文摘

肿瘤微环境(时差)已被证实能表现出监管影响胃癌的进展(GC)。然而,基质和免疫的相关功能组件(TME-associated基因)时间在很大程度上仍不清楚。TCGA的数据集,我们下载375 GC病例的临床资料,然后估计肿瘤浸润免疫细胞的百分比(抽搐)和免疫的水平和使用CIBERSORT和基质成分的估计人数。单变量分析被应用于研究差异表达基因。GC患者的临床信息之间的关联和特定基因的表达进行了分析的基础上,TCGA的数据集。Plexin的作用域包含2 (PLXDC2)表情抽搐。我们观察到PLXDC2表达式在GC标本与nontumor相比明显调节胃标本。upregulation与先进的临床阶段,预测更短的GC患者的总体生存。基因的高表达PLXDC2主要是富含immunity-associated事件。通过使用CIBERSORT,我们观察到PLXDC2表达式是树突细胞的比例休息,休息CD4记忆T细胞,嗜酸性粒细胞,肥大细胞休息,单核细胞,浆细胞,T细胞毛囊助手,M2巨噬细胞和树突状细胞激活。 Overall, our discoveries revealed that the expression of PLXDC2 was remarkable in GC, might be a possible biomarker for GC, and provided novel contents regarding immune infiltrates, offering novel insight for treatments of GC.

1。介绍

胃癌(GC)是2^nd最常见的原因与肿瘤有关道德和4^th在全球范围内最常见肿瘤(1,2]。的患病率和死亡率也明显高于发展中国家比在发达国家3]。尽管胃镜推动了此类疾病的减少通过允许GC的早期检测,大多数患者在后期确认和展览差预后结果(4,5]。传统,TNM阶段是用来标记预测患者的预后结果,最近,研究人员证明,只是标准不够充分估计预后结果(6,7]。因此,关键是探索分子与GC carcinogenetic过程相关的因果关系并确定诊断生物标记GC的早期诊断和靶向治疗。

肿瘤的发展被认为是一个复杂的过程,涉及各种noncell和细胞成分的肿瘤微环境(时间)8]。时间作为肿瘤发展中不可缺少的组件,其中包含nonmalignance细胞像骨骨髓来源的细胞,细胞外基质,内皮细胞和周皮细胞,肿瘤成纤维细胞,免疫细胞和炎症细胞(9,10]。时间响应的潜在功能抗血管新生治疗或化疗已经指出近年来(11]。成纤维细胞的激活、增殖和迁移作为一种积极的健康标本(监管机构在伤口愈合过程中12]。然而,肿瘤成纤维细胞表现出一个积极的影响肿瘤的生长和转移,表明其重要影响肿瘤恶化的调制。越来越多的证据表明,身上的主要成分(浸润间质细胞和免疫细胞)作为重要的球员在肿瘤进展13,14]。近年来,越来越多的checkpoint-blocking药物开发,和几个人被用于肿瘤治疗在临床实践中,如anti-PD-1 anti-PD-L1, anti-CTLA-4 [15- - - - - -17]。因此,小说immune-associated治疗靶点的识别对于免疫治疗的发展是必要的。

在这个研究中,我们的团队执行各种各样的生物信息学分析和识别多个基因参与免疫细胞和间质细胞的活性。按照上面的基因,我们确定了26预后的基因。重要的是,其中,我们专注于Plexin域包含2 (PLXDC2)是一个组件的肿瘤血管内皮标记(TEM)的家庭。我们提供证明PLXDC2可能是一个新颖的GC患者的预后结果的标志和GC的一种新的治疗目标。

2。材料和方法

2.1。病人和标本

配对样本(癌症和nontumor标本)9例GC患者获得暨南大学第一附属医院,2019年1月至2020年12月。所有这些都被立即冻结,然后储存在-80°C的rt - pcr检测。所有样品的组织病理学诊断,分别由两个病理诊断。知情同意是由所有的病人。所有的实验都是经伦理委员会批准的暨南大学第一附属医院。

2.2。细胞培养和转染

GC细胞系(MKN28 MKN45、BGC823 HGC27,和SGC7901)和GES-1从文化的集合类型获得中国科学院(中国上海)。细胞在DMEM培养Gibco 10%胎牛血清(Gibco、广州,广东省,中国)37°C公司5%₂控制。生成PLXDC2击倒GC细胞,PLXDC2的目标序列核(si-PLXDC2-1和si-PLXDC2-2)或小干扰rna (si-NC)炒不对应于任何人类序列被英杰公司合成。根据制造商的协议,转染是由应用Lipofectamine 2000转染试剂(表达载体,中国)。

2.3。数据收集

信使rna表达数据和临床信息提供的GC患者TCGA [18]。我们搜查了ImmPort数据中心(http://www.immport.org)是用来确定度,提供筛选基因的能力参与免疫过程。

