文摘
客观的。癌症干细胞(二者)与自我更新和可塑性为肿瘤起始和发展作出贡献。本研究开发了一个具备干细胞mRNA表达式的指数(mRNAsi)签名和验证相关的生物功能的干细胞相关基因在口腔鳞状细胞癌(OSCC)。方法。这里,mRNAsi测量TCGA OSCC样本群,和预后和肿瘤微环境(肿瘤基质/免疫分数,纯度)高,low-mRNAsi样本评估与生存分析和估计算法。基于预后mRNAsi-related基因,由套索构造风险评分模型的方法。预测精度是评价uni -考克斯和多元分析和ROC曲线。在模型中的基因,H2AFZ细胞增殖的功能,细胞凋亡,入侵,EMT在OSCC细胞进行调查。结果。高mRNAsi明显与不良预后相关,基质和免疫分数增加,降低肿瘤的纯度。包含11个基因是mRNAsi-associated签名,高风险评分明显相关不良的生存状况。此外,这个签名是一个独立的和健壮的危险因素。H2AFZ upregulation显著增强的增殖和侵袭性能力和促进EMT以及降低Cal-27和HSC-3细胞凋亡水平。结论。我们的研究癌症干细胞的特征特性,具备干细胞与肿瘤微环境和发展密切相关的指数闲暇的签名,可以帮助预测和预后OSCC的危险分层。H2AFZ对OSCC可能成为一个潜在的治疗目标。
1。介绍
口服癌在人类中代表了一种常见的恶性肿瘤,90%以上的情况下产生口腔鳞状细胞癌(OSCC) [1]。多因子的恶性肿瘤,常见的危险因素包括烟草,喝酒,和人类乳头状瘤病毒(2]。超过300000新病例的OSCC每年在全球范围内,每年超过140000名患者死于OSCC [3]。五年存活率仅为50% (4]。与此同时,大多数转移病人死在12个月内(5]。OSCC的常规治疗是治疗切除,放疗和化疗6]。然而,在过去的30年里,还没有明显的进展在OSCC的治疗。发现支撑OSCC的分子机制是很重要的,这可能会加快发展个性化治疗策略。
最近的进展表明,癌症干细胞(二者)自我更新、可塑性发挥关键作用在OSCC发展和增长7]。此外,二者为电台——和药物抗性以及与不良的生存状况和癌症复发OSCC [8]。具备干细胞具备干细胞特征已经被新的衡量指数,如DNA甲基化和mRNA表达式具备干细胞指数(mRNAsi) [9]。这个mDNAsi已经报道在一些癌症的预后指标,从而帮助预测癌症恶化和指导临床治疗。以前,张等人提出了一个mRNAsi-related签名可能独立预测预后和分层神经胶质瘤的风险等级较低(10]。所描述的白et al .,过度的mRNAsi检测在肝癌以及与肿瘤病理分级和穷人生存时间(11]。然而,没有研究试图探索二者的特点在OSCC mRNAsi的基础。这里,我们的交互特征mRNAsi OSCC预后以及肿瘤微环境。也一个mRNAsi-related签名已经开发了一个准确、OSCC的独立的预后因子。此外,我们研究了在OSCC细胞H2AFZ mRNAsi-related基因的功能。我们的数据表明,H2AFZ upregulation显著增强的增殖和侵袭性能力和促进EMT以及抑制凋亡水平Cal-27以及HSC-3细胞,证明对OSCC H2AFZ可能是一个有前途的治疗目标。
2。材料和方法
2.1。病人和数据集
由RNA转录组配置文件排序(RNA-seq;FPKM值)328年OSCC组织得到癌症基因组图谱(TCGA;https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)3月11日,2020。FPKM值变成了TPM值。同时,匹配的临床特征包括年龄,性别,年级,舞台,T, M, N以及生存信息也从数据库中检索出来,TCGA(补充表1)。整体的数据库(http://asia.ensembl.org/index.html),集合id转换成基因符号。
2.2。收购mRNAsi
