文摘
背景。老化是一个重要的癌症的危险因素。然而,体内基因(ARGs)没有全面分析膀胱癌(BC)。因此,这项研究的目的是由此衍生BC患者的危险分层系统基于参数。方法。公共数据库被用来获取参数集,转录组文件,和临床数据。“limma”包被用来屏幕微分参数同时使用单变量Cox回归分析探讨预后参数。“ConsensusClusterPlus”包是用于执行老化模式在公元前患者基于上述预后参数。随后,老化模式在生存调查预测,突变,免疫疗法、免疫检查点,和免疫微环境。我们同样利用基因富集分析来探索结果背后的生物功能。构建一个签名和预后预测nonogram风险,我们使用套索和Cox回归分析基于微分基因在老化模式。此外,我们绘制一个列线图和验证的准确性TCGA签名在地理和军团的风险。我们探讨了可能的生物学机制使用GSEA分析,初步确定了基因使用PPI网络中心。最后,我们验证中心在公元前细胞系基因的表达。结果。我们筛选84下调ARGs, 74个调节参数,和32预后参数在人类衰老基因资源。衰老的模式基于预后基因优秀的生存预测( )公元前405年病人和歧视性的能力。此外,我们没有发现显著差异在突变分析老化模式,所有的特征TP53,TTN,KMT2D突变。值得注意的是,B在老化集群模式有更好的应对免疫疗法和更积极的免疫微环境( )。此外,基因富集分析表明,老化模式可能与生物过程如金黄色葡萄球菌感染,吞噬体,cytokine-cytokine受体相互作用。随后,我们构建了一个风险签名基于16微分基因不同的老化模式和生存有很好的预测能力在地理和TCGA队列。具体来说,生存分析显示明显较短的生存时间在高危组比低风险组(TCGA和地理, )。此外,AUC值在ROC分析预测1、3和5年TCGA队列,0.713,0.714,和0.738,分别。AUC值预测1、3和5年地理群体,0.606,0.663,和0.718,分别。毫无疑问,风险评分是一个独立的预后因子多变量Cox回归分析的结果在公元前患者( )。也有显著差异在免疫细胞浸润,免疫检查点和免疫之间的分数两组( ),但它不应被忽略的相关性HLA表达式很软弱。最后,我们识别和验证CLIC3作为一个中心基因可能参与Wnt信号通路,等等。结论。我们提供了强有力的证据,老化模式基于参数可以指导靶向治疗和生存预测在公元前的病人。
1。介绍
膀胱癌(BC)是泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一1),它可以分为muscle-invasive和nonmuscle-invasive亚型根据渗透。值得注意的是,公元前的发病率正在上升,它在男性癌症中排名第三2]。生物标志物的发现和生存预测世界各地重要的话题在公元前诊断(3]。结果,建立一个有效的分层方法对监测至关重要的生存状态BC病人以及他们的治疗。
人类衰老基因资源(HAGR)是一组基因数据库,使用综合分析的生物学和遗传学在人类衰老过程屏幕中心与衰老相关的基因,让体内的基因(ARGs)网络中心(4]。逐渐退化的功能在分子和细胞水平是衰老的最显著的表现5]。衰老和癌症之间的关系正变得越来越明显(6],衰老和癌症细胞衰老的主要指标进行了调查(7),免疫衰老是最突出的例子之一(8]。与此同时,bioinformatic-based方法用于构造EMT-related [9和相关的几种10公元前)风险特征来预测总体生存患者。然而,老龄化带来的风险特征预测生存状态从未成立于公元前的病人。
因此,在这项研究中,在公元前评估参数的预后价值,我们构造的老化模式,进一步建立了一个风险特征,揭示了参数与免疫治疗和生存的预测。
2。材料和方法
2.1。生物信息学数据集和数据预处理
BC-clinical数据,BC-RNA测序概要文件( ),正常膀胱上皮细胞RNA序列配置文件( )得到从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(11]。我们排除了公元前病人没有RNA序列和存活时间,最后,只有405患者保留,以备后续分析。此外,我们从GEO数据库下载GSE13507数据集,包括公元前165患者主要为外部验证队列。与此同时,基因被确定基于GENCODE数据库的注释文档(12)和GPL6102。最后,共有20634个常见基因注释在上面的两个数据集。此外,307年PRGs提取基于以前的研究(13]。
