文摘
最近,这两种癌症相关的成纤维细胞(保护)和自噬已被证明在肿瘤发展发挥重要作用,包括膀胱癌(BCa)。然而,真正的机制在很大程度上仍不清楚。在这里,我们重建模拟肿瘤微环境探索战乱国家之间的交互和BCa细胞株T24使用coculture系统。自噬在战乱国家被雷帕霉素诱导或抑制或阻止,分别。与战乱国家coculture之后,T24细胞增殖,入侵,有氧糖酵解进行测试在体外。雷帕霉素诱导,在战乱国家siAtg5抑制自噬。增强的自噬在战乱国家促进细胞增殖和入侵T24细胞体外,尽管autophagy-inhibited组和对照组之间无显著差异。乳酸浓度升高是rapamycin-treated和siAtg5-treated组与对照组相比。此外,MCT1的表达水平,MCT4, HK2 SLC2A1, MMP-9都增加autophagy-enhanced T24细胞组。我们的研究结果表明,战乱国家可以通过自噬调节BCa入侵和代谢表型,为我们提供新的替代治疗BCa的未来。
1。介绍
膀胱癌(BCa)是第六个最常见的恶性肿瘤在男性和第九两性都包括在世界范围内,9.0的年龄标准化发病率男性和2.2女性(每100000人/年)1]。它会导致一个巨大的经济负担,损害患者的生活质量,并威胁受害者的生存当它侵入肌肉。即使在那些non-muscle-invasive疾病,BCa病人在手术切除后遭受高复发率(2]。患者的遗传背景和环境因素导致膀胱致癌作用。事实上,吸烟和职业暴露在化学物质最著名的环境危险因素(3]。此外,最近的研究报告说,代谢综合征,含马兜铃酸中药,吡格列酮治疗与BCa(风险增加有关4- - - - - -6]。然而,尽管病因寻找和治疗策略的发展,真正的疾病机制和可行的预防措施,以及长期肿瘤结果,仍然有限。
肿瘤是一个复杂的结构包括多种细胞类型。癌症细胞周围的基质细胞,如内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、肿瘤微环境创建和维护。通过复杂的相互作用和反馈,肿瘤细胞与基质细胞相互作用,这能够促进或逆转癌症的自然发展。近年来,肿瘤微环境重新受到重视,癌症发病机制的一个关键决定因素,同样作为临床结果的重要因素。例如,可以激活成纤维细胞癌症细胞和转化成癌症相关的成纤维细胞(保护)7],旁分泌战乱国家和癌细胞之间的通信已被证明对癌症的持续增长是至关重要的质量(8]。先前的研究已经发现,战乱国家加速肿瘤的生长和转移通过氧化应激和有氧糖酵解(9]。氧化应激在战乱国家可以驱动肿瘤基质共同进化,有氧糖酵解产生的代谢物的战乱国家可以使用癌症细胞,促进能源生产(10,11]。我们先前的研究还发现,过度的monocarboxylate阴离子转运蛋白(MCT) 1和4,两个关键生物合成乳酸转运蛋白参与运输、在战乱国家可以调节BCa的恶化细胞(12]。因此,深入了解癌细胞相互作用的方式与战乱国家将提供一个新的见解肿瘤起始和发展。
自噬是一个主要的细胞内降解系统,艾滋病的营业额长寿蛋白质和受损的细胞器13]。在自噬过程中,蛋白质和/或细胞器被双层膜囊泡包裹称为自噬小体,最终融合蛋白降解的溶酶体隔间。因为它链接转换和是非组件的肿瘤微环境,自噬被认为是重要的癌症开始,发展,和对治疗的反应14]。自噬可以抑制肿瘤或肿瘤的促进。Ojha等人观察到自噬囊泡在BCa组织多在邻近良性膀胱组织,和更高水平的Beclin-1 Atg7肿瘤标本(15]。摩尼等人的具有化疗耐药性的所有证明BCa细胞系利用自噬逃避凋亡细胞死亡(16]。近年来,一些研究小组报道,自噬在战乱国家可能参与乳腺癌的发展。他们发现自噬战乱国家可以发挥cancer-supportive作用通过防止相邻癌细胞的死亡(10,17]。然而,自噬作用的信息知之甚少fibroblast-BCa细胞相互作用。这里,使用coculture系统,我们表明,成纤维细胞可以通过自噬调节BCa入侵和代谢表型,结果可能会提供新的替代治疗BCa的未来。
2。材料和方法
2.1。试剂
初级和二级抗体如下:一种蛋白激酶和磷酸化AKT (p-AKT) (Ser473)(细胞信号技术,波士顿,MA);Beclin-1、MCT1 MCT4、HK2 SLC2A1 (Abcam、剑桥、马);LC3-I /二世和Atg5 (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州);CD34(武汉博士德,中国);mTOR,磷酸化mTOR (p-mTOR) MMP-9 GAPDH和辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体(山羊anti-mouse免疫球蛋白合和山羊anti-rabbit免疫球蛋白合(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。
