lncRNA tsar - as2是一种新型的预后生物标志物，通过通过海绵体miR-487a-3p上调PPM1A，促进口腔鳞癌进展

摘要

背景．长链非编码RNA (Long noncoding RNA, lncRNA)在调控肿瘤的发生发展中起着重要作用。本研究旨在探讨lncRNA tspie - as2 (tspie - as2)在口腔鳞癌(OSCC)中的表达模式、临床意义及生物学作用。材料与方法．用RT-PCR检测tsar - as2在OSCC标本和细胞株中的表达状态。统计分析tsar - as2的临床意义。使用伤口愈合试验、transwell、菌落形成和细胞计数试剂盒-8检测OSCC的增殖、侵袭和迁移过程。此外，还探讨了tsar - as2在OSCC中的下游分子机制。结果．tsar - as2在OSCC肿瘤和细胞中过表达。TSPEAR-AS2高与TNM晚期相关。tsar - as2高表达的OSCC患者的无瘤生存期和总生存期较低表达的OSCC患者短。研究发现，下调tsar - as2可抑制OSCC细胞的增殖、侵袭和迁移过程。荧光素酶报告基因检测和RNA下拉结果显示，TSPEAR-AS2通过调控miR-487a-3p增强PPM1A的表达，TSPEAR-AS2可作为miR-487a-3p海绵抑制PPM1A的表达。结论．我们的研究强调了tsar - as2 /miR-487a-3p/PPM1A轴在OSCC进展中的重要性，并为OSCC治疗提供了一种新的生物标志物和策略。

1.介绍

口腔鳞状细胞癌（鳞癌），居前排名8起因全球癌症相关死亡的，占> 90％的头颈部癌，影响每年[400余万人1，2］．食道癌的两个主要危险因素是酒精和吸烟。口腔卫生不良也被发现与口腔鳞癌的病因有关[3.］．尽管外科技术和放化疗已经取得了很大的进展，但OSCC患者的5年生存率仍然很低[4，5］．早期诊断不佳是OSCC患者预后不佳的主要原因[6，7］．目前已经证实在口腔鳞状细胞癌级数多种遗传和表观遗传异常的参与，但参与了口腔鳞状细胞癌肿瘤发生的分子机制在很大程度上仍然不清楚。

长非编码RNA（lncRNAs），基于RNA转录聚合酶II，被定义为含有> 200个核苷酸[转录8］．越来越多的证据表明，lncrna作为一种转录因子，在多种生物学过程中发挥着重要作用[9，10.］．lncrna的失调也被证实参与了多种肿瘤的发生和进展[11.，12.］．例如，lncRNA PART1过表达通过吞噬miR-17-5p促进肺癌细胞增殖和转移过程[13.］．lncRNA LINC00844是肝细胞癌中高表达的lncRNA，在肝细胞癌中被证明是一种肿瘤抑制因子，通过靶向AZGP1抑制肿瘤细胞的转移[14.］．在OSCC，lncRNA LINC01929证明通过靶向所述miRNA-137-3p / FOXC1轴[加强OSCC细胞增殖和转移的能力15.］．虽然到目前为止已有大量人类lncrna在OSCC中异常表达的报道，但大部分lncrna的生理功能仍不甚清楚。

此前，lncRNA TSPEAR-AS2被示出以显示在细胞水平缺氧诱发的肺动脉高压[调节作用16.］．最近，Ma等首次报道tsar - as2作为胃癌相关lncRNA，通过抑制GJA1表达抑制肿瘤细胞转移[17.］．然而，TSPEAR-AS2在其他肿瘤中的潜在功能尚未被研究。在本研究中，我们提供了证据，证明tsar - as2在OSCC标本中是一个过表达的lncRNA，可能是OSCC患者的一个新的生物标志物。此外，我们还研究了tsar - as2在OSCC中的作用及其可能的机制。

2.材料和方法

2.1。人类临床标本的收集

研究者在云南省第一人民医院收集了95个临床相关OSCC肿瘤组织和配对的附近非肿瘤组织。组织在手术过程中接受收集，然后在液氮或-80°C的温度下进行存储。所有经组织病理证实为OSCC的患者均在云南省第一人民医院进行手术。本研究按照云南省第一人民医院伦理委员会批准的方案进行。各自的患者提供了参与的书面知情同意书。

2．2.细胞培养和转染

中国科学院细胞库提供6个OSCC细胞系(SNU1041, FADU, HSU3, SCC25, SCC9, SCC4)和NHOK细胞系。所有细胞在含10%胎牛血清的DMEM (Invitrogen公司，中国广东深圳)中(Biocyto公司，中国广东广州)，在37℃、5% CO的温度下进行培养₂和饱和湿度。tspie - as2 shRNA (sh-NC)、tspie - as2 shRNA (sh- tspie - as2 -1和sh- tspie - as2 -2)、miR-487a-3p mimic (NC mimic)、miR-487a-3p抑制剂(NC抑制剂)购自中国GenePharma。接下来，用Lipofectamine 2000 (Invitrogen/Thermo Fisher Scientific)转染SCC25和FADU细胞。