所描述的马耳他et al ., mRNAsi每个OSCC的样本计算逻辑回归使用看到下面成了机器学习算法(OCLR) [9]。mRNAsi表达利用值,范围从0(没有mRNA表达)到1(完整的mRNA表达)。mRNAsi通过多个检索平台分析根据前面的研究(9]。患者分为高收入和low-mRNAsi组mRNAsi中值的基础上。mRNAsi决心的预后价值,总生存期(OS)子组之间进行了分析通过kaplan meier曲线以及使用“生存”和“surviminer log-rank测试包。
2.3。免疫估计分数,基质得分,纯洁和肿瘤
利用估计的基质和免疫细胞恶性肿瘤使用表达数据(估计)算法,基质细胞以及免疫细胞的分数推断在OSCC组织中使用基因表达特征。根据肿瘤基质和免疫分数,纯度估计。比较肿瘤免疫/基质的分数和纯度高,low-mRNAsi组通过Wilcoxon测试。
2.4。推断肿瘤浸润免疫细胞
CIBERSORT方法(http://cibersort.stanford.edu/)是利用量化22肿瘤浸润在每个OSCC组织中免疫细胞分数基于基因表达分析(12]。包括天真的B细胞的免疫细胞,记忆B细胞、浆细胞、CD8 + T细胞,天真的CD4 + T细胞CD4 +休息记忆T细胞CD4 +记忆激活T细胞,T细胞卵泡助手,T细胞的调节器,T细胞γδ,休息/激活自然杀伤细胞,单核细胞,M0、M1、M2巨噬细胞,休息/激活树突状细胞,肥大细胞,激活肥大细胞,嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞。重要的结果( )为进一步分析筛选。
2.5。分析差异表达基因(度)
与“limma”算法,度筛选高和low-mRNAsi样本[之间13]。基因与 以及错误发现率 异常表达。这些度可视化火山的阴谋之中。
2.6。功能注释的分析
使用“clusterProfiler”方案、功能注释分析mRNAsi-related度调查和可视化的生物功能和途径提出了涉及以上基因,包括基因本体论()函数注释以及京都基因和基因组的百科全书(KEGG) [14]。与 被认为是极大地丰富。
2.7。预测模型的发展
通过单变量Cox回归分析,度与OSCC的生存筛选密切相关。这些prognosis-related关键度优化通过至少绝对收缩和选择算子(套索)分析“glmnet”包15]。变量选择和prognosis-related候选人的收缩度被执行。之后,所产生的风险评分模型多变量Cox回归分析基于系数和每个基因的表达。根据中位数,OSCC患者集群分成两个子组。生存状态观察两组。此外,系统分析在高和低风险患者通过kaplan meier曲线。操作系统的差异与log-rank估计测试。mRNAsi-associated基因的表达被可视化成热图通过pheatmap包。临床病理的差异特征(年龄、性别、年级和阶段)估计在高和低风险的子组。签名的预测精度是评估通过曲线下的面积(AUC)接收机算子的特性曲线(ROC)。 Uni- and multivariate Cox analyses were achieved for estimating the predictive independency of this signature. The expression of the mRNAsi-associated genes was detected in 519 OSCC and 44 normal tissues from TCGA dataset. Kaplan-Meier survival curves were conducted for evaluating the prognostic significance of the mRNAsi-associated genes among OSCC patients in TCGA dataset.