2.2。细胞培养
人类BCa细胞株T24和人包皮成纤维细胞(高频电炉)获得的细胞的细胞研究所中国科学院(中国上海)。所有细胞都维护在RPMI1640介质含10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco大岛,纽约)和1%的抗生素(HyClone,南洛根,UT)和培养在37°C公司5%2。
模拟肿瘤微环境中的BCa epithelial-stromal交互,T24细胞和高频电炉细胞被cocultured Transwell细胞培养系统(图1(一))。总之,高频电炉细胞被播种到参议院(孔隙大小0.4μ米)和cocultured T24细胞在下议院6-well Transwell盘子。48小时后,T24细胞使胰蛋白酶化获得进一步的实验。通过这个过程,我们先前已经表明,高频电炉细胞可以诱导是战乱国家12]。
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2.3。细胞增殖和入侵检测
使用CCK-8 T24细胞增殖测定(细胞计数Kit-8)化验。简单地说,细胞被播种在96 -孔板。文化隔夜后,介质在每个板取代新鲜培养基含有10% CCK-8试剂(Dojindo分子技术,中国上海)根据制造商的协议。然后,细胞培养2小时和评估标在450海里。
使用Transwell化验T24细胞入侵进行评估。简单,细胞被播种在参议院的60涂上μl基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,NJ)和无血清培养基稀释(1:50)。众议院中含有10%的边后卫。孵化后48小时,细胞被固定使用75%的乙醇,结晶紫染色使用0.5%。入侵细胞使用倒置显微镜观察,随机选择三个微观领域的人数统计。
2.4。核转染,RNA提取和定量实时聚合酶链反应(存在)
Atg5-targeted siRNA的顺序选择的三双siRNAs (GenePharma、上海、中国)由于其在减少Atg5表达效率高是3 - - - - - -CGACGACGTTCGGTTCCGCCGTC-5 。siRNA-mediated Atg5击倒了使用Lipofectamine 2000(美国卡尔斯巴德英杰公司)根据制造商的指示。简单地说,高频电炉细胞被播种在6-well盘子和培养过夜。稀释Lipofectamine 2000和siRNA喜忧参半室温20分钟然后被添加到盘子里。孵化后6小时37°C,媒介被刷新,紧随其后的是连续文化48或72小时。然后,转染细胞收获进行进一步的实验。
细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA),然后转化为互补使用RevertAid合成第一链cDNA工具包(生活技术,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。存在是由权力SYBR绿色PCR反应混合液(表达载体,卡尔斯巴德,CA) 7900年ABI ht实时PCR系统。所有的测试进行了一式三份,两套独立的实验,和β肌动蛋白是作为内部控制。列出的引物序列如下:Atg5-forward: 5 - - - - - -TTCTCAAAATATACTGTTTC-3 ,反向:5 - - - - - -TATTATGTATCACAAATGG-3 ;β-actin-forward: 5 - - - - - -ACCGAGCGCGGCTACAG-3 ,反向:5 - - - - - -CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3 。
2.5。乳酸测定
根据制造商的协议,EnzyChrom™乳酸测定工具包(eclc - 100)(生物测定系统,海沃德,CA)是用来确定乳酸浓度在细胞培养基。简单,标准曲线是基于一系列的乳酸与已知浓度的解决方案。细胞培养48小时,20μl媒体收集在565海里,用分光光度计测量。然后,结果归一化总细胞数。
2.6。免疫印迹
先前描述的过程(18]。总之,转染后72小时,T24细胞和高频电炉细胞蛋白提取使用CelLytic萃取设备补充和蛋白酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士)。总蛋白浓度测定用BCA蛋白测定试剂盒(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。等量的细胞溶解产物12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质被转移到一个Immobilon-P PVDF膜。然后,非特异性结合在室温下被5%的脱脂牛奶。膜然后孵化主要抗体在4°C一夜之间,其次是孵化与第二抗体室温1小时。信号被ECL +免疫印迹检测系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。
