ESAT-6和Ag85A合成肽作为Immunodiagnostic候选人测试儿童的临床怀疑肺结核

文摘

背景。儿童结核病被underdetected大多数涂阴。这项工作旨在评估ESAT-6潜力和Ag85A合成肽的血清学诊断儿童结核病的临床怀疑。方法。这项研究涉及438名儿童:77克里奥尔语nonindigenous(13疑似结核病和64名健康的)和361年图土著儿童(39疑似结核病和322名健康儿童的)。的诊断信息的方法相比,使用操作特征和接受者操作特征(ROC)曲线。结果。Ag85A p - 29879敏感性(94.6% :土著儿童的0.651 - 0.819 95%可信区间)。ESAT-6 p - 12036和- 12037有100%和92.3%的敏感性( :0.929:0.846 0.975 95%可信区间,0.791:63.9到98.7分别为95% CI)克里奥尔语的孩子。ESAT-6肽还允许结核病和健康的儿童之间的分化。结论。进一步验证这种方法可能导致开发儿童结核病快速诊断的补充工具。

1。介绍

儿科结核病诊断的研究非常有限,尽管共识关于参考标准应该促进进一步的研究(1];开发新的儿童工具一直受限于缺乏共识关于病例定义为研究目的。世界卫生组织(世卫组织)估计,儿童结核病占全球每年6%到10%的结核病例;每年有超过74000名儿童死于结核病的国家有结核病率高和儿童约占一半,每年新发病例达一百万(1]。

而耐多药结核病(mdr - TB)的预防、管理和诊断提高特殊挑战国家结核病规划,往往只能在医疗转诊水平(2]。缺乏一个准确的诊断结核病测试孩子是另一个主要的挑战和潜在的增加了案例underdiagnosis和过度诊断(3]。使用临床诊断算法包括评分系统参数和研究成果;结核病诊断“金标准”包括临床检查、x射线、微观和培养的微生物测试,后者可能占用了8周;应该注意的是,10%到20%的结核分枝杆菌(Mtb)例不成功培养4]。不到10岁的儿童很难生产足够的痰为标准的显微镜测试,有低细菌数;孩子们因此没有被感染的主要来源(5]。

各种诊断技术已经开发和评估等改善儿童结核病诊断改善文化方法,核酸扩增,血清诊断(6,7]。综述了潜在Mtb抗原目标在一个荟萃分析,表明immunodiagnostic方法采用抗原组合(“鸡尾酒”)灵敏度高(8,9]。已经有新的兴趣发展基于抗体的诊断测试使用多个实现高敏感性和特异性抗原(10]。酶联免疫吸附试验(ELISA)结核病免疫诊断表明,儿童分枝杆菌抗原的体液反应低,尤其是当结合反应对抗原或特定抗体(Abs)不习惯(11]。

增长2.5%据报道2018年委内瑞拉有关结核病例(每100000名居民发病率33.2)土著居民(5.6%)是最受影响。委内瑞拉卫生服务报道,三角洲Amacuro利率最高的国家自1999年以来,即。,93.2 81/100,000居民。他们表示,90%的病例发生在图中原住民住在木屋提高踩着高跷奥里诺科河河沿岸的银行(δ的农村地区),成人结核病有很高的患病率(12]。结核发病率高(3190 / 100000)也报告了图中土著儿童(13]。敏感的血清学试验的阳性结果给一个可靠的可用于诊断活动性结核病诊断儿童拥有一个临床和流行病学怀疑肺结核在本土和克里奥尔语的孩子的数量,考虑到没有黄金标准的测试。这种方法将承认侵入性程序不能用于从原住民样本(14),图中人们无法获得一个大医院在三角洲地区的农村地区13,15]。

结核病流行的儿童不能结束没有进步有关的研究和开发;有一个迫切需要提高儿童结核病的诊断和治疗方案(3,5]。本研究评估结核分枝杆菌合成肽覆盖完整的血清诊断潜在ESAT-6 Ag85A抗原序列,针对孩子们快速诊断活动性结核病从两个目标人群使大多数患者被确认使用满意的成本效益比。

2。材料和方法

2.1。研究人群

这项研究涉及两个种群在不同的遗传背景;克里奥尔语nonindigenous孩子们“J.M.前瞻性招募德洛里奥斯”儿童医院在加拉加斯(委内瑞拉首都)和图土著儿童招募土著社区生活在一个偏远的农村地区在委内瑞拉的三角洲地区。