2．3.RNA提取和RT-qPCR

研究人员采用TRIzol试剂从标本和细胞中获取总RNA。采用PrimeScript RT试剂试剂盒，3μg RNA总体逆转录为cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master(罗氏，浦东，上海，中国)在Bio-Rad RT-PCR循环器(罗氏，浦东，上海，中国)上进行RT-qPCR。以GAPDH和U6为对照，分别调节mRNA和miRNA的表达水平。用2^-ΔΔCt方法。桌子1列出了rna的引物序列。

２.４.CCK-8检测试剂盒

为了分析OSCC细胞株的生长情况，按照生产商的协议进行了CCK-8测试(Dojindo Laboratories)。OSCC细胞在96孔板中培养过夜。在1 d、2 d、3 d和4 d后，细胞加入CCK-8(中国江苏南京Lifusai)。用酶标仪测量490 nm处的光密度，数据用吸光度值表示。使用GraphPad Prism 8软件(GraphPad software, Inc.)绘制细胞生长曲线。这些测试至少进行了3次。

2．5．集落形成试验

细胞接种于12孔板，培养10天。第5天新鲜培养基替换原培养基。孵育过程结束后，研究人员采用PBS冲洗细胞。然后用4%多聚甲醛对细胞进行5 min固定，再用0.1%结晶紫进行30 s染色。最后，计数和记录菌落数量(超过50个细胞)。

2.6。EdU公司化验

细胞在24孔板中培养，研究人员引入10孔μ每个井的M EdU。随后，用4%甲醛固定细胞30分钟。48小时后，50小时后μ将EdU标记培养基M分别导入各孔，细胞孵育8 h。然后用Hoechst 33342染色20 min，捕获细胞。最后，在显微镜下对edu阳性细胞进行观察和计数。

2.7。伤口愈合实验

研究人员汇合单层内的矩形细胞培养板进行的播种和培养过程的小区。该小区接收培养，直到融合达到了近100％。10. L pipette tips were used to create cell wounds. Moreover, in FBS-free F12K medium (Procell, Nanjing, Jiangsu, China), cells were then cultivated. At 24 h after culture, an inverted microscope was used to measure the width of the wounds. Gap distance was quantified using NIH ImageJ software version 1.50.

2.8。Transwell化验

采用transwell室检测细胞侵袭能力。总共 细胞补充到每个transwell腔室的上腔室(孔径:8μM;康宁，北京，海淀，中国)，600μ含10%胎牛血清的培养基L接受了相对较低的隔间添加量。当在室温下完成24小时的培养过程时，研究人员使用棉签在上室的内表面刮拭细胞。在相对较低的室中，用乙醇固定被侵细胞。然后，用0.1%结晶紫染色收集细胞15分钟。手动统计细胞数。

2.9。亚细胞分离

根据生产指南，使用PARIS Kit (Life Technologies, Hangzhou, Zhejiang, China)进行细胞质和细胞核分离。

2.10。RNA pull-down方法

生物素化tsar - as2探针、miR-487a-3p探针和相对对照根据GenePharma (Shanghai, China)获得。细胞裂解液与M-280链霉亲和素磁珠(Invitrogen)结合，如先前研究所述[18.]，和qRT-PCR法检测的TSPEAR-AS2或miR-487a所-3的表达。

2.11。荧光素酶报告实验

将tsar - as2 - wt /MUT或PPM1A-WT/MUT亚克隆到pmirGLO双荧光素酶载体(Biomart，北京海淀，中国)。首先，SCC25或FADU细胞通过pmirgloo - tsspearo - as2 - wt /MUT和NC模拟物或miR-487a-3p模拟物共转染。其次，使用miR-487a-3p模拟物和pmirgloo - ppm1a - wt /MUT共转染SCC25或FADU细胞。使用双荧光素酶报告基因检测系统(Promega, Pudong, Shanghai, China)转染48小时后测量荧光素酶和肾细胞信号。荧光素酶报告基因检测有3个重复。

2.12。Western blot检测

收集SCC25和FADU细胞，并在RIPA裂解缓冲液(Yita生物学，平谷，中国，北京)中裂解以收集蛋白。蛋白在30μg/lane和转移到硝基纤维素膜(EMD Millipore，上海浦东，中国)。接下来，我们组用5%的脱脂奶粉封闭膜1小时。然后,膜与初级孵化抗体包括anti-PPM1A(猫没有。ab14824, Abcam)和anti-GAPHD (Cat号。ab8245;Abcam)，在4°C下过夜，并与辣根过氧化物酶(HRP-)结合的二抗(固多，上海，中国)在环境温度下1小时。研究人员使用ImageJ软件对各自波段所显示的密度进行量化。

