文摘
背景。越来越多的研究表明长非编码rna (lncRNAs)肿瘤进展中扮演很重要的角色。在这项研究中,我们旨在探索的潜在角色lncRNA LINC00958 (LINC00958)及其生物功能的卵巢上皮癌(转换端)。方法。的表达LINC00958 11例转换端和相邻nontumor标本和5个细胞系中存在探测到。CCK-8、集落形成和流式细胞术检测进行了研究曲线端细胞的细胞的异常。伤口,transwell分析进行的检查细胞入侵和转换端细胞的迁移。针对LINC00958之间的关联和STAT1证明了芯片分析结合荧光素酶记者化验。相关的蛋白质Wnt /β连环蛋白信号使用rt - pcr测定。结果。更高水平的LINC00958在转换端观察到组织和细胞系。我们的数据也表明,高LINC00958 STAT1引起的部分表达式。功能,击倒LINC00958抑制增殖,迁移和转换端细胞的入侵。机械的调查显示,LINC00958击倒在转换端细胞的抑制作用是由Wnt /β连环蛋白信号。结论。我们的研究结果表明,STAT1-induced LINC00958提升转换端发展的过度调节Wnt /β连环蛋白信号。
1。介绍
卵巢癌是8范围内最常见的妇科癌症被认为是最常见的肿瘤相关死亡的女性之一,与日益增长的发病率在中国(1,2]。卵巢癌上皮(转换端)估计占所有病例的> 80%的卵巢癌。其中,高档肿瘤是最常见的和有一个评估> 50 - 60%的病例(3]。虽然有改善手术治疗和化疗在转换端患者中,超过80%的晚期患者将接受肿瘤复发和转移,导致平均存活2 - 3年的4,5]。因此,进一步洞察潜在机制转换端复发和转移是迫切需要改进的有效的肿瘤诊断和治疗的目标。
越来越多的生物研究参与微阵列分析表明,75 - 85%的人类基因组的估计是转录成非编码rna (6]。长非编码RNA (lncRNAs)是另一个类> 210个核苷酸的非编码RNA编码的长度和有限能力正常的蛋白质由于缺少一个完整的开放阅读框(7]。它已经被使用证实在体外和在活的有机体内化验lncRNAs表现出其功能的人类进步的监管机构通过参与各种生理和病理过程(8,9]。鉴于lncRNAs的关键作用的调制基因,特别是肿瘤相关基因之间可能存在的关联lncRNAs特异表达和肿瘤进展吸引越来越多的关注10,11]。值得注意的是,一些研究lncRNAs已确定是功能性监管机构通过充当antioncogenes肿瘤促进剂,或两者兼而有之,这取决于类型的肿瘤(12,13]。直到现在,虽然许多lncRNAs已报告在转换端特异表达,只有几个lncRNAs功能特征(14]。此外,它仍然完全清楚其他lncRNAs参与转换端的进展。
lncRNA LINC00958 (LINC00958),位于11 p15.3,最初被描述成为一个膀胱癌症相关lncRNA塞茨et al。(15]。随后,几项研究也报道了LINC00958异常表达在其他肿瘤,如胰腺癌、胃癌,神经胶质瘤(16- - - - - -18]。一些功能化验证实LINC00958这些癌症肿瘤促进剂。然而,LINC00958可能的功能和基本机制的转换端仍有待探讨。在这项研究中,我们首先确定LINC00958作为EOC-related lncRNA及其参与转换端进展报告。
2。材料和方法
2.1。病人和组织样本
匹配所有的肿瘤样本和正常样本从曲线端收集患者进行临床操作。这项研究包括11个病人患有转换端。所有的患者接受手术前化疗或放疗。书面知情同意了所有的参与者参与这项研究,这个研究是伦理委员会批准的哈尔滨医科大学第二附属医院。
2.2。细胞培养和转染
人类转换端细胞系(SKOV3, A2780、CAOV3 OVCAR-3)是获得写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。rmpi - 1640年细胞培养介质(# 22314,黔东南州生物技术,浦东,上海,中国)补充10%的边后卫(Gibco,石景山,北京),100 U /毫升青霉素(# 61-33-6,Yuzhimei,郑州,河南,中国),和100年μg / mL链霉素(Yuzhimei,郑州,河南,中国)。转换端细胞和正常细胞维持在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。
抑制LINC00958, CAOV3 SKOV3和转染使用si-Lnc-1 (siRNA1瞄准LINC00958)和si-Lnc-2 (siRNA1瞄准LINC00958)形成的(能基因公司,浦东,上海,中国),然后选择与嘌呤霉素(Yuzhimei,郑州,河南,中国)两周。相同的细胞不被用作治疗控制。瞬时转染是由Lipofectamine 2000(表达载体)的使用用户的指令。当转染的时间超过48小时,随后的细胞保存细胞化验。