结核菌素皮肤试验(TST)根据国际和委内瑞拉结核病控制项目执行标准(16]。孩子有≥10毫米硬化被归类为积极的(17]。值得强调的是,结核菌素作为流行病学诊断测试;如果积极,它是有用当临床症状表明肺结核也存在。地区或三角洲国家结核控制规划诊断儿童在本土病例临床症状表明肺结核。这样的症状包括持续> 38°C发烧记录每日至少两周,咳嗽持续超过三周,减肥或未能茁壮成长,持续昏睡或减少嬉闹/活动报告的父母,和一个缺乏对广谱抗生素的临床反应。“博士。哈辛托Convit“生物医学研究所的结核病实验室诊断在加拉加斯nonindigenous病例。孩子们包括在这项研究中遇到之前报道的入选标准(13]。

2.2。伦理批准和同意参与

这项研究符合赫尔辛基宣言的原则。这是批准的生物医学Institute-Central委内瑞拉大学的研究伦理委员会(协议编号cdch ucv - 6256 8007/2011)。所有参与个人自愿签署知情同意表格。

2.3。临床和实验室诊断

痰液样本收集的土著和nonindigenous或克里奥尔语儿童咳痰;胃管采集标本的克里奥尔语6岁以下儿童。结核分枝杆菌痰样本染色为抗酸的细菌(Ziehl-Neelsen染料)。痰涂片经常不检测可染色的抗酸的杆菌,但他们可以从痰液分离培养标本,所以证实结核结核分枝杆菌被定义为孤立的文化(18]。孩子们的标准前后的和横向胸片(CXRs)被用于结核病确认。土著儿童x射线是由“路易斯Razzetti”医院的x射线在Tucupita服务,三角洲Amacuro的国有资本。克里奥尔语儿童“J.M. x射线研究德洛里奥斯”儿童医院在加拉加斯,委内瑞拉的首都。

标准前后的所有儿童和横向CXRs;一个独立的专家评估CXRs。缺乏细菌学的确认,诊断为结核病时只会让CXR显示病变的活动性肺结核和一个孩子有积极的临床和影像学反应抗结核治疗。健康的儿童没有临床症状的证据表明肺结核感染作为对照组。这些健康对照组包括未感染的个体,以及潜在的结核病患儿(但健康)。艾滋病毒在儿童患者排除和控制由CXR血液测试和主动肺结核。孩子不应该服用免疫抑制药物由于其对免疫反应的影响(即。、糖皮质激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺)。孩子满足入选标准是包括在他们的父母签署知情同意协议。结核病患者采样之前抗结核治疗。

2.4。血清诊断

合成肽ESAT-6和Ag85A全长序列合成的Fundacion研究院Inmunologia de哥伦比亚(FIDIC)在波哥大,哥伦比亚和用作单肽。表1显示五ESAT-6-peptides十七Ag85A肽。多个肽固相体系用于合成肽的基础上结核分枝杆菌ESAT-6和Ag85A氨基酸(aa)序列(19,20.]。

肽链型间接ELISA用于确定血清中免疫球蛋白反应对ESAT-6和Ag85A肽,如前所报道(21]。短暂,血清来源于孩子控制和患者的静脉血。ESAT-6 Ag85A合成肽或1μg /也被用作抗原外套96 - microtitre板块。进行间接ELISA检测和标准化的实验室测量Ab(免疫球蛋白)活性肽。标准化的血清样本稀释是1:200。孵化后血清一小时,盘子洗了四次,然后孵化与peroxidase-conjugated山羊反人类免疫球蛋白Ab (Promega公司(美国)。盘子被洗了四次,底物溶液组成的柠檬酸缓冲在pH值为5.0,30% H₂O₂,10毫克o-phenylenediamine盐酸盐(门诊部当Sigma-Aldrich)补充道。板块在室温下孵化了6分钟。ELISA酶标阅读器是用于测量颜色开发在492海里。

2.5。统计分析

接受者操作特征(ROC)曲线建立了比较方法的整体诊断信息。学生的 - - - - - -测试是用于比较组间平均年龄。确切概率法被用于比较的意义之间的百分比为个人证明由结核菌素阳性和/或阴性。考虑到分布,给出了数据均值或中位数及其对应的色散量(标准deviation-SD或四分位ranges-IQR)。的Mann-Whitney测试(非参数)是用于比较不同组之间关于同形像反应;生值修正与Bonferroni多重比较方法(22]。STATA14软件被用于这样的分析;意义被设定为≤0.05价值。