2.8。基因集富集分析(GSEA)
潜在的分子机制通过GSEA mRNAsi-associated签名进行了方法(16]。丰富KEGG途径探讨了高和低风险的样本。途径与 大大丰富了。
2.9。发展预后列线图和评估其预测性能
生存的独立预测因素都结合构建一个prognosis-associated列线图的概率为研究1 -,3 -,5年操作系统在OSCC患者glmnet包(15]。预测精度的诺模图估计ROC曲线。校准曲线的绘制观察nomogram-predicted和观察到的生存概率。同时,决策曲线分析(DCA)计算了每个因素的临床净效益相比,所有或没有一个因素(17]。最好的模式是最高的净效益计算。
2.10。病人和标本
三对新鲜OSCC和邻近的正常组织收集从OSCC口腔科病人手术,中国人民解放军总医院。所有的患者手术前化疗。本研究协议获得伦理委员会批准,中国人民解放军总医院,以书面知情同意收购从每个病人(2020 - 039)。
2.11。细胞培养和转染
OSCC细胞Cal-27 HSC-3(中国科学院上海细胞库(中国))保持在DMEM(美国Gibco)含10%胎牛血清的边后卫。这些细胞被培养在一个恒温箱含有5%的股份有限公司2和37°C。他们种植到6-well板( 细胞/)。核目标H2AFZ (si-H2AFZ;5 - - - - - -CACCGAGACGCTCGATGACTCCGC-5(感觉),5 - - - - - -AAACGCGGAGTCATCGAGCGTCTC-3(反义);RiboBio,中国)及其负控制(si-NC)以及pcDNA3.1-H2AFZ (RiboBio,中国)和空载体转染到细胞通过Lipofectamine™2000转染工具包(生活技术,美国)。48小时后,H2AFZ表达式用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫印迹。
2.12。RT-qPCR
从转染Cal-27和HSC-3细胞总RNA提取根据试剂盒工具包(美国TIANGEN)。总RNA浓度和纯度的测定。通过GoScript反向转录系统工具包(美国Promega),总RNA被用于获得cDNA反转录反应。引物序列如下:H2AFZ: 5 - - - - - -GGCGGTAAGGCTGGAAAGG-3(向前),5 - - - - - -TGTCGATGAATACGGCCCAC-3(反向);GAPDH: 5 - - - - - -GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3(向前),5 - - - - - -GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3(反向)。然后qPCR反应进行。PCR反应条件包含在95°C predenaturation持续10分钟,变性在95°C持续15秒,退火60°C持久的20年代,和扩展在72°C的20年代,共有40个周期。之后,H2AFZ以及GAPDH表达式被自动读取和PCR仪器中生成。H2AFZ决意利用的相对表达式2- - - - - -ΔΔCt方法。
2.13。细胞计数Kit-8 (CCK-8)
Cal-27 HSC-3细胞被播种到96孔板(5000个细胞/)。在指定的时间点(0,24、48和72 h), 10μL CCK-8试剂(Dojindo、日本)添加到细胞和孵化1 h。450纳米的吸光度检测使用分光光度计反映细胞生存能力。
2.14。流式细胞术分析
Cal-27 HSC-3细胞转染后被播种到6-well板( 细胞/)。24小时后,细胞没有乙二胺四乙酸使胰蛋白酶化。然后,细胞离心处理5μL膜联蛋白V-FITC (Beyotime中国)以及10μLπ在黑暗中在室温下15分钟。BD FACSCalibur应用流式细胞术检测细胞凋亡。最后,结果评估CellQuest软件(BD生物科学)。
2.15。Transwell化验
测定了细胞入侵8μm Transwells。薄膜与基底膜基质涂层。Cal-27以及HSC-3细胞转染后被播种到上部腔体( 细胞/)。钱伯斯DMEM +加入一定量的边后卫低。24小时后,膜的上表面的细胞刮用棉签和删除。入侵细胞结晶紫沾0.4%。五个字段数倒置显微镜下(奥林巴斯、日本)。
2.16。西方的屁股
总蛋白提取OSCC和正常组织以及Cal-27 HSC-3细胞。然后,BCA试剂盒(Beyotime,中国)是用于测量提取的蛋白质。蛋白质分离与10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳凝胶和转移到PVDF膜。使用5%脱脂牛奶被屏蔽后,膜被孵化主要抗体针对H2AFZ (1: 1000;美国Abcam ab214730)、N-cadherin (1: 1000;美国Abcam ab98952)、波形蛋白(1:1000;美国Abcam ab137321)和GAPDH (1: 1000;美国Abcam ab8245)在4°C一夜之间,其次是二次抗体。蛋白质乐队使用增强化学发光开发工具包和被ImageJ量化软件。
