文摘

对象。卵巢癌是女性最常见的癌症之一,高死亡率,由于大多数病人诊断在疾病的晚期。寻求新的卵巢癌生物标记物检测和进展迹象的病人是非常重要的。方法。OVCAR3和共同细胞系A2780是两个用于卵巢癌的研究。不同的入侵和迁移能力被划痕测试和transwell实验观察到在我们的初步研究。使用基因芯片筛选基因表达在这两个不同的细胞系,然后,差异表达基因(至少2倍的差异,使用KEGG值< 0.05)进行了分析。结果。纤连蛋白1 (FN1)被发现是最强烈的入侵和迁移能力与OVCAR3细胞。实时PCR和FN1淘汰赛细胞系进行,证实了这一发现。基于Oncomine数据库分析,与正常人相比,卵巢癌患者表现出高水平的FN1表达式。此外,高FN1表达式被发现在更高的菲戈阶段的癌症患者。结论。FN1可能是卵巢癌的新生物标志物检测和进度。

1。介绍

卵巢癌是全世界女性癌症相关死亡的第五大原因;不幸的是,早期检测测试是相对缺乏。此外,大多数女性卵巢癌诊断在疾病的晚期,这预示着预后不良(1,2]。现有的监控策略,通过阴道超声波或血清肿瘤标志物癌抗原125 (CA125)测试,是无效的在早期阶段检测卵巢癌(3,4]。因此,卵巢癌的早期发现和诊断有非常重要的作用在卵巢上皮癌患者的生存与预后。

纤连蛋白(FN)是一种高分子量糖蛋白介导多种细胞外基质的细胞与细胞外基质(ECM)的相互作用,扮演重要的角色在细胞粘附、迁移、生长和分化(5,6]。FN1 FN家族的一员,在各种不同的功能生物过程包括细胞粘附、细胞迁移、细胞骨架组织在许多不同的疾病(7]。在各种肿瘤,如鼻咽癌、骨肉瘤,食道癌,卵巢癌,FN1是一个重要的肿瘤基因(8- - - - - -11]。

目前,该细胞系A2780和OVCAR3常用在卵巢癌的许多不同的研究(12,13),但没有考试之间的区别这两个细胞系已报告。在我们的研究中,更大的迁移和入侵能力被发现在OVCAR3细胞相比A2780细胞。因此,我们想看看好的候选蛋白可以作为卵巢癌的诊断标记基于这些现象。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

A2780、Caov3 SKOV3细胞(CoBioer,中国)孵化RPMI 1640年补充10%胎牛血清(美国Gibco)。OVCAR3细胞(CoBioer,中国)在含有RPMI 1640培养基中培养,10%胎牛血清,1%的胰岛素(σ,中国)。

2.2。细胞划痕试验

细胞被播种到six-well盘子,当密度达到100%,是通过细胞。照片拍摄在72年48 h, h,或96 h后刮用倒置的组织培养显微镜(尼康ECLIPSE Ti-U)×4放大。

2.3。Transwell迁移分析

两人卵巢癌细胞系。A2780和OVCAR3 ( 细胞/),被播种与8 transwell插入(聚碳酸酯过滤器μm毛孔,Costor)充满介质。中等(600μl)添加到室底部。48 h后37°C下湿润5%的文化有限公司₂在空气中,参议院内的细胞仍然是轻轻地用棉球,完全删除。的细胞迁移到较低的过滤膜表面与无水甲醇和固定染色结晶紫为0.1%。过滤器被风干,用倒置相差显微镜照片收集(尼康ECLIPSE Ti-U)。收集照片后,膜是用500年μl 50%的醋酸水溶液约5分钟,100年μl的洗脱液添加到一个干净的96孔板,和OD值以595海里使用ELISA读者(协同2,中国)。

2.4。微阵列分析核酸

微阵列分析核酸进行使用Affymetrix®人类基因组U219数组条纹(美国Affymetrix)根据制造商的指示。过程包括基因组DNA提取fromA2780或OVCAR3,消化和结扎,PCR扩增,PCR产物纯化、量化和分裂,标签,阵列杂交、清洗和扫描。基因表达分析使用Affymetrix®转录组分析控制台(TCA)软件,评估不同的基因的表达。基因和基因组的京都百科全书(KEGG)也用于后续相关途径分析。

2.5。实时荧光定量聚合酶链反应

从每个示例使用RNA分离试剂盒试剂(美国Ambion)根据制造商的指示。从总RNA合成第一链cDNA使用益生元(dT)引物从FastQuant RT工具包。实时PCR进行stratagene MX3005P。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。SYBR绿色PCR反应混合液用于PCR试剂盒,和相对基因表达测定周期(Ct)的阈值为基础的目标基因和基因内部参考。GAPDH基因的平均Ct值减去平均Ct值的每个目标基因。褶皱变化(2^{- - - - - -ΔΔCt})的表达式计算感兴趣的基因相对于内部控制基因(GAPDH)为每个分析癌症细胞系。用于pcr引物序列如下:FN1意义:5 - - - - - -GTTCGGGAGGAGGTTGTTACC-3和反义:5 - - - - - -GAGTCATCTGTAGGCTGGTTTAGG-3和GAPDH:意义:5 - - - - - -CCTCCAAGGAGTAAGACCCC-3和反义:5 - - - - - -AGGGGTCTACATGGCAACTG-3 。每个样本一式三份。