3所示。结果

这项研究涉及438名儿童年龄在1到15岁;196男性和242女性。这项研究涉及了77名克里奥尔语nonindigenous孩子从加拉加斯,委内瑞拉,16.9% ( )克里奥尔语的孩子(CPCh)怀疑有结核病患者和83.1% ( )克里奥尔语子控件(CCCh)。这组相比,361年图中本土土著社区的孩子生活在一个偏远的农村地区在委内瑞拉的三角洲地区三角洲地区:10.8% ( )图中孩子疑似结核病患者(WPCh)和89.2% ( )图子控件(WCCh)。

表2列出参与者的人口和临床资料。土著儿童有活动性肺结核的平均年龄为7.5 ( )和5.2 ( )克里奥尔语的孩子。意思是对照组年龄为8.6岁( )对于土著儿童和6.6 ( )克里奥尔语的孩子(表2)。没有统计上显著的差异在性别分布WPCh组(41%女性:16/39;男性58.9%:23/39)或CPCh组(46.1%女性:6/13男性;53.8%:7/13)(表2)。之间的统计上的显著差异被发现女性(195/322:60.5%)和男性(39.4%:127/322) )在WCCh对照组相比CCCh组(雌性25/64:39%;男性39/64:60.9%, )(表2)。

统计上显著差异WPCh (74.0%)、CPCh (45.5%)、( ),和WCCh组(20.1%)( )被发现对皮肤测试研究dth反应(表吗2)。确定克里奥尔语控制儿童反应皮肤试验是不可能的,因为他们的父母不同意他们正在测试。WPCh组织涂片的敏感性为3.7%,文化敏感性7.4%,同时细菌CPCh组(表中未检测到2)。一个统计上的显著差异被发现关于x射线之间的活性肺结核病变的特征暗示土著儿童(59.3%)和克里奥尔语nonindigenous儿童(100%), (表2)。图S1a(土著儿童)和图印地(nonindigenous或克里奥尔语的孩子)给病变活动性肺结核的影像学特征暗示。

关于对合成肽免疫球蛋白反应中值分布相比;图中病人儿童免疫球蛋白反应性明显高于对Ag85A p - 29879 ( )比本土控件( )( Bonferroni调整(图)1(一))。之间没有统计上的显著差异土著儿童患者( )和自主控制( )关于免疫球蛋白反应对Ag85A p - 29880 ( ,Bonferroni调整(图)1 (b))。

克里奥尔语儿童患者( )免疫球蛋白反应明显高于对ESAT-6比克里奥尔语控件(p - 12036 )( Bonferroni调整(图)2(一个))。有显著统计学差异克里奥尔语儿童患者( )和克里奥尔语控制( )关于免疫球蛋白反应对p - 12037 ( Bonferroni调整(图)2 (b))。

肽的诊断准确性纳入本研究评估;灵敏度的土著儿童范围从32.4% (p - 11003)至100% (p - 29880);尽管后者的高灵敏度,AUC是低: ;0.411至0.601,95%可信区间(数据没有显示)。其特异性降至20.8%,它有1.26阳性似然比和0.0 -似然比。阳性预测值为37.8和消极的预测价值100(表3)。

Ag85A p - 29879也有较高的敏感性(94.6%)和特异性(49.4%)(表3)和AUC: 。651 - 0.819 - 95% CI(图S2)。阳性似然比为1.87和消极的似然比0.11;阳性预测值为47.3和负面预测值95.0(表3)。第三个肽Ag85A p - 10997也有高灵敏度(94.6%,类似于p - 29879);然而,它有一个低AUC ( :0.436 - -0.626 95% CI)(数据没有显示)。其特异性降至16.9%。阳性似然比为1.14和消极的似然比0.32;阳性预测值为35.4和负面预测值86.7(表3)。

关于测试好的特异性的土著孩子,Ag85A p - 11003有97.4%的特异性(表3)和一个AUC 477 - 0.665 - 95% CI(图2)。阳性似然比为12.49和阴性似然比0.69。阳性预测值为85.7和负面预测值75.0(表3)。计- 6 p - 11004特异性(AUC了93.5% :0.675 - -0.838 95%可信区间)。阳性似然比为7.91和阴性似然比0.52。阳性预测值为79.2和负面预测值80.0(表3)。

克里奥尔语儿童集团的测试灵敏度范围从36.4% (p - 29881)至100% (p - 12036)。三antipeptide测试显示最好的性能特征对克里奥尔语儿童有活动性结核病。ESAT-6 p - 12036最高敏感性(100%)和特异性(74.6%)和AUC (表3和图S2)。阳性似然比为3.94和阴性似然比0.0。阳性预测值为44.8 100和消极的预测价值。ESAT-6 p - 12037也有较高的敏感性(92.3%)和特异性(55.6%)(表3)和AUC :0.593 - 0.812 - 95% CI)(数据没有显示)。阳性似然比为2.08和阴性似然比0.14。阳性预测值为30.0和负面预测值97.2(表3)。较低的敏感性(84.6%)和特异性(65.1%)被发现ESAT-6 p - 12035。阳性似然比为2.42和阴性似然比0.24。阳性预测值为33.3和负面预测值95.3(表3)。诊断性能数据为其他肽如表所示3和图S2。

