都至少重复三次。
2.9。免疫印迹
总蛋白提取使用里帕从细胞裂解缓冲(凯基生物生物技术)。溶菌产物蛋白质分离10% sds - page和electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。阻塞后5%的脱脂牛奶TBST 2 h,与中小学被孵化的蛋白质抗体。通过使用增强化学发光信号检测是可视化。浓度是决定使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(皮尔斯,热费希尔科学)。主要的抗体用于西方墨迹图如下:兔抗体波形蛋白(细胞信号技术),GAPDH(细胞信号技术,5174),蜗牛(细胞信号技术,3879),钙粘蛋白(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,564186),phospho-Akt(细胞信号技术,4060),一种蛋白激酶(细胞信号技术,4691),PI3K(细胞信号技术,4257),和phospho-PI3K(细胞信号技术,17366)。相关数据与图像实验室软件进行分析。
2.10。统计分析
所有的数据显示为 。统计分析使用SPSS 22.0统计软件SPSS,芝加哥,美国)和7.0 GraphPad棱镜。ccRCC差异之间的组织和邻近的正常组织和成对的术前和术后OS使用学生的患者样本进行了分析 - - - - - -测试。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。小RNA序列显示pir - 31115在ccRCC调节
小RNA转录组的深度测序被用来探索piRNA表达式在六双肾透明细胞癌组织和匹配相邻正常组织。总共19 piRNAs调节和41 piRNAs ccRCC组织中表达下调(fold-changes≥2,值< 0.05);列出所有piRNAs补充材料。其中,piRNA - 31115是最调节piRNA ccRCC组织与匹配相邻正常组织相比(图1(一))。因此,我们选择pir - 31115作进一步调查。
(一)
(b)
(c)
(d)
然后我们验证pir - 31115的表达水平在另一个40双ccRCC组织和与相邻正常肾组织中存在。如图1 (c)pir - 31115是调节在大多数ccRCC组织,这是与小RNA序列数据(图一致1 (b))。接下来,我们检查的表达在五ccRCC pir - 31115细胞株(786啊,769 p, ACHN CAKi-1,和CAKi-2)和永生化正常肾上皮细胞系(HK-2)。如图1 (d)pir - 31115在5 ccRCC细胞系而HK-2调节(图1 (d))。
3.2。沉默ccRCC pir - 31115抑制细胞增殖的细胞在体外
探索的影响pir - 31115 ccRCC致癌,CaKi-1和786度细胞转染pir - 31115抑制剂或控制抑制RNA。存在结果表明转染pir - 31115的抑制剂能降低pir - 31115的表达与对照组(数字2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
接下来,我们进一步研究了ccRCC细胞株的增殖。如数据所示2 (b)- - - - - -2 (d)CCK-8试验表明,沉默的pir - 31115抑制显著抑制ccRCC细胞增长与对照组相比。这一结果显示,沉默的pir - 31115抑制CaKi-1和786 o细胞的扩散在体外。
3.3。沉默的pir - 31115抑制ccRCC细胞系侵袭转移关系在体外
接下来,我们化验ccRCC细胞的浸润和转移。愈合试验表明沉默的pir - 31115抑制细胞迁移CaKi-1和786年o细胞(图3(一个))。也同样,沉默的pir - 31115抑制细胞迁移和入侵ccRCC transwell-migration和Matrigel-invasion化验(数字3 (b)和3 (c))。这些发现表明,沉默的pir - 31115抑制ccRCC细胞的迁移和入侵在体外。
(一)
(b)
(c)
3.4。pir - 31115可能激活Epithelial-Mesenchymal过渡过程和PI3K / AKT信号通路
Epithelial-mesenchymal过渡(EMT)是一个过程,上皮细胞获得间充质特性。在癌症、EMT与肿瘤发生有关,入侵,转移,抵抗治疗。值得注意的是,在表达下调pirna - 31115水平,上皮钙粘蛋白标志蛋白表达的调节和间叶细胞标记波形蛋白和蜗牛(图有所下降4(a))。证据表明,PI3K参与是一个关键的致癌因素激活的几个途径,包括细胞增殖和侵袭,以及EMT过程。免疫印迹进行确定pPI3K / PI3K和pAKT / AKT水平CaKi-1应对pir - 31115年和786度细胞抑制剂治疗(图4(a))。我们发现一种蛋白激酶的磷酸化和PI3K表达击倒pir - 31115后显著降低。结果表明,pir - 31115可能激活epithelial-mesenchymal过渡过程和ccRCC PI3K / AKT信号通路。