2.2。样品老化模式分类
“limma”包被用来屏幕微分参数在正常和肿瘤组织( 和 )。预后参数( )然后使用单变量Cox回归分析筛选。我们执行两个分类中使用“ConsensusClusterPlus”包软件。在整个BC的病人,最好的价值选择通过识别拐点的平方误差的总和(SSE)基于预后参数表达式。后 ,下降的速度减慢;所以, 被选中。此外,我们执行kaplan meier生存分析和PCA分析集群A和B组在老化模式。
2.3。建设一个签名和列线图老龄化带来的风险
“limma”包是用来筛选差异基因集群A和B组( 和 )。预后基因( )然后使用单变量Cox回归分析筛选。这些预后基因进一步纳入多变量Cox和套索回归分析来识别基因参与签名的建设。我们使用适当的λ建立模型和控制的复杂性套索回归。风险评分计算如下:风险评分系统=
根据上述公式的系数,我们使用“regplot”包构建normograms。此外,我们执行kaplan meier生存分析,ROC分析、验证和校准曲线。
2.4。功能富集分析
富集分析微分基因集群和集群B组使用“ggplot2,”和“clusterProfiler”包软件。基因本体论(去)分析和基因和基因组的富集分析京都百科全书(KEGG)提取的结果“clusterProfiler”包。此外,GSEA富集分析也是在不同的风险组织的风险进行签名。
2.5。全面的免疫分析
在探索不同的免疫细胞渗透,我们同时使用CIBERSORT算法来估计免疫细胞的丰度在不同风险组的风险签名。此外,我们使用了估计算法来计算纯度的肿瘤。更重要的是,我们也探讨免疫检查点和HLA-related基因的表达水平在不同风险组。
2.6。PPI网络的建设
研究相互作用的基因,基因风险签名数据库导入到一个字符串( ),这是用来预测PPI网络。然后我们选择最高的基因数量基因两侧的中心。
2.7。化验
两个膀胱癌细胞株(5637和UM-UC-3)和一个正常的膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1)从写明ATCC购买。RNA表达进行定量实时PCR使用结核病绿色预混料交货Taq II工具包(豆类、日本)。从Genepharm Si-RNA针对CLIC3购买(中国南京)。相应的抗体购自圣科鲁兹(美国)和稀释1:1000。进行了详细的实验细节根据方法在之前的文献[14]。使用的引物的序列中存在如下:CLIC3(转发:5 - - - - - -CAGATCGAGGACTTTCTGGAG-3 ,反向:5 - - - - - -GGAGAACTTGTGGAAAACGTC-3 )和GAPDH(转发:5 - - - - - -CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3 ,反向:5 - - - - - -GAAGGCTGGGGCTCATTT-3 )(15]。
2.8。统计分析
所有统计分析使用软件(v.4.0.1)。详细的统计方法对转录组数据都包含在生物信息学方法。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。老龄化带来的模式是由公元前32体内基因的患者
首先,我们进行了差异分析,公元前307年之间的参数样本和正常样本,发现84个基因表达下调,74个基因调节(图1(一))。与此同时,32预后参数使用单变量Cox回归分析筛选,如表所示1。我们分类的老化修改模式公元前405年样本根据ARGs(图的表达1 (b))。同时,我们进一步探讨了表达式的参数来确定最优聚类稳定( )最后确定了两个不同的改造模式(图1 (c)集群),包括211例和194例集群b .随后,根据老化模式,公元前PCA分析表明,样品可以完全区分(图1 (d))。同时,值得注意的是生存分析的结果,在集群有更长的生存时间比集群B ( ),如图1 (e)。此外,我们发现突变分析中没有显著差异,这都为特征TP53,TTN,KMT2D突变(图2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