2.4。度识别

磨边机包应用于屏幕GC-related度通过比较表达的基因在375年癌症和32 nontumor样本。度测定使用以下标准: , 。“GEPIA”是用于确认癌症标本之间的特异表达基因和肿瘤标本TCGA Genotype-Tissue表达式(GTEx)和数据集(19]。

2.5。基质值,计算免疫值,估算值

我们的团队利用估计算法计算的百分比免疫力和基质成分在时间对于每个标本,这被称为免疫价值和基质的价值。估计的值表示免疫价值和基质价值的总和。3类型的值与基质的比例有关,免疫力,和第一个一分之二的和积极的方式,分别。

2.6。的热图

度的温度仪由R语言包“pheatmap。”

2.7。功能富集分析

生物信息学手段测定的方法类似于调查方法提到的。与此同时,我们的团队利用字符串的工具来执行功能蛋白质关系网络(20.]。深入研究功能注释为度,我们使用去京都基因和基因组的百科全书(KEGG)富集分析。

2.8。生存和风险分析

“生存”包3.2 7 R软件用于单变量Cox回归分析TCGA的标本。基因通过单变量Cox测试给出的说明。PLXDC2表达式被分为高PLXDC2低PLXDC2组按照媒介表达分数。用来探索可能的kaplan - meier化验高低PLXDC2表达组之间的差别。PLXDC2的临床特点,探讨了在比较与PLXDC2表达式使用Wilcoxon rank-sum测试。

2.9。抽搐概要

CIBERSORT方法进行检查抽搐丰富档案在癌症标本质量过滤375癌症标本 进行了进一步筛选试验(21]。

2.10。RNA提取和定量实时PCR

试剂盒试剂(表达载体,中国)应用于提取总RNA。RNA浓度与NanoDrop nd - 2000分光光度计检查(技术)。实时定量PCR (qPCR)是由SYBR绿色定量PCR试剂盒的应用(豆类,杭州,浙江,中国)使用7500实时PCR系统。结果规范化GAPDH的表达。引物如下:GAPDH 5 - - - - - -ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3 ,反向5 - - - - - -GCCATCACGCCACAGTTTC-3PLXDC2意义上,5 - - - - - -CCAGTTTCAGTTCGCCGATG-3 ,反向5 - - - - - -TGTCTACCGCCTTGAGAAAGT-3 。使用2中存在的数据进行了分析和计算^−ΔΔCt方法。

2.11。CCK-8化验

CCK-8 (Dojindo、浦东、中国)申请细胞增殖。在96孔板,细胞被播种密度 细胞。文化为0后,24、48和72 h, 15μl CCK-8试剂添加到每个好,其次是孵化一两个小时。一盘读者应用于检查在450纳米光密度值。

2.12。统计分析

3.6.3 R软件应用统计分析。Wilcoxon rank-sum测试或克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用来执行对比不同组。应用kaplan - meier化验进行生存分析。单变量分析被用来演示的独立因素。分数< 0.05对统计意义。

3所示。结果

3.1。分数与GC患者的生存

估计算法采用评估TCGA-STAD患者免疫力和基质成分的百分比。我们的团队分离GC患者高——和低分集团按照中等分数免疫力价值,基质值,估算值。此外,kaplan meier分析是用来确定部分免疫的关系和基质成分与生存的可能性。如提供的图1(一),ImmuneScore表现出与GC病人的操作系统比没有显著的关系。然而,StromalScore积极表现出的百分比与GC的操作系统比病人(图1 (b))。ESTIMATEScore没有显示不同的GC与总生存期患者(图1 (c))。

3.2。协会的免疫力与Clinicopathology价值和基质价值因素的GC病例

为了确定免疫和基质成分的百分比之间的关系与clinicopathology特性,我们小组研究了TCGA GC患者的有关临床资料。如提供的图2(一个)免疫值负展出一个协会诊所阶段和T TMN阶段的分类;与临床阶段和T StromalScore显示一个积极的关系分类的TMN阶段(图2 (b)),ESTIMATEScore显著下降伴随着诊所阶段和T TMN阶段(图的分类2 (c))。