2.17。统计分析
3.6.1 R版本(https://www.r-project.org/)和GraphPad棱镜软件版本8.0.1申请统计分析。从Bioconductor检索(R包http://www.bioconductor.org/)。数据显示为 。Wilcoxon测试学生的 - - - - - -测试和单向方差分析是用于比较子组之间的差异。 指示性的统计学意义。
3所示。结果
3.1。描述mRNAsi和预后之间的相关性和OSCC的肿瘤微环境
本研究量化二者mRNAsi评分TCGA OSCC患者队列(补充表2)。根据中位数的值,这些患者集群分为高——和low-mRNAsi组。生存生存分析进行了调查对象的差异,low-mRNAsi高分数。在图1(一)生存,更不受欢迎的结果被发现high-mRNAsi组相比low-mRNAsi组。通过估计方法,我们评估肿瘤基质/免疫分数以及纯度在OSCC标本。有增加肿瘤间质分数和免疫分数以及降低纯度比low-mRNAsi high-mRNAsi组群(图1 (b))。肿瘤浸润免疫细胞是推断利用CIBERSORT方法。增加渗透水平的CD8 + T细胞,激活内存CD4 + T细胞和NK细胞休息是high-mRNAsi标本(图中发现的1 (c))。与此同时,有更高的渗透水平low-mRNAsi标本中的内存CD4 + T细胞。
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3.2。分析mRNAsi-Associated基因及其生物学意义
识别mRNAsi-associated OSCC的基因,基因 和 筛选(补充表吗3)。在图2(一个)833 mrna upregulation显示和197 mrna在high-mRNAsi差别显示对这些标本比low-mRNAsi标本。此外,这些mRNAsi-associated基因明显富集在肿瘤等途径ECM-receptor互动,在癌症的蛋白聚糖,PI3K-Akt通路(图2 (b))。去证明这些基因注释结果与细胞外基质的组织(图明显相关2 (c))。
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3.3。代OSCC的预后mRNAsi-Associated签名
通过单变量Cox回归分析,14 mRNAsi-associated基因与OSCC患者的预后明显相关(表1)。套索方法11最佳候选生物标记选择构建一个预后风险评分模型(数据3(一个)和3 (b))。每个OSCC患者的风险评分确定,如下: 。所有患者集群分成两组基于中位数mRNAsi(图3 (c))。更多的死亡病例被发现在high-mRNAsi组比low-mRNAsi组(图3 (d))。在图3 (e),high-mRNAsi病人显示比low-mRNAsi病人不宜生存。NPM3, H2AFZ, KPNA2调节low-mRNAsi样本当CCDC92, GAS1, CCL22, TSPAN11, CLEC3B, TWIST2, TPSAB1, IGLV2-14调节low-mRNAsi样品(图3 (f))。
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3.4。评估预测的准确性对OSCC mRNAsi-Associated签名的预后
mRNAsi-associated签名和临床病理特征之间的关系进行评估在OSCC患者。在图4(一)这个签名是明显与OSCC的阶段。签名的AUC为0.700,证明这个签名的well-predictive精度预测生存(图4 (b))。如图所示在uni -考克斯以及多元分析,年龄阶段,风险分数可能OSCC的预后的独立预测因素(数字4 (c)和4 (d))。
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3.5。信号通路包括mRNAsi-Associated签名
GSEA进行尝试解释mRNAsi-associated签名的内在机制。在图5(一个)基本切除修复,细胞周期、DNA复制、错配修复,核苷酸切除修复,核糖体,剪接体在高危OSCC明显激活。同时,B细胞受体、钙、细胞粘附分子凸轮,chemokine-chemokine受体相互作用,ECM受体相互作用,粘着斑,MAPK和T细胞受体途径在低风险的样本(图明显激活5 (b))。
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3.6。代OSCC的预后列线图