2.13。统计分析

数据呈现为 (SD)。采用SPSS (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计调查，采用GraphPad Prism软件绘制图表。在不同的组内比较，学生的 -检验或单因素方差分析。采用log-rank检验分析OS和DFS, Kaplan-Meier绘制生存曲线。采用Cox比例风险模型进行多变量分析。统计显著性(值)设置为小于0.05。

3.结果

３．１．tsar - as2在OSCC组织及癌旁正常组织中的表达

为了探索tsar - as2在OSCC中的潜在作用，我们分析了tsar - as2在OSCC组织和细胞系中的表达情况。如图所示1(一)，与正常组相比，tsar - as2在OSCC组织中的表达明显升高( ）.ROC分析显示两组(肿瘤组与正常组)存在较强的分离，AUC为0.8114(0.7478-0.8749)(图1 (b)）.此外，更高水平的TSPEAR-AS2在OSCC观察的标本与III-IV与用III相比（图1 (c)）.ROC分析显示两组之间有很强的分离(I-II vs. III-IV)， AUC为0.8387(0.755 -0.9225)(图1 (d)）.此外，我们的组也观察到TSPEAR-AS2表达与NHOK细胞相比6个OSCC细胞中明显上调（图1 (e)）.

３.２．tsar - as2表达在OSCC患者中的预后价值

为了更好地了解tsar - as2在OSCC发展中的潜在作用，根据tsar - as2的中位表达水平将患者分为高表达组和低表达组(5.89)。卡方检验显示TSPEAR-AS2高表达与TNM晚期相关( ）(表2）.然而，TSPEAR-AS2的表达与其他临床因素之间没有相关性 ）.在我院公寓随访5年，收集5年生存数据，采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验进行分析。我们发现，tsar - as2高表达组患者的总生存期(OS， ，数字1 (f))和无病生存(DFS， ，数字1 (g))较低tsar - as2表达组明显减少。更重要的是，对OSCC患者的预后因素进行多因素分析后，发现tsar - as2表达水平是OS的独立预后因素( ，95%置信区间:1.217—-4.324; ），以及DFS（ ，95%置信区间:1.334—-4.732; ）口腔鳞癌患者（表3.）.

３．３．tsar - as2基因敲低在OSCC进展中的作用

探索通过TSPEAR-AS2在OSCC细胞施加的调节作用，三点的shRNA（SH-TSPEAR-AS2-1和sh-TSPEAR-AS2-2）靶向TSPEAR-AS2和一个扰频对照shRNA（SH-NC）施加．效率然后在稳定转染的细胞中通过RT-qPCR测定（图2(一个)）.CCK-8结果显示，与阴性对照和空白组相比，在SCC25和FADU细胞株中，tspearas2敲低细胞的增殖均受到显著抑制(图)2 (b)）.菌落形成试验和Edu试验也表明，敲低tsar - as2可显著抑制SCC25和FADU细胞的活力(图)2 (c)和2 (d)）.随后，我们进行了伤口愈合实验和transwell实验，探索tspears - as2敲低对OSCC细胞转移能力的影响。观察到，TSPEAR-AS2的敲除明显减少了迁移(图)3(一个)）和侵入性（图3 (b)和3 (c)SCC25和FADU的能力。

3.4。TSPEAR-AS2担任的miR-487A-3P的海绵

已经证实，大量的细胞质lncrna已被报道为竞争性内源性rna (ceRNAs)，通过microrna的竞争性结合过程[19.，20.］．亚细胞分馏过程中，TSPEAR-AS2在细胞核和细胞质内均有表达，细胞质中TSPEAR-AS2的比例更高(图)4(一)）.生物信息学工具估计了tsar - as2和miR-487a-3p中的互补结合位点，并通过荧光素酶报告基因检测证实(图)4 (b)和4 (c)）.RNA下拉实验也显示tsar - as2与miR-487a-3p结合(图)4 (d)）.最后，RT-PCR检测显示，在抑制tsar - as2表达后，SCC25和FADU中的miR-487a-3p水平升高(图)图4（e））.