3.2。公元前患者体内模式调节免疫微环境
我们跟着算法方法计算内容的免疫细胞,间质分数,免疫得分,纯度和肿瘤患者在整个老化模式。集群与集群B相比,患者基质得分较高,肿瘤高免疫分数,和低纯度( ),如图3(一个)。激动人心的是,在免疫细胞有显著差异内容,HLA-related基因表达,免疫与检查点相关基因表达在不同组( ),如数据所示3 (b)- - - - - -3 (d)。这些结果可能表明,老化的修改可能在公元前组织免疫微环境改变。
(一)
(b)
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3.3。潜在的生物学特性在不同老龄化带来的模式
为了探索不同衰老的潜在的生物功能和通路模式,我们筛选了1221个差异表达基因,其中包括1110调节基因和111个表达下调基因。去浓缩相关分析表明,超过1221的基因主要是细胞外基质的组织,等在英国石油公司部分,collagen-containing细胞外基质,等在CC部分,在曼氏金融部分和抗原绑定等(图4 (b))。同时,去充实相关分析表明,超过1221的基因主要是细胞外基质的组织,在英国石油公司部分等collagen-containing细胞外基质,等等(图4(一))。
(一)
(b)
3.4。建设和验证基于老龄化带来的风险签名模式
为了探讨衰老的潜在的预后价值模式,我们筛选了944个预后基因在超过1221个基因。为了避免在高维转录组数据共线性,套索回归进行这些基因与生存相关的数据5(一个)和5 (b))。多变量Cox回归分析了16个基因参与风险的签名,每个基因决定的系数。16个基因参与风险签名包括MXRA7 ALDH1L2, HEYL, FKBP10, TPST1, CYTL1, EPDR1, EMP1, ANXA1, FER1L4, CES1, PCOLCE2, CD3D, PTPRR CLIC3, CTSE。同时,值得注意的是生存分析的结果,有更短的生存时间比低风险组高危人群,和AUC值在ROC分析预测1、3和5年TCGA队列,0.713,0.714,和0.738,分别为(数字5 (c)和5 (e))。这个签名,确保稳定,我们分层的风险主要BC病人GSE13507基于上述基因和将他们分成风险组根据截止值相同。毫无疑问,地理群的可靠性预测的1、3和5年是好的,AUC值为0.606,0.663,和0.718,分别(图5 (f))。此外,它还显示一个健壮的预测能力生存在地理数据集(图5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。公元前的诺模图预测生存状态的病人
进一步调查这个预后的独立的预后价值签名,Cox回归分析表明,风险评分是一个独立的预后因素,如年龄和阶段(数字6(一)和6 (b))。我们结合指标Cox回归分析构建视觉预后model-nomogram,如图6 (c)。此外,校准曲线的计算图表表明,预测曲线接近TCGA队列的标准曲线,这表明预测生存率密切相关的实际利率在1、3、5年,如图6 (d)- - - - - -6 (f)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。基于不同风险子组的免疫微环境的差异
我们跟着算法方法计算内容的免疫细胞,间质分数,肿瘤免疫得分,纯度在所有子组患者不同的风险。与低风险组相比,患者的高危人群有更高的基质,更高的免疫评分,降低肿瘤纯度( )(图7(一))。但是,与老化模式,只有少数HLA-related基因的表达差异,如HLA-DOB HLD-DRB6, HLA-DMB HLA-DPA1,被发现之间的风险组( )(图7 (b))。令人兴奋,也有显著差异基因表达在免疫细胞和免疫与检查点相关内容在不同组( ),如数据所示7 (c)和7 (d)。这些结果可能表明风险子组基于老化模式可能区分BC组织的免疫微环境。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.7。PPI网络的建设和探索中心的基因