3.3。度较小的免疫力之间的价值,基质价值和更大的免疫力价值,基质的价值

在GC屏幕特异表达的基因,基因的水平低和高分样本进行了研究。如图3(一个),总共1746度从基质中获得价值(标本的价值与小值)。同样,从免疫获得的1169度值(图3 (b))。十字路口化验的结果表现出640过表达基因共享的价值在免疫力价值和基质和120个表达下调基因共享价值小值(数据3 (c)和3 (d))。结果去化验表明,浓缩度几乎匹配immunity-associated条款,如白细胞增殖活动,淋巴细胞增殖,单核细胞增殖活动,调制leukomonocyte刺激,刺激T细胞(图3 (e))。KEGG浓缩试验也显示浓缩病毒蛋白相互作用的细胞因子和细胞因子受体,nf -κB信号路径,cytokine-cytokine受体相互作用,趋化因子信号通路,和钙信号路径(图3 (f))。此外,单变量COX回归分析GC的生存患者完成识别在760度的重要因素,我们发现26预后基因包括证明OMD ABCA6, RGS1, MEOX2, MCEMP1, ZEB2, ABCA9, SVEP1, PLXDC2, VGLL3, ASPA,宽带,GGT5, FMO1, CCDC80, FLRT2, ABCA8, CDO1, CFH, BPI, COLEC12, CD36, FGF7、FAM216B, OGN,趋化因子受体CXCR4(图4)。

3.4。的表达和临床重要性PLXDC2在GC的病人

在26日预后的基因,我们专注于PLXDC2。与PLXDC2表达式相比,健康个体的PLXDC2表达式非常弱在GC患者相比基于TCGA GTEx数据集(图5(一个))。但是,并没有明显的区别PLXDC2表达和肿瘤标本只是基于TGCA数据集(数据5 (b)和5 (c))。此外,生存分析显示,患者以惊人的PLXDC2表示预测的劣质OS GC病人(图5 (d), )。此外,我们观察到的表达PLXDC2时间呈正相关,GC患者的预后结果,特别是在阶段和T分类(数字5 (e)- - - - - -5 (h))。

3.5。PLXDC2可能是一个潜在的标志“监管

相比PLXDC2的中等水平,GESA PLXDC2的高、低表达组实施。如提供的图6PLXDC2基因的高表达组主要聚集在immunity-associated事件,如基底细胞癌,钙信号通路、细胞粘附分子凸轮,扩张型心肌病、受体相互作用,黄斑adherens,刺猬信号路径,肥厚性心肌病,肌动蛋白细胞骨架的调制,血管平滑肌收缩。它显示PLXDC2可能是一个潜在的标记的时间条件。

3.6。协会PLXDC2抽搐的百分比

协会的目的是确认PLXDC2表达式与免疫微环境状态,肿瘤浸润免疫子集的比例通过CIBERSORT算术化验,和21类型建立了GC标本的免疫细胞的概要文件(数据7(一)和7 (b))。结果表明,CD4记忆T细胞休息,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞平方米,肥大细胞休息,单核细胞和树突细胞高表达组PLXDC2休息非常大与低表达组PLXDC2;毛囊辅助T细胞,浆细胞和树突状细胞刺激PLXDC2非常低的高表达组与低表达组PLXDC2(图8(一个))。此外,还有非凡的PLXDC2表达之间的联系和CD4记忆T细胞的百分比休息,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞平方米,肥大细胞休息,单核细胞,树突状细胞休息,浆细胞、毛囊辅助T细胞,树突状细胞激活(图8 (b))。图8 (c)多样性和协会的分析结果显示十字路口,公布,8种抽搐PLXDC2表达显著相关。

3.7。PLXDC2在GC的致癌作用

展示的水平PLXDC2在GC患者中,我们收集执行rt - pcr,发现PLXDC2表达明显增加GC标本与匹配nontumor标本(图9(一个))。我们也观察到,PLXDC2表情明显调节在5 GC细胞系而GES-1(图9 (b))。此外,在GC进展研究PLXDC2的函数,我们沉默PLXDC2表达式,证明了rt - pcr(图9 (c))。此外,CCK-8化验显示,击倒的PLXDC2抑制BGC823和MKN45细胞的增殖(图9 (d))。

4所示。讨论

GC是人类最常见的和侵略性的全球恶性肿瘤(22]。虽然有进步在外科手术和辅助放化疗治疗,5年的操作系统比[GC与癌症患者提高显著发展23,24]。时间是关键的致癌作用的发生和发展25]。很有利的促进调查潜在的治疗目标的重建时间和促进的转换时间。大量的研究强调免疫微环境状态的意义在致癌作用(26,27]。结果本文从转录组分析百分比TCGA GC信息显示,免疫成分的时间促进患者的预后结果(28,29日]。我们强调了意义的证据调查瘤细胞和免疫细胞之间的相互作用,为设计提供了小说启蒙运动更有效的治疗策略。根据上述猜测,我们的研究小组发现,一个了不起的基质值可能是一个潜在的标志一个劣质GC患者预后结果。