3．5．PPM1A在OSCC细胞中被鉴定为miR-487a-3p的直接靶点

为了探索tsar - as2 /miR-487a-3p轴的具体机制，我们利用TargetScan预测miR-487a-3p的潜在靶点。结果显示PPM1A可能是miR-487a-3p的潜在靶点(图5(一个))，用荧光素酶报告基因检测证实(图图5（b））.此外，我们观察到miR-487a-3p过表达明显抑制了tsar - as2和PPM1A的水平，而miR-487a-3p敲低则显示相反的效果(图)图5（c））.进一步的挽救实验发现，miR-487a-3p的敲低明显逆转了tspears - as2敲低对PPM1A表达的抑制(图)图5（d）)。

4.讨论

敏感生物标志物的鉴定对于改善OSCC患者的临床结果非常重要[21.，22］．有很多文献报道了OSCC生物标志物的发现，但只有少数生物标志物被验证并成功应用于常规临床实践[23，24］．此外，大多数生物标记物在OSCC的早期检测中都有局限性，它们的预后价值受到不准确性的困扰。近年来，越来越多的研究强调了lncrna作为癌症患者新型生物标志物的潜力[25，26］．一些lncRNA，如lncRNA HOXA11-AS、lncRNA CASC9和lncRNA LEF1-AS1，已经被证明对OSCC患者具有诊断和预后价值[27- - - - - -29］．在本研究中，我们发现了一种新的OSCC相关的lncRNA, tsar - as2，它在OSCC中高表达，可以作为OSCC患者的诊断和预后标志物。tsar - as2高表达的OSCC患者的OS和DFS明显短于tsar - as2低表达的OSCC患者，这与tsar - as2表达在胃癌患者中的预后价值一致[17.］．然而，样本量相对较小。以后我们会收集更多的样本进行研究。

由于细胞信号通路在癌症开始、进展和转移中的作用，参与这些通路的lncrna可以影响肿瘤发生的各个方面[30.，31］．因此，lncrna可能在癌变或肿瘤抑制中发挥作用。例如，通过miR-411-3p/NFAT5轴抑制TTN-AS1导致OSCC细胞在肿瘤生长和转移中的能力抑制[32］．MCM3AP-AS1过表达通过调控miR-204-5p/FOXC1促进OSCC细胞增殖和侵袭[33］．鉴于tsar - as2在OSCC标本中高表达，并预测OSCC患者的预后较差，我们进行了功能缺失分析，发现敲低tsar - as2明显抑制了OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。今后还需要通过体内实验进一步证实tsar - as2对OSCC进展的影响。此前也证实了TSPEAR-AS2对胃癌细胞具有类似的致癌作用，表明TSPEAR-AS2作为一种新的治疗靶点具有巨大的潜力[[17.］．

已有研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中具有致癌性或抑制性，lncrna的表达能够控制miRNA的活性[34，35］．越来越多的证据表明，lncRNAs控制OSCC开发和由揩下游的miRNA阵列[进展36，37］．因此，钻研所提到的miRNA能够帮助开发用于预防和治疗口腔鳞癌中的可行办法。我们的实验证明TSPEAR-AS2有细胞质内的主要表现，提示充当CERNA TSPEAR-AS2的巨大可能性。母星2.0揭示的miR-487A-3P可以是TSPEAR-AS2，其进一步通过荧光素酶报道基因测定，RNA下拉，和RT-PCR证实的靶标。此前，的miR-487A-3P已报道在几个肿瘤，如结肠癌和胃癌[待过表达38，39］．重要的是，在OSCC中发现miR-487a-3p表达上调，抑制OSCC细胞的增殖和转移[40］．这些结果表明，tsar - as2可能通过海绵作用miR-487a-3p发挥其致癌作用。

PPM1A是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2C家族成员[41］．它可以控制tgf - β /Smad19-21和丝裂原活化蛋白激酶22的细胞信号通路，以及细胞的增殖、入侵和迁移过程[42，43］．在OSCC中，PPM1A已被报道高表达并促进OSCC细胞的增殖和转移，而PPM1A如何控制上述活性尚需深入研究[40］．在本研究中，我们发现PPM1A可能是miR-487a-3p的靶点。过表达miR-487a-3p抑制PPM1A的表达，而miR-487a-3p敲低则相反。基于PPM1A在OSCC进展中的致癌作用，我们推测miR-487a-3p可能通过靶向PPM1A而起到抑癌作用。最后，我们进行了抢救实验，发现miR-487a-3p的下调明显逆转了tspears - as2对PPM1A蛋白表达的抑制。因此，我们的研究结果表明，tsar - as2可能通过海绵作用miR-487a-3p提高PPM1A的表达水平，从而抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

5.结论

综上所述，我们确定TSPEAR-AS2作为内OSCC肿瘤司机，并表示TSPEAR-AS2的状态下表现出较大的肿瘤转移，预后差有关系。TSPEAR-AS2 /的miR-487A-3P / PPM1A轴可充当新CERNA调控网络，从而，加速OSCC的恶性过程。TSPEAR-AS2有可能成为一种新的生物标志物和治疗的相关目标，这种疾病在未来。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

云南省高层次人才工程资助项目(No. 201430531);项目编号:H2019016);2017年fe467 -(156)]。

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