为了研究不同风险组的生物路径可能不同,我们使用GSEA浓缩分析发现高危人群可能与ecm相关受体相互作用,粘着斑,mapk信号通路,wnt信号通路,等等(图8(一个))。此外,我们执行风险基因签名,导入到一个字符串数据库( )。最后,我们选择了CLIC3数最高的为中心的基因(图8 (b))。
(一)
(b)
3.8。体外验证
进一步验证基因PPI网络的中心,我们发现CLIC3 mRNA的表达水平BC细胞系。结果表明,CLIC3在调节肿瘤细胞系的表达与SV-HUC-1相比,如图9(一个)。此外,si-CLIC3和si-NC转染5637年和UM-UC-3细胞,分别存在和免疫印迹检测AGTRAP的蛋白表达。发现公元前CLIC3表达式中表达下调与转染细胞系,如图9 (b)和9 (c)。同样,公元前CCK-8化验表明,细胞增殖抑制与CLIC3转染后,如图9 (d)和9 (e)。此外,GSEA浓缩的结果分析表明,在高危人群Wnt信号通路被激活;所以,我们进行免疫印迹分析在公元前细胞系转染CLIC3核检测这个途径。免疫印迹分析表明p -β连环蛋白水平增加,p-GSK3β5637年水平下降和UM-UC-3细胞CLIC3沉默之后。p -的比率β连环蛋白总β连环蛋白增加,而p-GSK3的比率βGSK3来β减少,暗示Wnt /关闭β连环蛋白的信号,如图9 (f)和9 (g)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4所示。讨论
在生物学上来说,衰老是一个自然的过程,随着时间的推移无法避免。它体现,如退行性变化的结构和功能的下降(5]。衰老已被确定为一个独立的危险因素对于大多数常见的癌症,包括公元前(16]。此外,老化可能有抑制肿瘤的效果,因为肿瘤的逮捕senescence-induced增长减缓经济增长(5]。因为体内基因的重要性,老化指标也可能预测prognisis癌症患者的能力。
17日我们进行了PPI网络分析aging-associated基因签名,包括在风险CLIC3是通过实验验证。据我们所知,CLIC3属于胞内氯离子通道家族(17),在多种肿瘤,导致患者的不良预后[18]。CLIC3已经证明有一个角色在乳腺癌细胞系入侵和转移,和CLIC3的超表达雌激素受体阴性预测预后不良(19]。此外,CLIC3和Rab25共同促进癌症恶化[20.]。我们的研究结果意味着更多的参与研究CLIC3在细胞衰老是十分必要的。虽然目前bioinformation-based CLIC3在膀胱癌中的作用研究,这项研究只进行了简单的表达差异分析和临床相关性CLIC3 [15]。在验证我们的研究的一部分,我们进一步探讨CLIC3的蛋白表达和Wnt通路的变化在公元前细胞系CLIC3沉默。
构建与模式和调查对免疫微环境的影响,药物敏感性,和生存状态在公元前患者中,我们利用微分参数聚类方法的共识。后,17个参数选择的差异基因在体内模式来构造一个风险签名TCGA队列。我们的研究仍然存在一些局限性,值得注意。针对结果,首先,使用TCGA和地理样本进行验证。然而,我们无法进行第二次外部验证,因为我们缺乏足够的资金来序列BC病人在我们的医院。第二,我们只使用PPI网络为中心基因,证实了我们的发现,我们将来需要进行更多的实验来证实我们的结论。
总之,我们已经开发出一种风险基因签名基于参数和验证中心。因此,基于本研究的发现是有用的为促进个性化的免疫治疗和生存预测在公元前的病人。
5。结论
我们提供了强有力的证据,老化模式基于参数可以指导靶向治疗和生存预测在公元前的病人。
数据可用性
以下信息是提供有关数据可用性:数据可用,TCGA (https://portal.gdc.cancer.gov/)和地理数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。
伦理批准
作者是负责所有方面的工作在确保相关问题的准确性或完整性的任何部分工作适当的调查和解决。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
B.W.构思和设计研究。F.T.负责材料。C.Z.起草。l,Y.L., and J.W. revised the article critically. All authors had final approval of the submitted versions.