2.3。RNA隔离和存在
从曲线端细胞总rna和组织标本孤立使用试剂盒试剂(美国表达载体)。收集到的rna是反向转录成互补使用PrimeScript rt - pcr试剂盒(豆类,海淀,北京)。lncRNA的水平和相关基因检查中存在的使用方法通过应用SYBR绿色qPCR大师混合(豆类,海淀,北京)。实验过程操作使用ABI 7500实时PCR系统(美国生物系统)。反应情况如下:在95°C predenaturation 12分钟为一个周期,变性在95°C三十秒钟,在72°C和扩展了三十秒。使用的引物是5 - - - - - -GAACTCACCTACTCGCTCATC-3(正向引物)和5 - - - - - -CCGAAACTCATTCCCTTGGTTG-3(反向引物)LINC00958和5 - - - - - -ATCAGGCTCAGTCGGGGAATA-3(正向引物)和5 - - - - - -TGGTCTCGTGTTCTCTGTTCT-3(反向引物)STAT1和5 - - - - - -CTGGGCTACACTGAGCACC-3(正向引物)和5 - - - - - -AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3(GAPDH反向引物)。他们的专一性和效率。GAPDH(管家基因)被用来加载控制。的相对表达lncRNAs计算使用方法。
2.4。细胞增殖检测
细胞增殖是探索使用细胞计数Kit-8 (Beyotime,中国)探索LINC00958功能的影响。总之,转染细胞被播种到96 - 250年文化板块μ信用证和孵化37°C。接下来,15μL CCK8(噻唑基蓝色)的解决方案是添加到每个好,样本孵化1 h在37°C。微量滴定板阅读器(PerkinElmer、南京、江苏、中国)用于考试的光的吸光度的解决方案。集落形成试验,CAOV3 SKOV3细胞被播种在6-well板块每口井的800个细胞的密度和培养14天。然后,PBS是用来洗盘子。殖民地然后用5%甲醛固定(徐汇技术、南京、江苏、中国)15分钟,与1.0%结晶紫染色15分钟。可见殖民地手工计算。
2.5。细胞迁移试验
的在体外伤口愈合分析用于确定LINC00958的角色在细胞迁移。短暂,SKOV3和CAOV3转染后第一次播种six-well板。开发了一种单层细胞后,超过95%的表面,他们在PBS冲洗两次消除漂浮细胞。接种后的一个晚上,一个是由使用10μL吸管当弟子细胞被注意到。用光学显微镜照片字段之间的差距(0)和48 h。
2.6。细胞入侵检测
48 h转染后细胞resuspended无血清培养基。 细胞接种到上层文化室涂层与基底膜基质。600μL中含有10%的边后卫是transwell放置在众议院。孵化24 h后,细胞被过滤器表面与甲醇进一步固定并与结晶紫染色。三个随机字段选择和图像捕获光显微镜下尼康,浦东,上海,中国。
2.7。细胞凋亡检测
细胞凋亡测定的膜联蛋白V-FITC凋亡工具包(ab14033)从双子座购买技术(浦东、上海、中国)和程序使用标准实验方法如下:细胞转染如上所述,收获和resuspended绑定缓冲(Biomiga,海淀,北京)。80年μL悬浮液加入流式细胞仪收集管和彩色膜联蛋白的使用V-FITC和π。最后,SKOV3和CAOV3细胞的凋亡率检查应用流式细胞分析仪(生物科学、杭州,浙江,中国)。
2.8。荧光素酶报告分析
JASPAR过程进行了初步预测潜在的转录因子结合位点LINC00958的启动子区域。两个LINC00958绑定主题展示。不同的片段序列合成的基因组生物学(南京、江苏、中国),然后插入一个pGL3-basic向量由医生提供林(杭州,浙江,中国)。然后,cotransfection使用上述质粒和pcDNA-STAT1或消极的控制进行。示范的成功整合序列向量被确认使用排序方法。然后,荧光素酶的活动与荧光素酶报告系统检查。
2.9。染色质免疫沉淀反应(芯片)化验
EZ-Magna芯片工具包(EMD微孔)购买和申请后的芯片检测产品的传导指令。SKOV3细胞处理甲醛和孵化10分钟生成dna蛋白质交联。然后,细胞与细胞裂解细胞溶解缓冲区(昆明,云南,中国),进一步使用超声波处理产生的染色质片段250 - 400个基点。抗体包括anti-STAT1(嘉汉生物、海淀,北京)为每个免疫沉淀反应和免疫球蛋白。最后,执行rt - pcr分析沉淀dna。
2.10。统计分析
所有的借助SPSS13.0统计软件进行统计分析使用Windows(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。两组之间的意义与学生的评估 - - - - - -测试。被认为是具有统计学意义的差异 。
3所示。结果
3.1。LINC00958表达式转换端组织和细胞的增加