4所示。讨论

尽管改善全球抗击结核病,约30%的患者诊断或少报;这样的场景更糟糕的是关于童年是由于特征如大部分的假阴性(杆状的负载较低的结果),无法咳出痰痰,因为几个常见疾病在儿童时期可以模仿结核临床表现。儿科临床分离细菌包含更少(paucibacillary),使文化和隔离更具挑战性。同时细菌培养被认为是黄金标准的结核病诊断成年人,其灵敏度低的孩子。这就是为什么结核病研究的一个战略目标处理改善诊断(1,3]。

适当的诊断活动性结核病是一个及时的基础疾病的治疗和控制,可以大大减少与儿科结核病相关的死亡率(3]。经典的细菌化验(培养基方法,锌染色、和RX发现)显示低灵敏度(表2),主要是在原住民的孩子。此外,这些技术有局限性,即。,scarcity of trained personnel that can interpret chest X-ray or the smear correctly; conventional culture methods can take up to eight weeks to obtain an isolate and determine its susceptibility to antibiotics [23,24]。

变量诊所表示和大多数症状复杂的非特异性自然儿童肺结核的诊断;此外,几个常见疾病在儿童时期可以模仿结核临床表现;症状,比如咳嗽、发烧、体重和穷人是常见的儿童(尤其是结核病在贫穷的社会经济环境下通常是地方性)和其他疾病引起的,如nonpulmonary结核病或nonpulmonary疾病(25]。

关于合成肽评估在这项研究中,一个令人满意的诊断性能的敏感性和特异性发现Ag85A p - 29879的原住民儿童,以及ESAT-6 p - 12036 p - 12037克里奥尔语的孩子,因此显示的潜在价值这三个多肽作为早期活动性结核病诊断工具(表3)。间接ELISA基于合成肽由于其低价格很有优势,容易标准化,实现结核病检测使用,主要是在地区访问诊断工具是有限的(26]。

高水平的Ag85复杂蛋白质在活动性结核病患者已报告。他们在免疫测定的检测已经被证明是非常具体,为什么使用它们在结核病筛查可以容易实现有优势,快速诊断,和低的价格27,28]。蛋白质肽来源于Ag85因此被用作诊断工具(26];这里,Ag85A p - 29879肽显示显著高免疫球蛋白反应性和高性能的特征(图1和表3)。然而,它是不可能建立一个明确该肽可以切断值允许分类从健康的儿童结核病。因此应调整协议,使用这个肽作为诊断工具在未来。

ESAT-6研究抗原,已经被证明是高度抗原并认可TB-ill人口的比例很高。这种行为已经被观察到在人类和动物容易分枝杆菌感染(29日- - - - - -31日]。先前的研究克里奥尔语的成年人已经表明ESAT-6肽p - 12033和- 12034可以提高其敏感性和特异性水平,原因可能是有用的诊断肺和肺外结核21]。在这项研究中,肽p - 12036 y p - 12037显示令人满意的手术同样的蛋白(表的性能3克里奥尔语),以及一个适当的分类不健康和健康的人口(图2)。几项研究已经表明,肽来自ESAT-6显示令人满意的肺结核感染诊断敏感性[32,33]同意我们的结果,强调了新的可能性为克里奥尔语儿童的结核病诊断和筛查。

抗原识别是一个关键的使用抗体和血清学测试的发展;结果表明,根据评估集团(土著或克里奥尔语),肽的诊断行为变化(表3,数据1和2)。免疫学研究图中人口已经证实Dw继承和种族隔离,即。,a class II human leukocyte antigen (HLA) including Dw 8.3, DW 16, and Dw22, defined only by homozygous typing of Warao-derived cells [34]。HLA类I和II级等位基因和单体型分布在委内瑞拉克里奥耳人表明,一个民族混合的亚洲,非洲,欧洲的基因创造了一种独特的HLA基因档案在这种混合克里奥尔语人口(35),这就可以解释合成肽的性能根据人口群体。

已经进行了很多尝试开发一种结核病血清学测试;然而,一个简单、廉价的即时测试仍然是不可用的。这样的测试必须区分活动性结核病健康个体(未感染+潜伏性结核),避免大的卡介苗(BCG)复合菌群疫苗或非结核分枝杆菌和执行持续在基因和免疫多样化的人口27,28]。

