一种锥虫瘤Cruzi.基因组串联重复卫星DNA序列作为LAMP检测诊断南美锥虫病的分子标记

摘要

恰加斯病是一种被忽视的热带疾病锥虫瘤Cruzi.这是整个拉丁美洲的地方病，并通过世界范围的移民传播。目前的诊断仅限于血清学和分子技术，其敏感性和特异性各不相同。本研究旨在开发一种灵敏、适用、经济的环介导等温扩增分子诊断技术t . cruzi（TC-LAMP）。结果导致在寄生虫菌株中确定高度同源的卫星重复区域（231bp），作为诊断疾病的分子标记。正确进行TC灯以检测寄生虫DNA（用于CL烫伤菌株的5FG，DM28，TCVI和TCI菌株50fg）。测定结果证明了来自16种Helminth物种和7种原生动物的DNA的阴性，包括利什曼虫spp. Tc-LAMP基于高度重复t . cruzi因此，卫星区域被认为是一种重要的诊断方案t . cruzi感染，克服其他方法的限制，例如他们的分析能力，速度，以及需要专门的设备或高度培训的人员。在资源有限的区域，可以轻松适用于护理点测试。

1.介绍

美洲锥虫病，或恰加斯病，是一种人畜共患疾病，通常由动质体原生动物引起的慢性寄生虫感染锥虫瘤Cruzi.．世界卫生组织(世卫组织)确认南美锥虫病为20种被忽视的热带病之一[1]及全球13个最具新技术的公司之一[2］．几十年来，恰加斯病被认为是一种严格意义上的农村疾病;然而，社会经济变化、农村人口外流、森林砍伐和城市化已经改变了该疾病的流行病学特征，使其日益成为城市现象和主要公共卫生问题[3.］．这种疾病目前在21个拉丁美洲国家发现，据估计全世界至少有800万人受到感染。迁徙增加了该病的发病率，并已传播到其他大陆[2那4.］．

南美锥虫病诊断依赖于在其中患者被发现是相位。寄生虫血症是在慢性期引起的免疫抑制再活化，在急性期和先天性形式高，以及。该寄生虫可以通过显微术在外周血薄或厚涂片Giemsa染色来检测[5.］．可以通过浓缩技术（如微藻素浓度或剥离）（双离心）方法增加敏感性[6.］．血液培养或异种诊断等技术已经被抛弃[7.］．这种寄生虫有时可以在脑脊液中检测到[8.］．在疾病的慢性阶段(最低限度的寄生虫血症)，直接寄生虫学方法通常证明30%-60%的患者为阴性。因此，在这一阶段的诊断是基于检测抗的血清学t . cruzi免疫球蛋白抗体。

传统的血清学技术(间接免疫荧光(IFI)、间接血球凝集(IHA)和多酶分析(ELISA))使用完全的寄生虫或抗原混合物作为抗原。然而，较少传统的血清学分析使用纯化和/或重组抗原和合成肽。这种技术比直接观察方法更敏感，但涉及不同寄生虫谱系的重组蛋白之间抗原差异相关的低特异性问题[9.］．由于没有可用的血清学检测具有100%的敏感性和特异性，世卫组织通过使用不同方法进行的两项血清学检测呈阳性来确定疾病在慢性阶段的诊断。若上述两项结果不一致，必须进行第三次检测，以确认或排除感染[8.］．差异往往是由于与其他锥虫，包括交叉反应利什曼虫SPP。

检测t . cruziDNA外周血通过聚合酶链反应（PCR）已成为在过去的几年里越来越多的使用，特别规划研究和培训热带病（TDR-WHO）支持的PCR的比较研究国际检测t . cruzi[10］．动质体DNA、卫星DNA重复序列和核糖体RNA基因是最常用的扩增靶标[11］．PCR已被证明在急性期或慢性期再激活中有用，因为它比显微镜方法更敏感[12］．

在慢性期PCR使用是有争议的，因为它使在40％的阳性结果-70％的患者根据寄生虫血症，样品体积，DNA纯化，PCR靶区域，所述程度谁曾被诊断通过常规的血清学方法，study population’s characteristics, and the great genetic variability between the parasite’s discrete typing units (DTUs). Furthermore, a negative result does not exclude infection [13］．