探索LINC00958是否异常表达在转换端,我们分析了RNA-Seq TCGA的数据使用在线程序,GEPIA。如图1(一),明显高表达LINC00958转换端组织与正常组织相比。为了证明上述发现,我们执行rt - pcr在转换端组织和正常组织从11转换端病人在我们医院:结果表明,曲线端LINC00958水平明显高于正常组织标本( ,图1 (b))。我们进一步确定LINC00958水平四个转换端细胞系,SKOV3, A2780, CAOV3, OVCAR-3,以及在正常乳腺上皮细胞HOSEpiC(图1 (c))。给定一个高水平的LINC00958 SKOV3和CAOV3,我们使用上述两种细胞在体外实验中。我们的研究结果表明,LINC00958水平明显调节曲线端细胞系。总的来说,上述结果显示LINC00958作为中lncRNA转换端。
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3.2。可拆卸的LINC00958抑制曲线端细胞增殖和促进细胞凋亡
在转换端确认LINC00958高度表达。我们组调查其proproliferative功能转换端细胞。使用si-LINC00958 (siLnc-1/2),干扰效率减少LINC00958表情呈现在图2(一个),这表明siLnc-1/2是有效减少LINC00958表达式。功能化验使用CCK-8实验表明,LINC00958击倒抑制细胞增殖SKOV3和CAOV3细胞(图2 (b))。此外,集落形成试验的结果也表明沉默LINC00958明显压抑SKOV3和CAOV3细胞的增殖能力(数据2 (c)和2 (d))。此外,LINC00958是否影响了细胞凋亡的能力进一步探索。如图2 (e)凋亡细胞的比例明显增加LINC00958击倒。探索潜在的机制参与LINC00958-mediated凋亡,我们进行了半胱天冬酶活性测定,3/9以上的差别发现对这些LINC00958晋升半胱天冬酶的表达在SKOV3和CAOV3细胞(图3/92 (f))。这些结果表明,LINC00958影响凋亡的功能通过调节细胞凋亡蛋白酶3/9。总的来说,我们的研究结果提醒LINC00958转换端细胞肿瘤促进剂。
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3.3。沉默的LINC00958抑制曲线端细胞的迁移和入侵
转移,转移疾病从一个到另一个器官或部分,是死于肿瘤和肿瘤发生的主要原因的时候大多数病人的诊断(19]。潜在的机制参与肿瘤细胞的转移仍在很大程度上不清楚。探索是否LINC00958显示功能意义转换端细胞的转移,我们进行了伤口愈合检测和入侵检测。如图3(一个)的数据显示,击倒LINC00958抑制SKOV3和CAOV3细胞的入侵能力。迁移化验的结果表明,细胞SKOV3和CAOV3细胞迁移被明显抑制表达下调LINC00958(数字3 (b)和3 (c))。总的来说,这些结果强调LINC00958作为致癌lncRNA转换端转移的细胞。
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3.4。通过转录因子STAT1 LINC00958调节
已经证实,转录因子参与lncRNAs调制的20.]。生物信息学手段软件,然后,我们使用了“GEPIA”,初步筛选潜在针对LINC00958转录因子。如图4(一),一系列的基因被确定在转换端高度表达,我们的注意力集中在STAT1。然后,LINC00958水平之间的积极关系和STAT1的水平也证实了使用GEPIA(图4 (b))。随后,JASPAR核心数据库进行分析LINC00958的启动子。如图4 (c),我们组获得STAT1和两个结合位点的DNA图案STAT1 LINC00958启动子的预测。证明之前的结果,我们减少或增加STAT1的表达式使用si-STAT1或pcDNA3.1-STAT1 SKOV3细胞和转染效率rt - pcr证实了(图4 (d))。值得注意的是,击倒STAT1的明显抑制LINC00958 SKOV3细胞的水平,而其超表达(图显示一个相反的趋势4 (e))。芯片分析显示,过度的STAT1导致入住率LINC00958轨迹,表明STAT1的绑定LINC00958的启动子区域(图4 (f))。此外,荧光素酶研究的结果也表明STAT1诱导启动子活性LINC00958(图4 (g))。综上所述,我们的结果表明,upregulation LINC00958被STAT1诱导。
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3.5。LINC00958压制Wnt /击倒β连环蛋白信号