2.7。免疫荧光
一夜之间高频电炉细胞被播种在显微镜幻灯片和2.5%戊二醛固定了20分钟。在孵化后1% BSA和PBS Triton x - 100 0.25%,细胞被孵化与CD34抗体在4°C一夜之间,其次是孵化FITC green-conjugated二级抗体(武汉博士德,中国)在室温下1 h。核执行检测用DAPI costaining。荧光图像与激光共焦显微镜获得的。
2.8。统计分析
数据表示为 (SD)。组织与学生之间的区别 - - - - - -建立了测试和意义 。所有统计分析进行了使用占据12.0。
3所示。结果
3.1。在高频电炉细胞自噬诱导或抑制雷帕霉素或siAtg5,分别
我们表达下调的表达在高频电炉Atg5核细胞。如图1信使rna(图1 (b))和蛋白质含量(数字1 (c)和1 (d)使用siAtg5-3) Atg5明显减少;因此,我们选择进一步的实验。
我们使用雷帕霉素诱导和抑制细胞自噬在高频电炉siAtg5。如数据所示2(一个)和2 (b),Beclin-1和LC3-II /我水平都感应后增加了雷帕霉素,同时减少siAtg5后抑制。此外,一种蛋白激酶/ mTOR信号通路在调节自噬是一个重要的角色;因此,我们发现了一种蛋白激酶的表达,mTOR,高频电炉的磷酸化水平细胞。雷帕霉素,mTOR的抑制剂,抑制一种蛋白激酶的表达/ p-AKT / mTOR / p-mTOR,而siAtg5治疗没有明显影响的表达一种蛋白激酶/ mTOR和磷酸化水平。
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3.2。自噬在战乱国家影响T24细胞体外生长和入侵
我们之前已经证明coculture T24细胞可以激活高频电炉细胞到战乱国家(12)。在这项研究中,我们还注意到,T24细胞也可以激活雷帕霉素或siAth5-treated高频电炉战乱国家。此外,CD34,多样的祖细胞,这是一种常见的标志是表达下调实验组与对照组相比(图2 (c))。然后,我们进一步研究自噬在战乱国家是否影响T24细胞生长和肿瘤微环境的入侵。显示在图3(一个),rapamycin-treated战乱国家提升T24细胞生存能力与控制( ),而抑制自噬在战乱国家没有T24细胞增殖的影响。同样,自噬在战乱国家增强在T24细胞体外入侵的能力( ),尽管siAtg5-treated组和对照组之间无显著差异(数字3 (b)- - - - - -3 (e))。在BCa, MMP-9与肿瘤进展和入侵(有正相关19]。因此,我们发现MMP-9的表达水平和观察autophagy-induced组蛋白表达增加(数据4 (b)和4 (c))。
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3.3。自噬在战乱国家影响有氧糖酵解T24细胞体外
更好地了解自噬在战乱国家是否能调节BCa有氧糖酵解,我们发现乳酸水平因为乳酸是成品缺氧肿瘤细胞糖酵解的隔间。如图4(一),乳酸浓度升高rapamycin-treated和siAtg5-treated组与对照组相比 )。增强的自噬在战乱国家导致更高水平的T24细胞的葡萄糖的使用。此外,我们发现了几个关键的糖酵解参与葡萄糖代谢的基因,包括MCT1 MCT4 HK2, SLC2A1。正如所料,这四个基因的表达水平增加autophagy-enhanced组(数字4 (b)和4 (c))。
4所示。讨论
肿瘤是复杂的器官摹写,不仅包括肿瘤细胞基质细胞和基质成分(20.]。维持体内平衡的肿瘤微环境,彼此不同的细胞相互作用和细胞外基质的结构组件,提供肿瘤的架构。战乱国家在这个肿瘤微环境重要组成部分,发挥着核心作用在癌症细胞生长的调制。他们可以秘密的一些重要的可溶性因子,如转化生长因子β1 (TGF -β1),并创建一个良好的环境对肿瘤细胞生长和入侵21]。叶等人报道,更高的雌激素受体的表达α在成纤维细胞可能通过增强CCL1促进BCa入侵和il - 6信号在肿瘤微环境22]。此外,最近的研究发现,通过当地战乱国家可以创建一个营养丰富的微环境基质代线粒体的燃料,如乳酸、谷氨酰胺、和脂肪酸代谢支持癌症发展,HIF1 -α作为肿瘤促进剂在战乱国家代谢战乱国家和癌细胞之间的耦合23,24]。在目前的研究中,我们观察到自噬在战乱国家增强提升T24细胞体外增殖和入侵和影响细胞有氧糖酵解。MCT1和差别我们先前的研究还观察到对这些MCT4(乳酸运输两个关键基因)在CAF-suppressed T24细胞增殖,减少乳酸的浓度培养基(12]。乳酸的基石是一个精致的共生糖酵解和氧化肿瘤细胞相互调节获得能量代谢产物(25]。因此,这些观察结果进一步揭示战乱国家至关重要的监管机构的职能的机制在肿瘤环境,促进更深的理解癌症的代谢生态学。