2.6。FN1 KO细胞结构

293 t细胞被播种在盘子里,然后,细胞培养时,融合程度高达80%。Lenti-CRISPR-V2-sgRNA-FN1或lenti-CRISPR-V2 psPAX2, pMD2。G混合成1毫升Opti-MEM介质下的比率4:3:1,然后在室温下孵化为5分钟。30μl贝聿铭被添加到混合,然后,混合物在室温下孕育了30分钟。孵化后,混合物被添加到293 t细胞和孵化37°C 6 h公司为5%₂。48小时后,细胞培养基改为低血清培养基(4%的边后卫)和病毒包装上层清液收集和储存在-80°C。

OVCAR3细胞培养病毒转染前24小时,然后,病毒包装上层清液的最终浓度10μg / ml聚凝胺混合完全培养基下1:1的比例进行OCVAR3细胞。36小时后连续文化,0.2μ克/毫升加入一定量嘌呤霉素媒介FN1 KO细胞筛选。

2.7。西方墨点法

细胞被洗在PBS和细胞溶解SDS加载缓冲区(凯基生物生物技术,KGP101)和SDS - page凝胶。从细胞中提取的蛋白质转移到PVDF膜(微孔,ISEQ00010)。膜被封锁的5% tbst牛奶(0.1%)和孵化鼠标anti-FN1抗体(BF0273亲和力,1:1000)和鼠标anti-beta-tubulin抗体(T0023亲和力,1:2000)在4°C。二次抗体(亲和力,S0002, 1: 1000)是孵化与膜在室温下1 h。

2.8。ELISA

实验是由手稿协议(六合,LH-E10073HU)。

2.9。统计分析

使用SPSS软件进行统计分析。结果表示为 或者是 。双尾未配对的学生的 - - - - - -测试是用来确定统计学意义, 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。检测不同的迁移和入侵的能力

确定的迁移和入侵能力的差异这两个卵巢癌细胞株,划痕和transwell实验进行。细胞被播种在6-well盘子,和迁移能力测量在0 h, 48 h, 72 h和96 h。与那些A2780组相比,划痕的直径变得狭窄OVCAR3组(图1(一))。这种差异表明,OVCAR3细胞表现出比A2780细胞迁移能力更强。transwell的入侵能力测定实验,和入侵细胞的数量记在48小时后细胞被播种。结果显示,数量更大的侵入性细胞中观察到OVCAR3组(图1 (b))。这一结论也证实了595 nm OD阅读结果后入侵细胞溶解在50%醋酸水溶液(图1 (c))。基于这些结果,OVCAR3细胞的迁移和入侵能力远远大于A2780的细胞。

3.2。确定不同的mRNA表达

以确定差异的原因这两个细胞系,基因芯片进行了分析与OVCAR3 A2780细胞。许多差异表达基因被发现在这两个卵巢癌细胞系(数字2(一个)和2 (b)基于分析结果和火山的地图分层聚类的结果。此外,这两个细胞系的基因表达分析的以下四个不同的基因本体论(去)方面:分子功能,生物过程,细胞组件和蛋白质(图2 (c),继续)。结果表明,这两种类型的细胞,即。,A2780 and OVCAR3, exhibited significant differences both in gene expression and cellular biology.

3.3。潜在的候选蛋白分析

识别不同的蛋白质,细胞通路分析使用基因和基因组的京都百科全书(KEGG)。两者之间的差异表达基因的细胞系展示在表1。最大的路径数量的差异是粘着斑的途径。此外,一些候选基因( 和 )(即在焦adhesion-related基因。,CCND2, ITGB8, and FN1) were selected for further analysis (Figure3(一个))。统计分析显示,这三个基因的表达FN1表达式是最显著的差异(图3 (b))。确认结果数组,实时PCR用于验证OVCAR3 FN1表达之间的差异和A2780细胞。结果显示,OVCAR3细胞并表达上级FN1比A2780细胞(图3 (c)),这证明FN1扮演着一个重要的角色在细胞迁移和高水平的FN1表达式表明肿瘤细胞迁移率高。

为了进一步确认结果,FN1 KO细胞系被CRISPR构造。比较四种不同的卵巢癌细胞、高FN1表达式被发现在OVCAR3 mRNA水平(图4(一)(图),蛋白质水平4 (b)(图),细胞培养基水平4 (c))。所以OVCAR3 FN1 KO细胞系(V2-sgRNA-FN1)进行,在mRNA水平(图确认4 (d)(图)和蛋白质水平4 (e))。

迁移和入侵能力的差异在野生型组,对照组(空向量V2), transwell KO组进行检测实验。细胞被播种在6-well盘子,和迁移能力测量在48 h。与野生型组和对照组相比,显著减少侵入性细胞的数量在KO组(观察数据4 (f)和4 (g))。基于这些结果,FN1应该是一个非常重要的蛋白质对卵巢癌细胞的迁移和入侵的能力。