先前的研究已经表明,Wnt /β连环蛋白信号会造成不可控的细胞生长和细胞转移(21]。所以,我们组进一步钻研是否异常表达LINC00958 Wnt /活动的改变β连环蛋白信号转换端细胞。rt - pcr和免疫印迹结果表明的表达β连环蛋白、细胞周期蛋白D1和原癌基因mRNA和蛋白水平明显抑制与si-LINC00958转染后相比,转染后siControl(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。我们的研究结果证实LINC00958作为管理者在Wnt /的进步β连环蛋白信号。
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4所示。讨论
转换端是一种非常复杂的疾病,发病机制还不清楚。lncRNAs新兴意义的癌症已经成为一个热点。以前的证据显示,lncRNAs参与肿瘤的生长和转移的调制通过肿瘤抑制的规定或致癌途径(22]。最近,几个lncRNAs和转换端之间的积极关系的报告。例如,lncRNA SNHG20,异常表达lncRNA在一些肿瘤,据报道,促进细胞增殖和转移,因此显示致癌功能转换端细胞(23]。lncRNA LINC00460,发现转换端肿瘤促进监管机构,促进增长和转换端细胞迁移,通过调节mir - 338 - 3 - p (24]。这些发现暗示进一步勘探的潜在功能lncRNAs可能提供新颖的见解,可能有助于提高早期诊断,有效的治疗方法,预后的预测。
在这项研究中,我们发现了一个新的lncRNA LINC00958参与转换端的进展。第一次,我们提供了可靠的证据,LINC00958表达式被执行生物信息学分析和调节在转换端rt - pcr在转换端组织和细胞系。此外,功能化验表明,沉默LINC00958表达导致不同的抑制细胞增殖和转移和加速度曲线端细胞凋亡。这些结果符合临床化验的结果LINC00958积极与远处转移。以前,一些研究也报道了LINC00958作为肿瘤促进剂在几个肿瘤。我们的研究结果提供了更多证据显示cancer-promotive LINC00958转换端上的影响。
最新的,虽然经常失调lncRNAs已被证实在各种肿瘤通过一系列的方法,表达差异的潜在机制lncRNAs基本上仍不清楚。新兴的证据表明,一些转录因子可能参与lncRNAs的激活。例如,赵和李25)表明,过度的lncRNA HCP5被SP1诱导。lncRNA HOXA10-AS表达式被报道是调节在肺腺癌,这upregulation被ELK1诱导超表达(26]。为了探索LINC00958的机制参与过度转换端,我们应用JARSPAR数据库的初步探索可能的转录因子结合LINC00958的推动者,发现STAT1可能的候选人。然后,荧光素酶化验的结果和芯片化验证实LINC00958转录STAT1的目标。上述重要日期表明STAT1激活LINC00958转化表达转换端。
Wnt /β连环蛋白的信号,一个高度保守的途径通过演进,充当一个重要的监管机构影响胚胎发育,细胞极性、分化、和干细胞更新(27]。最近的研究结果揭示了Wnt /至关重要的影响β连环蛋白在免疫调制的调制信号,突出其潜在控制几个癌症的发病机理。此外,Wnt /β连环蛋白激活呈正相关的各种肿瘤的转移性传播,包括转换端(28,29日]。最近,越来越多的研究报道lncRNAs和Wnt /之间的紧密关系β连环蛋白信号。几个功能lncRNAs已被证明通过调制Wnt /显示tumor-controlling角色β连环蛋白信号(30.,31日]。在这项研究中,我们试图探索特异表达是否LINC00958 Wnt /活动的影响β连环蛋白通路。免疫印迹和rt - pcr结果显示,LINC00958击倒的压抑β连环蛋白、细胞周期蛋白D1和原癌基因mRNA和蛋白表达水平,这显然表明Wnt /的活动β连环蛋白通路被抑制。因此,这些发现表明,LINC00958可能显示其调制Wnt /致癌功能β连环蛋白通路。
5。结论
我们首先报道,STAT1-induced upregulation LINC00958提升转换端细胞增殖和转移的epigenetically调制Wnt /β连环蛋白通路。LINC00958重要的预后价值的转换端病人也被证实。LINC00958可能是一个潜在的治疗目标和转换端患者预后的生物标志物。进一步的研究应该进行详细的研究机制参与LINC00958函数。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
敏谢,崔白玉兰的构思和设计实验。敏谢和傅气进行实验和分析结果。敏谢,王心写了手稿。白玉兰崔修订后的手稿。所有作者阅读和批准的内容最后的手稿。
确认
本研究部分支持科技创新人才基金项目哈尔滨(没有。2019 rflxs006)和教育部科学技术研究项目的黑龙江省(没有。2019 ms0137)。