癌细胞诱导“Warburg效应”在邻国间质成纤维细胞,成纤维细胞秘密乳酸和丙酮酸,这些被癌细胞对能源利用率(10]。这种能量相互促进肿瘤生长和入侵。此外,细胞生存也依赖于自噬。除了负责细胞器营业额,自噬也调节细胞代谢和被认为是一种肿瘤抑制,尤其是在肿瘤发生的早期阶段(26]。事实上,一系列基因的产品参与自噬被称为autophagy-related基因(atg)。依赖于复杂的由Beclin-1和pi3k,本地化trans-Golgi网络中,自噬体的分离膜完整的成核和组装的过程。此外,自噬小体的扩张和关闭需要两个ubiquitin-like共轭系统:LC3 Atg5-Atg12复杂。Atg4-dependent过程,LC3的c端甘氨酸残基暴露,这是受雇于Atg7和Atg3共轭磷脂酰乙醇胺LC3-I形成LC3-II [27]。Beclin-1、Atg4 Atg5, Atg7表示一个肿瘤抑制功能。mTOR也是一个主调节器的细胞新陈代谢。它调节细胞生长和增殖,以应对各种线索和在调节自噬也起着至关重要的作用。已经证明mTOR可以抑制自噬。(28]最近,自噬引起关注:不仅自噬癌细胞还自噬基质细胞已被证明在癌症研究中扮演着重要的角色。Capparelli等人报道,自噬在战乱国家支持乳腺癌生长和转移通过糖酵解和酮生产(29日]。缺氧、氧化应激、HIF1感应和NFκB激活肿瘤基质微环境至关重要的发现在这个过程中,自噬战乱国家促进肿瘤细胞存活(17]。通过雷帕霉素的管理,我们增强的自噬在战乱国家的增加Beclin-1和LC3的水平。此外,mTOR的抑制剂,我们发现雷帕霉素抑制mTOR的表达/ p-mTOR预期,以及一种蛋白激酶/ p-Akt表达式。雷帕霉素一种蛋白激酶/ p-AKT变化的影响在不同的细胞。例如,暴露于24小时内雷帕霉素可以抑制一种蛋白激酶的磷酸化曲泽细胞,但不是在海拉细胞30.]。我们推测细胞的异质性可能会导致不一致。coculture与T24细胞自噬战乱国家后,细胞增殖和入侵都增强,随着MCT1表达的增加,MCT4, HK2,和SLC2A1以及高浓度的乳酸在肿瘤微环境。抑制自噬在战乱国家并没有带来预期的结果:乳酸浓度在媒体上也siAtg5-treated组升高,尽管低于autophagy-induced集团glycolysis-related基因的表达没有明显增加。我们推测,其他因素可能参与autophagy-related肿瘤细胞和气孔细胞之间的相互作用。然而,所有这些结果仍然表明自噬在BCa战乱国家发展的促进作用。这个癌细胞代谢耦合关系和间质成纤维细胞可以提供我们一个小说但具有挑战性的未来治疗选择:有可能是通过目标组件在肿瘤微环境中,我们可以探索一种新的方法对肿瘤的发展。
我们还观察到增加表达MMP-9 autophagy-enhanced CAF-induced T24细胞。MMP-9属于基质金属蛋白酶家族是zinc-dependent与蛋白水解活性肽链内切酶对细胞外基质成分(31日]。高表达的MMP-9被发现在许多种类的癌症19,31日]。据报道,MMP-9可以调节肿瘤的生长,促进恶性肿瘤细胞入侵和与不良预后相关(32]。恶性肿瘤细胞过度生产MMP-9会破坏基底膜和IV型胶原蛋白,导致组织结构的破坏和功能(33]。因此,高表达的MMP-9通常意味着一个增强肿瘤入侵的能力。通过Transwell化验,我们发现自噬在战乱国家提升T24细胞入侵在体外。我们推测,MMP-9表达增加可能会一定程度上导致这些观察。然而,肿瘤浸润和转移是一个复杂的过程,涉及多个生理变化和因素。此外,我们只T24细胞用于本研究。显然,还需要进一步的研究更多的细胞系澄清战乱国家的深层机制调节BCa入侵和转移。
5。结论
总之,我们的研究发现,战乱国家T24细胞生长的影响,通过自噬入侵,和代谢表型。这项研究的结果表明自噬的战乱国家的一个重要的作用在调节BCa生物行为,提供了一个新的见解之间的复杂交互癌症细胞和间质细胞的肿瘤微环境。改变自噬在战乱国家可能是一个新的迷人的代谢肿瘤治疗的目标。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
作者的贡献
大海盾和Yu姚明贡献同样这项工作。
确认
我们感谢梨纹Bianji Edanz编辑(http://www.liwenbianji.cn/ac),编辑英语文本草案的手稿。本研究部分是由中国国家自然科学基金资助(批准号。国家自然科学基金委81502195,国家自然科学基金委81502195)。