PCR也已被用于跟进治疗效果，以便治疗结束时的阳性结果表明治疗失败[14］．已经开发了实时（定量）PCR（QPCR），使寄生虫DNA检测和量化来自临床样本，尽管具有关于分析可靠性，特异性和灵敏度的非常可变的水平[15-18]，从而阻碍了其在常规临床事务中的标准化应用。这种方法在缺乏资源的流行地区是不可行的，因为这些技术需要先进的设备和合格的人员，而且价格昂贵，使它们无法在资源匮乏的流行地区的实地条件下使用。

因此，诊断南美锥虫病必须使用其他敏感和特异的分子技术，如核酸等温扩增，即环介导等温扩增(LAMP)，这些技术比PCR及其变体更简单、更快、更便宜。这种技术最近被发现是一种有很大潜力在流行地区诊断的替代方法[19-22］．近年来，在诊断南美锥虫病的LAMP新方法方面取得了进展[19］．然而，这类实验室工具仍在开发中，需要更多的试剂和材料，以提高流行地区社区(主要是在第三世界)的诊断价值。本研究旨在开发一种灵敏、适用、经济的LAMP检测方法t . cruzi．

2.方法

2．1．DNAt . cruzi和其他寄生虫

甲的DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Hiden的，德国）根据制造商的说明书用于DNA提取。这t . cruzi本研究使用的基因组DNA (gDNA)来自CL Brener和Dm28体外寄生虫菌株培养，该菌株保存在西班牙格拉纳达大学生物化学和分子寄生虫学系。使用NanoDrop分光光度计(ND-1000)测定两种菌株的DNA，然后用超纯蒸馏水稀释至最终0.5 ng/μl浓度。连续10倍稀释液（ 来 ）从两个t . cruzi然后制备DNA菌株，在-20℃保存至使用。所制备的DNA作为所有LAMP反应的阳性对照，以评价分子检测的分析灵敏度和特异性。

还评估了来自我们实验室中可用的其他几个寄生虫的二十三种DNA样本，用于确定灯测定特异性，包括震颤（曼氏裂体吸虫那埃及血吸虫那肝片吸虫那Amphimerussp。，Dicrocoelium dendriticum,Echinostoma卡普罗尼），Cestodes（膜壳绦虫属diminuta那echinococcus granulosus.那牛带绦虫,t .绦虫)、线虫(Anisakis单纯形那与象皮病pahangi那遗址那Mansonella perstans那类圆线虫属venezuelensis,猪蛔虫)和原生动物(Giardia Intestinalis.那Cryptosporidium parvum.那痢疾阿米巴那疟原虫那间日疟原虫那婴儿利什曼虫,l . donovani）.所有DNA样本浓度用NanoDrop分光光度计(ND-1000)测定，然后用超纯水稀释至最终的0.5 ng/μl浓度并保持在-20°C直至使用。

2.2。设计灯底漆

GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索识别本来可以用于检测证明是有用的可能的序列t . cruziDNA。一旦定位了用于开始分析的序列，它们将以FASTA基于文本的格式保存，以便使用BioEdit Sequence Alignment Editor v7.2.5进行处理和编辑[23］．然后确定序列是否也可在TriTrypDB数据库(http://tritrypdb.org/tritrypdb/)存放完整的t . cruzi基因组。然后使用基本的局部对准搜索工具进行比较序列（BLAST;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）为确定从所述其它特定的同源性和/或差异度锥虫在数据库中可获得的序列。将所得的序列用于设计特异性引物t . cruzi使用LAMP Designer软件进行放大(http://www.premierbiosoft.com/isothermal/lamp.html.）.Thermo Fisher Scientific合成所选底漆。

２.３.灯的检验t . cruzi

LAMP反应混合物(25.2μl）各种含有40pmol FIP和BIP引物，5pmol F3和B3引物，5pmol LB和LF引物，2.5mM DNTPS（内含子），0.8mm MgSO。_4.（新英格兰Biolabs，英国），1米甜菜蛾（Sigma，USA），1x等温扩增缓冲液-20 mm Tris-HCl（pH8.8）和8个U BST聚合酶2.0暖（新英格兰Biolabs，UK），2 μL（1ng）模板DNA。

在0.5 mL微量离心管中进行LAMP反应，在63°C-65°C的加热块(K干浴)中培养30 min、45 min、60 min，以优化反应;升温至80℃，静置5-10 min，酶失活，停止反应。一直使用无菌工具防止DNA污染，每个分析步骤都在单独的工作区域进行，反应管操作被最小化。在每个LAMP反应中，以超纯水替代模板DNA作为阴性对照。t . cruzigDNA(如上所述的10倍连续稀释)也被扩增以确定LAMP检测的低检出限。LAMP检测特异性仅为扩增t . cruziDNA与来自其他寄生虫的23个DNA样本进行了测试。