独立危险因素(年龄、阶段和风险评分)合并生成预测的列线图OSCC患者1 -,3 -和5年操作系统概率(图6(一))。的auc 1 -, 3 -和5年OS 0.686, 0.715,和0.693,证实well-predictive精度预测的列线图(图生存6 (b))。证明了校准曲线,nomogram-predicted 1 - 3 -, 5年的操作系统非常类似于生存(数据调查6 (c)- - - - - -6 (e))。此外,DCA结果证实,更高的净效益的计算图表1 -,3 -,5年的操作系统相比其他临床因素(数据调查6 (f)- - - - - -6 (h))。因此,这列线图表现出在OSCC well-predictive疗效预后。
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3.7。验证在OSCC mRNAsi-Associated基因的表达
11 mRNAsi-associated基因的表达在OSCC和正常组织。CCDC92、GAS1 H2AFZ、IGLV2 KPNA2, NPM3, TWIST2显著调节与正常组织相比,OSCC(数字7(一)- - - - - -7 (g))。在CCL22没有显著差异,TPSAB1, TSPAN11 OSCC与正常组织之间(数据调查7 (h)- - - - - -7 (j))。同时,CLEC3B显示减少表达式在OSCC比正常组织(图7 (k))。其中,H2AFZ表达式被确诊为调节等多种癌症类型的乳腺癌[18和肝细胞癌19]。本研究提出的H2AFZ upregulation OSCC首次。的表达H2AFZ进一步验证三个配对OSCC通过免疫印迹和正常组织。正如预期的那样,H2AFZ被发现在OSCC的高表达与正常组织相比(数字7(左)和7(米))。11的预后意义mRNAsi-associated基因在OSCC患者进一步分析。我们的研究结果表明,高表达患者CCDC92, CCL22, CLEC3B, GAS1, IGLV2, TPSAB1, TSPAN11, TWIST2表现出杰出的生存优势(数字8(一个)- - - - - -8 (h))。相比之下,高表达H2AFZ KPNA2, NPM3表示预后不良与低表达(数字8(我)- - - - - -8 (k))。
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3.8。H2AFZ Upregulation促进增殖和降低在OSCC细胞凋亡
的生物影响H2AFZ在两个OSCC细胞观察。H2AFZ表达式被明显抑制si-H2AFZ以及被pcDNA3.1-H2AFZ明显升高在Cal-27 HSC-3细胞(数字9(一个)和9 (b))。CCK-8试验进行了调查Cal-27和HSC-3细胞转染后的细胞生存能力。我们的数据表明,si-H2AFZ显著抑制细胞生存能力相比si-NC Cal-27以及HSC-3细胞(数字9 (c)和9 (d))。同时,细胞的可行性Cal-27以及HSC-3细胞显著加剧与pcDNA3.1-H2AFZ转染空载体。通过流式细胞术,凋亡水平Cal-27以及HSC-3细胞观察。因此,增加凋亡水平被发现在OSCC细胞转染后si-H2AFZ si-NC相比(数字9 (e)- - - - - -9 (h))。同时,pcDNA3.1-H2AFZ转染明显降低Cal-27以及HSC-3细胞凋亡水平比空向量。
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3.9。H2AFZ Upregulation促进入侵和EMT在OSCC细胞
Transwell化验进行观察OSCC细胞入侵的能力。si-NC相比,入侵Cal-27的数量以及HSC-3与si-H2AFZ转染细胞明显减少(数字10 ()- - - - - -10 (c))。相反,pcDNA3.1-H2AFZ转染显著增强入侵的能力Cal-27以及HSC-3细胞相比,空向量。蛋白质免疫印迹显示H2AFZ是明显减少了si-H2AFZ以及明显增加了pcDNA3.1-H2AFZ Cal-27细胞(数字10 (d)和10 (e))。此外,EMT-related蛋白质被免疫印迹检测。我们观察到N-cadherin以及波形蛋白表达明显降低与si-H2AFZ Cal-27细胞转染(数字10 (f)和10 (g))。然而,他们的表情明显升高与pcDNA3.1-H2AFZ Cal-27在转染细胞。类似的发现被证实在HSC-3细胞(数字10 (h)- - - - - -10 (j))。我们进一步研究了Cal-27的形态学变化以及HSC-3 si-H2AFZ或pcDNA3.1-H2AFZ转染后细胞。我们的研究结果表明,与si-NC相比,Cal-27 HSC-3细胞转染的形式与si-H2AFZ类上皮癌,细胞变得松散(图10 (k))。此外,与pcDNA3.1-H2AFZ转染后,Cal-27 HSC-3细胞上皮样癌改为轴形状,细胞变得松散。因此,H2AFZ upregulation提升入侵和EMT在OSCC细胞。
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4所示。讨论