4所示。讨论
piRNA首次发现和确认为一种新的长小干扰RNA (siRNA)黑腹果蝇后来发现高度丰富的在小鼠睾丸和与匹威Argonaute家族的蛋白质(14,15]。目前,这是保守估计,大约有20000 piRNAs真核生物的基因组。成熟piRNAs可以与匹威蛋白质结合,形成复杂的生殖系,可能达到他们的目标成绩单和动员沉默机械块转位因子的转录(TE),维持基因组的完整性。例如,它发现piRNA-PIWI复杂定位识别转录网站主卵泡细胞的转座子的成绩单果蝇,然后招募组蛋白甲基转移酶执行H3K9甲基化改性的H1组蛋白抑制转录(8]。
不像microrna piRNA尚未广泛研究癌症;只有少数研究表明piRNA改变了癌症的表达谱。然而,由于小RNA深测序用于比较不同在不同的组织表达谱,有人建议piRNA-PIWI在各种类型的生物功能恶性实体肿瘤(6,16,17]。程出版社。报道,pir - 823的表达显著降低胃癌患者的外周血和胃癌组织,表明pir - 823有潜力作为胃癌的诊断标记,和表达水平与胃癌的阶段(12]。过度的pir - 823抑制胃癌细胞生长。此外,pir - 823也被证明与ccRCC[有关18]。
先前的研究表明,pir - 32051, pir - 39849和pir - 43607在ccRCC调节(19,20.),而其他piRNAs pir - 823, pir - 38756, pir - 57125, pir - 34536, piR51810在肿瘤组织中表达下调(16,21]。在这项研究中,我们进行了小RNA深测序调查全面piRNA ccRCC言论,发现pir - 31115是最调节piRNA ccRCC组织与匹配相邻正常组织。此外,沉默的pir - 31115抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭性。
此外,大量的研究发现,人类匹威蛋白异常表达在多种肿瘤,如乳腺癌[11[],胰腺癌22),和肝癌23),但匹威蛋白的异常表达是如何影响肿瘤的临床特点是未知的。一项研究报道,upregulation piR-Hep在肝细胞癌可以促进肝细胞细胞增殖通过绑定PIWI2 /门影响PI3K / AKT信号(17]。在这里,我们还发现,pir - 31115可能激活epithelial-mesenchymal过渡过程和PI3K / AKT信号通路在ccRCC,但匹威蛋白质与pir - 31115相互作用需要进一步研究。piRNA函数的一些研究表明,piRNAs目标mRNA转录降低或抑制肿瘤抑制基因或致癌基因,microrna的分别,这是一个独特的机制。然而,需要进一步的调查。
5。结论
总之,我们探讨了piRNA表达式在六双ccRCC组织和发现pir - 31115是调节和促进细胞增殖和入侵通过EMT过程和ccRCC PI3K / AKT信号通路。pir - 31115 ccRCC患者可能是一个潜在的治疗目标。然而,仍然有一些固有的局限性在这项研究中,我们没有调查pir - 31115年生物功能的影响在活的有机体内。pir - 31115的机制仍然不太为人所知。鉴于此,仍需要进一步的调查在动物模型和其他信号通路的分子机制。
数据可用性
可以按照客户要求所有的数据都包含在本研究通过与相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
DXH进行实验,收集和分析数据,起草了手稿。综述和XXX进行实验和分析数据。实验方案得到执行。LCY子设计的研究,分析了数据,修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。兴华Du和李Haomin贡献了这个工作,他们同样co-first作者。
确认
这项研究是由国家重点支持的研究和发展项目的中国(2016号yfc1305703)、广东省医学科学研究基金会、中国(没有。A2019571),中央大学的基础研究基金(21618303和21618303号),阳江市科技项目卫生局Lai博士(2021036),和科技项目阳江市科技局(没有。SF2021212 Lai博士)。
补充材料
表S1:差异表达piRNAs检测到小核糖核酸测序ccRCC组织和与相邻正常肾组织( 和值< 0.05)(baseMean:意思是所有样品的归一化计算;log2FoldChange: log2褶皱变化;lfcSE:标准误差;价值:瓦尔德的测试价值;的:BH调整值)。(补充材料)