２.４.检测灯- - - - - -t . cruzi产品

LAMP扩增结果通过添加2可见μL: 1: 10稀释SYBR Green I荧光染料(Invitrogen公司，Carlsbad, California, USA)到反应管中。LAMP阳性反应呈绿色荧光，阴性反应保持原来的橙色荧光。灯产品(3 - 5μL)也用1.5-2%琼脂糖凝胶电泳监测，以确证比色结果。在紫外线下观察凝胶，并使用紫外线凝胶文件系统(Uvitec, UK)拍照。

结果

3．1.LAMP引物设计中分子靶标的寻找和选择

表格1总结文献和数据库分析发现8个分子的目标已经在PCR研究中传统上用于t . cruziDNA或RNA扩增。

tritrypdb数据库（http://tritrypdb.org)，用于BLASTN局部搜索和比对分析[32]验证这些目标序列t . cruzi基因组;将其与不同寄生虫品系进行比较，得到不同程度的同源性(表)2）.

卫星核DNA 195 bp序列[24选择作为在所选序列的硅分析中的灯底漆设计的靶标，并使用Tritrypdb研究其主要特征。This small 195 bp sequence was included in a larger 938 bp one (Tcruzi_30851; TriTrypDB), identical for many strains and highly repeated (up to 9%) in thet . cruzi基因组。此外，PCR扩增对寄生虫DNA分析的敏感性和特异性已在多项研究中得到证实。这个小的195 bp序列被手工扩展到231 bp，以保证LAMP Designer软件支持的最小尺寸的LAMP引物的生产。6个引物(F3、B3、FIP、BIP、LF、LB)分离得到一套单引物。表格3.显示了引物和核苷酸序列的特征。

3.2。设置灯泡测定t . cruzi：TC-LAMP

当将反应混合物在65℃温育60分钟时，获得了Cl Brener和DM28菌株的最佳放大结果和测试再现性。在将Sybr Green I添加到后比例时，清楚地观察到颜色变化，如琼脂糖凝胶电泳中的梯状图案（图1）.

当评估TC灯反应的分析敏感性时，Cl Brener菌株DNA扩增检测限度为5 FG，而DM28应变检测限为50 FG（图2）.

使用非均相DNA样品作为对照，还测试TC-Lamp测定特异性。仅观察使用阳性扩增t . cruziDNA (CL Brener或Dm28)。其他样本的DNA样本没有扩增，因此没有发生交叉反应。比色法测定的阳性和阴性结果清晰可见，琼脂糖凝胶上没有观察到条带的阶梯(图)3.）.

4.讨论

恰加斯病是美洲大陆的一种地方性原生动物病，影响着最贫穷的社区，并已成为许多拉丁美洲国家的公共卫生问题。早期诊断对有效治疗消除寄生虫至关重要。然而，直接寄生虫学和血清学方法在敏感性和特异性方面都存在问题。分子方法是用于扩增的一种替代方法t . cruziDNA。本工作描述了一种基于LAMP技术的检测寄生虫的分子方法(Tc-LAMP)。

利用现有的数据库(TriTrypDB和GenBank)从不同的基因组中选择8个序列t . cruzi用于为灯测定设计有用引物的基因组区域;这些序列以前用于检测t . cruziDNA及其变体的PCR分析[16那26那28］．小的195 bp高重复(高达9%)的核DNA序列t . cruzi基因组[24]被选为硅分析中潜在的扩增靶点。该序列与CL Brener和Tulahuen c12菌株具有100%的同源性。该序列的缺点在于引物设计尺寸小，LAMP Designer软件需要至少200-300 bp才能正常操作。基因组序列包含一个较大的938 bp区域t . cruzi基因组来解决这个问题。因此，选定的序列可以手动扩展到231 bp，几乎是软件的最小尺寸。分析得到一套6条引物，其中包括2条环引物。本研究从这些核重复DNA序列中筛选到一个231 bp的片段，并用于开发LAMP技术t . cruziDNA扩增。