在目前的工作中,免疫球蛋白反应性差异对肽图之间的观察和克里奥尔语儿童患者。克里奥尔语的人群,结果显示高灵敏度和免疫球蛋白反应ESAT-6 p - 12036: 61 - 80 aa和p - 12037: 76 - 95 aa肽,而图中孩子病人表现出高灵敏度和免疫球蛋白反应Ag85A p - 29879: 23 - 43 aa和p - 29880: 204 - 223 aa肽(表3)。本研究的潜在限制控制不包括孩子有其他肺或nonpulmonary疾病不同的结核病。爆炸分析筛查与其他病原体从而进行预测的特异性肽显示最好的手术特点;对于那些匹配身份为100%,与76 - 82%分枝杆菌种类(主要是结核分枝杆菌)与ESAT-6和93 - 100%结核分枝杆菌Ag85A(数据未显示)。

本研究比较活跃的结核病例和健康的情况下(包括这组未感染+潜伏性结核),先前报道的研究比较这些团体(11,36]。然而,目前的研究缺少non-TB疾病控制和其他肺或nonpulmonary疾病患者,因此,这项研究并不能评估临床血清学测试的性能在不同的人群。额外的研究,包括更广泛的对照组(如上所述)可能是一个很好的策略来提高血清学测试的性能和提供进一步支持这项研究的结论。

尽管有前景的结果,还需要进一步的研究来确定如果血清学差异可能与内在的生物学特性,这里的少数民族进行了分析。此外,它被报道,Mtb抗原组合或最优multiantigen鸡尾酒因此应该覆盖抗体反应的异质性,从而保证尽可能高的测试灵敏度(37,38]。准确和及时的诊断结核病仍然是具有挑战性的,大多数研究都是在成人中进行的,所以这对儿科诊断结核病仍是一个目标达到。

这项研究的结果证实了体液免疫反应的变异性对Mtb开发时必须考虑血清学测试优化敏感性,特别是关于人口有不同的遗传背景。土著居民通常被报道有几个结核病患病率因素高于nonindigenous人39]。利益已被证明在发展中使用多个抗原免疫抗体诊断程序来实现高敏感性和特异性水平(40,41];与儿科结核病相关的发病率和死亡率可能因此成为大幅减少如果病例检出改善和预防治疗和治疗治疗更快速访问。

5。结论

总之,检测specific-IgG ESAT-6和Ag85A肽在病人的血清给一个可靠的活动性结核病诊断;这种方法的前景;然而,值得注意的是,这些结果是初步的,因为更多的包容和样本分析复合菌群患者有其他病症和合并感染非结核分枝杆菌(例如,m . kansasii,m . marinum,溃疡分枝杆菌,牛分枝杆菌),确认结论获得将允许建立这些肽是否可以用于诊断活动性肺结核和肺外结核,从而发展儿童结核病快速诊断的补充工具。

缩写

结核病:	肺结核
中华民国:	接受者操作特征
AUC:	曲线下的面积
置信区间:	置信区间
人:	世界卫生组织
耐多药结核病:	耐多药结核病
百慕大:	结核分枝杆菌
结核菌素:	结核菌素皮肤试验
ELISA:	酶联免疫吸附试验
免疫球蛋白:	免疫球蛋白G
OD:	光密度。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响工作报告。

确认

我们感谢德尔博士则,儿科研究生“J.M.的协调员德洛里奥斯”儿童医院在加拉加斯确认放射学评估。我们想感谢杰森·加里翻译手稿和哥伦比亚大学Nacional de部分假设开放获取的指控。这项工作是财务由委内瑞拉中央大学(CDCH / UCV没有。pg - 09 - 6256 8007/2011)。

补充材料

图S1:胸部x线检查对儿童的疑似肺结核。(一)图中土著孩子的x射线。纵隔的扩大,表明最先转移腺病可以观察到右边(箭头)和肺实质参与的形式右边两国间质模式优势。没有胸腔积液。(b)克里奥尔语的孩子的胸腔x射线。可以观察到纵膈腔扩大,暗示着门的腺病(箭头),和实质参与往往会形成一个巩固正确的肺肺泡模式基础(星号)。图S2: anti-Ag85和anti-ESAT-6肽测试ROC曲线。ROC分析评估Ag85A-derived合成肽(p - 29879和- 11003)区分本地患者自主控制。ROC分析评估ESAT-6-derived合成肽(p - 12036和- 12033)为克里奥尔语的区别来自克里奥尔语控制的患者。AUC:曲线下的面积; SE: standard error; 95% CI: 95% confidence interval.(补充材料)

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