为了理解基因的精确变化在时间关于免疫和间质成分,高收入和低分标本之间的对比分析。我们确认640调节基因共享大分数ImmunityScore和StromaScore基因差别和120年对这些共享一个小的分数。然后,我们去化验,发现浓缩度执行几乎匹配immunity-associated条款,如白细胞增殖活动,淋巴细胞增殖,单核细胞增殖活动,调制leukomonocyte刺激,T细胞刺激。此外,KEGG化验也显示细胞因子受体的浓缩,nf -κB信号传输、细胞factor-cell因子受体相互作用,钙信号传输。我们的发现表明度的一般角色似乎匹配immunity-associated事件,这表明免疫因素的参与时间在GC的主要特征。

近年来,越来越多的被报道的几种基因与临床结果和进展的GC患者(30.,31日]。例如,TGFβ2免疫细胞功能的一个重要监管机构报告GC中高度表达的标本和预测短GC患者的总生存期(32]。林等人表明CXCL8表达明显调节在GC和GC表示临床疗效不佳的患者。大比例的CXCL8 CD8 + T细胞渗透性的降低有关活动和Ki67 + CD8 + T细胞比例。M2 macrophage-secreted CHI3L1促进GC的转移活动展示了细胞在体外和体内与IL-13R通过交互α2 (33]。这些发现强调了潜在的免疫相关基因利用小说对GC病人诊断和预后标记。在这项研究中,单变量COX回归分析GC的生存患者完成识别在760度的重要因素,我们发现26预后的基因,包括证明OMD ABCA6, RGS1, MEOX2, MCEMP1, ZEB2, ABCA9, SVEP1, PLXDC2, VGLL3, ASPA,宽带,GGT5, FMO1, CCDC80, FLRT2, ABCA8, CDO1, CFH, BPI, COLEC12, CD36, FGF7、FAM216B, OGN,趋化因子受体CXCR4。我们分析上述基因,发现他们中的许多研究在许多肿瘤,包括GC [34- - - - - -37]。此外,他们的表情并没有显示出不同的GC标本之间的失调和nontumor标本TCGA基于数据集。然而,我们发现PLXDC2的特定基因。TGCA数据集的基础上,我们发现其表达在GC标本并不不同于正常胃标本。TCGA但是,当我们分析了样本数据集+ Genotype-Tissue表达式(GTEx)数据库,GC标本的观察不同的PLXDC2 upregulation与nontumor标本相比,还演示了在我们的队列。功能分析表明,击倒PLXDC2抑制GC的增殖细胞。此外,在GC PLXDC2很少报道的影响。临床化验证实,高PLXDC2表达式与短的幸存者,后期临床,T阶段。GSEA结果表明immunity-associated信号路径,如基底细胞癌,钙信号通路、细胞粘附分子凸轮,扩张型心肌病、受体相互作用,黄斑adherens,刺猬信号路径,肥厚性心肌病,调制的肌动蛋白细胞骨架,和血管平滑肌收缩,明显聚集在PLXDC2高表达组。这些结果表明PLXDC2可能参与的状态转换时间从免疫代谢优势主导地位。

最近,免疫抑制剂检查站(ICI)已成为发展最快的一个免疫治疗方法的GC [38,39]。这里能够封锁cancer-triggered免疫抑制,因此加强抗癌免疫反应(40]。Immunocheckpoints抑制癌症免疫受体,位于刺激T细胞表面的(41]。immunocheckpoint后结合肿瘤表面抗原,它能够抑制癌症免疫反应,促进immunoescape [42,43]。在这项研究中,我们发现,T细胞CD4记忆休息,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞平方米,肥大细胞休息,单核细胞和树突细胞高表达组PLXDC2休息是非常大与低表达组PLXDC2;毛囊辅助T细胞,浆细胞和树突状细胞刺激的高表达组PLXDC2相比非常低的低表达组PLXDC2。这些结果表明immunoactivity PLXDC2表达的时间的影响。

5。结论

我们的团队发现了TME-associated基因GC TCGA通过估计算法在数据库。PLXDC2表达明显增加GC和GC的患者可能是一个可能的生物标志物。之间存在显著的关联PLXDC2表达和CD4记忆T细胞的百分比休息,嗜酸性粒细胞、巨噬细胞平方米,肥大细胞休息,单核细胞,树突状细胞休息,浆细胞、毛囊辅助T细胞和树突状细胞激活。此处签名可能表明PLXDC2是GC的预后结果的潜在生物标志物患者和免疫相关的渗透。

缩写

ImmPort:	免疫学门户数据库和分析
罗斯福:	错误发现率
舰队指挥官:	褶皱变化
操作系统:	总生存期
IL-13Rα2:	Interleukin-13受体α2链
这里:	免疫抑制剂检查站。

数据可用性

使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

伦理批准并不是必要的。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Yang Li Hai-ping江,鑫李设计的研究。杨莉和李Jia-qi进行研究。李阳分析数据。杨莉和鑫李写道。所有作者都阅读和批准了手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金委/ RGC联合研究项目(N_HKU735/18号和81861168033)。