越来越多的证据表明,二者发挥关键作用在OSCC开发(20.- - - - - -22]。针对OSCC二者临床治疗非常重要(23]。然而,监管机制涉及二者仍然是模棱两可的。在此,二者被mRNAsi量化分数。高mRNAsi分数明显与OSCC的不良预后和肿瘤微环境有关。功能注释分析发现mRNAsi-related基因在癌症进展的关键角色。
传统临床病理的因素已经利用了反射和未来OSCC进展(24]。TNM代表一个有效的临床工具预测OSCC预测(25]。此外,分子生物标志物可能成为一个有益的补充TNM改善预测精度(26]。此外,这些分子对OSCC发展产生关键功能以及作为新药(27]。克服阻碍肿瘤的异质性,分子生物标志物显示精度高的面板反映OSCC预测相比,一个(28- - - - - -30.]。套索方法,我们开发了mRNAsi-associated签名OSCC预后。高危患者的不良预后相比,那些低风险。中华民国和uni -考克斯和多元分析证实了well-predictive OSCC的签名预后的准确性。我们试图调查mRNAsi-associated签名的内在机制。我们的数据表明,基地切除修复、细胞周期、DNA复制,错配修复,核苷酸切除修复,核糖体,和剪接体明显在高危OSCC B细胞受体,激活钙、细胞粘附分子凸轮,chemokine-chemokine受体相互作用,ECM受体相互作用,粘着斑,MAPK,明显和T细胞受体通路激活在低风险的样本,这证明了在OSCC mRNAsi-associated签名进展的关键作用。
诺模图模型,集成几个分子等预后因素和临床病理的因素已经广泛应用于临床肿瘤评估预测(31日]。生存概率可以使用相对简单的估计输出。相比传统的临床病理的因素,计算图表模型可以准确预测的预测32]。因此,诺模图模型对临床决策和个性化的治疗有益。本研究创建了诺模图,结合年龄、阶段,mRNAsi-associated风险评分,可以准确地预测1 -,3 -,和5年OS OSCC的概率根据中华民国,校准曲线,DCA。在11 mRNAsi-associated基因,CCDC92、GAS1 H2AFZ, IGLV2, KPNA2 NPM3, TWIST2显著调节,而CLEC3B显示在OSCC比正常组织表达下降。以前,H2AFZ表达明显调节肝细胞癌和与不良的生存结果(19]。upregulation高肝癌细胞的增殖能力。H2AFZ表达表现出明显的相关性,为儿童急性淋巴细胞白血病预后和复发。我们发现H2AFZ upregulation可以显著加速扩散,入侵和EMT以及削弱对OSCC细胞凋亡,这是表明H2AFZ拥有OSCC的潜在的作为一个有前途的治疗目标。
几个限制我们的研究应该指出。首先,预测的准确性mRNAsi-associated签名将在一个更大的和潜在OSCC确认队列。此外,在OSCC H2AFZ进展的功能应该调查体内。需要更多的实验观察涉及在OSCC H2AFZ机制。
5。结论
总的来说,这些发现量化二者基于mRNAsi分数,关系密切的生存状况和肿瘤微环境。此外,我们开发了一个mRNAsi-related签名,可以应用在OSCC预后预测和危险分层。在mRNAsi-related基因,H2AFZ验证促进增殖,入侵,EMT对OSCC细胞以及抑制细胞凋亡。因此,OSCC H2AFZ可能成为一个有前途的治疗目标。
缩写
| OSCC: | 口腔鳞状细胞癌 |
| 二者: | 癌症干细胞 |
| mRNAsi: | 具备干细胞mRNA表达式的指数 |
| RNA-seq: | RNA序列 |
| TCGA: | 癌症基因组图谱 |
| 操作系统: | 总生存期 |
| 估计: | 估计基质和免疫细胞的恶性肿瘤使用表达数据 |
| 度: | 差异表达基因 |
| 罗斯福: | 错误发现率 |
| 走: | 基因本体论 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| 套索: | 至少绝对收缩和选择算子 |
| AUC: | 曲线下的面积 |
| 中华民国: | 接收机操作特性曲线 |
| GSEA: | 基因集富集分析 |
| DCA: | 决策曲线分析 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| NC: | 消极的控制 |
| RT-qPCR: | 实时定量聚合酶链反应 |
| CCK-8: | 细胞计数kit-8。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果中包括文件的补充信息。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
补充材料
补充1。补充表1:数据集TCGA OSCC患者的临床特征。
补充2。补充表2:OSCC患者的mRNAsi TCGA的数据集。
补充3。补充表3:mRNAsi-related OSCC的度。