3.4。FN1临床可行性评估

临床样本用于FN1可行性评估。根据上述结果,更强的入侵和迁移能力与大FN1表达式。这种关系表明FN1表达式可以作为一个很好的指示器疾病进展。

研究这种可能性,FN1表达水平的临床发现卵巢癌患者使用Oncomine数据库和设置条件 和褶皱的变化> 3 < 3。这一分析显示,不同病理类型的卵巢组织表现出不同的FN1表达水平;卵巢粘液腺癌(图5(一个)),卵巢透明细胞腺癌(图5 (b)),卵巢endometrioid腺癌(图5 (c)),卵巢浆液腺癌(图5 (d))表现出FN1表达水平高于正常样本。FN1表达水平的病人在不同的菲戈阶段也进行了分析。结果显示,FN1 III期的表达水平显著高于低菲戈阶段(阶段I和II)。这一结果表明,FN1表达式是正相关的,菲戈阶段,即。,大FN1表达式与菲戈更高阶段。

综上所述,我们的研究结果表明,FN1可以作为一个积极的标志卵巢癌检测,也可以应用进展不佳患者的一项指标。

4所示。讨论

卵巢上皮癌(转换端)是女性最常见的癌症之一,女性癌症死亡的第五大原因在美国2015年21290例新病例和14180例死亡(14]。不幸的是,由于缺乏早期诊断标记和技术技能,大多数病人诊断在疾病的晚期,这是与一个非常贫困的存活率和高水平的转移(15- - - - - -17]。在我们的论文中,我们比较了两种不同的卵巢癌细胞系和不同的迁移和入侵的能力和发现新的蛋白质标记,FN1,这似乎是一个强有力的候选人积极的诊断卵巢癌的标志。FN1可以考虑应用作为卵巢癌进展或转移的指标。

OVCAR3和A2780卵巢癌细胞系中最常用的研究(18- - - - - -21]。在我们的实验室中,我们发现,这两种不同的细胞系表现出强烈不同的细胞迁移和入侵的能力。Transwell和划痕实验证实这些差异。结果显示,OVCAR3细胞系表现出入侵和迁移能力明显强于A2780细胞系。要理解这两个细胞系的不同能力,基因芯片是用于分析基因表达的差异。都是差异表达如果他们满足条件的褶皱变化大于或小于2值< 0.05。缩小的差异表达基因,更严格的条件申请基因筛查。在应用这些严格的条件(细胞粘附相关, ,和褶皱的变化大于100小于-100),只有三个基因(即。、CCND2 ITGB8, FN1)被发现。ITGB8 CCND2的表情后,和FN1基因在基因芯片进行统计分析,与入侵最强烈相关的基因被发现FN1和迁移能力。接下来,实时PCR实验被用来确认OVCAR3细胞并表现出更高水平的比A2780 FN1表达细胞,这表现出较弱的入侵能力高于OVCAR3细胞。和FN1 KO细胞株用于进一步确认。

FN1是许多细胞外基质的核心组件,它调节多种细胞活动通过与细胞表面整合素受体的直接交互。FN1被许多附着细胞合成,然后组装成纤维性颤动网络(2]。此外,FN1表达式已经证明与各种迁移过程密切相关,包括伤口愈合、胚胎发生和转移的肿瘤细胞(22]。据报道,FN1的额外的域可能是血管的标志肝脏和肺转移。陈等人发现FN1和TGM2可以促进A431肿瘤细胞的迁移过程23]。另一份报告也表明,FN1可以显著调节神经胶质瘤细胞的进展保持整合素β1 FN受体在神经胶质瘤细胞24]。此外,因特网等人和Kujawa等人也发现纤连蛋白是一个重要的预后因子在卵巢癌和可能是肿瘤恶化的核心25,26]。基于这些结果,我们相信FN1可能参与卵巢癌的发展和可能的主要原因的迁移和入侵能力的差异这两个细胞系。实际上,据报道,FN1可以预防卵巢癌细胞的细胞凋亡引起的治疗药物。建议FN1可以作为标志来指示在卵巢癌肿瘤恶化。证实了这一假说的临床样本。

在我们的研究中,在线数据库分析(Oncomine) (10)是用来检查患者中的表达水平,和卵巢癌患者发现FN1表达水平高于正常人。此外,有一个显著增加FN1表达相比,III期癌症菲戈较低阶段的癌症(阶段I和II)。大FN1表达式与菲戈更高阶段。这两个结果显示FN1应该为卵巢癌患者是一个很好的标志。

总之,基于体外实验结果和在线数据库的结果分析,我们认为,FN1卵巢癌检测可以作为一个标记,也可以用作一个进度指标对卵巢癌患者。

数据可用性

所有的数据已经被提出了。

的利益冲突

作者没有任何利益冲突。

确认

这项工作是支持的科研项目天津市教育委员会(2018 kj077)。