反应条件是根据我们组检测来自其他寄生虫的DNA [33那34］．CL Brener菌株gDNA(一种首次用于测序的菌株t . cruzi基因组）[35[从DM28菌株（2014年菌株测序并用于生化，免疫学，基因表达，细胞生物学和新药开发研究）以及从DM28菌株进行扩增36］．参与国内循环的寄生虫属于CL Brener株，而参与sylvatic循环的寄生虫属于Dm28株。

对于测试的两种菌株的TC灯检测限量不同：Cl Brener的5FG和DM28的50fg。根据其分子差异分布成六组（TCI-TCVI）的DTU之间的变化可能是由于分析敏感性的这种差异。还存在关于其重复序列含量和基因组大小的量的差异，即使在相同的DTU中，菌株中的广泛变化也会变化[37］．因此，CL Brener菌株基因组大小(TcVI)估计为152.12 Mb, Dm28菌株基因组大小(TcI)估计为111.40 Mb。与Dm28菌株相比，CL Brener菌株的卫星DNA更丰富(在我们的测试中具有更高的分析灵敏度)。特异性研究涉及从其他寄生虫中提取的一系列可用的gDNA。16种蠕虫gDNA和7种原生动物cDNA分析结果均为阴性。值得强调的是gDNA检测的缺失利什曼虫物种（杜氏利什曼虫和婴儿利什曼虫）但是，虽然未来的研究将涉及更多的测试利什曼虫种自共感染t . cruzi是经常发生的问题，尤其是在美国大陆的某些地区。此外，锥虫基因组织具有高水平的同步[38那39］．

只有两种LAMP检测方法可用t . cruzi当我们最初开发LAMP检测方法时(两者都是由同一个研究小组开发的)[40那41］．研制了一种特异的LAMP检测方法t . cruzi那t . congolense那t . evansi,t . brucei gambiense在一项研究中，使用用于5.8S rRNA基因内转录间隔区的序列（ITS2）t . brucei gambiense，18s rRNA基因ITS2t . congolense和t . cruzi，和Vsg rotat1.2表面糖蛋白t . evansi[40］．这t . cruzi检测limit was 1 fg using Tulahuen strain DNA (TcVI human strain), such limit being greater than that detected in our assay. However, although specificity was evaluated in that study using gDNA from African trypanosomes and other protozoa, such as弓形虫那焦,贝布西亚，特异性利什曼虫种虫害种类和t . rangeli主要分布在美洲大陆，没有被评估[42］．

目前已经描述了使用灯具进行抑制症的显着进展[19］．然而，这需要增加更多的试剂和材料，从而可以增加生活在流行区域的社区的诊断价值，主要是在第三世界。

5.结论

我们的研究描述了一种特异性LAMP方法(Tc-LAMP)，基于检测不同菌株之间高度重复和同源的卫星区域，用于敏感和特异性的检测t . cruziDNA。结果导致提出该标记/ TC灯法作为Chagas疾病诊断的准确工具，突出了其关于速度的优点，而不是需要专门的实验室设备或对运行此类测试的高度培训人员的需求。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明本出版物不存在利益冲突。

作者的贡献

迭戈Ordóñez和佩德罗Fernández-Soto作为第一批作者做出了同样的贡献。

致谢

Cl Brener和DM28 DNA由Antonio Osuna博士（德拉纳达大学的生物化学和分子寄生虫学部门，格拉纳达，西班牙）提供。婴儿利什曼虫DNA由Pedro José Alcolea博士(生物研究中心- csic，马德里，西班牙)好心提供l . donovaniEnrique博士Martínez(西班牙加那利群岛特内里费大学热带病研究所)。我们还要特别感谢贾森·加里(Jason Garry)对这份手稿的翻译和修改。这项工作由西班牙卡洛斯三世卫生研究所(http://www.isciii.es）（补助：RICET RD16 / 0027/0018（AMA）和PI16 / 01784（PFS）），欧盟FEDER（丰多欧洲人去DESARROLLO区域）“尤娜MANERA德hacer欧洲”计划共同资助，也由TCUE 2018-2020计划欧盟和军政府去卡斯蒂利亚莱昂。我们也想确认由萨拉曼卡大学的前博士生奖学金项目和资金的联合融资由桑坦德银行和军政府的卡斯蒂利亚莱昂预博士博士奖学金计划。

参考文献

1. A. Moncayo和A.C.Silveira，“拉丁美洲的Chagas疾病的当前流行病学趋势以及​​流行病学的未来挑战，监督和健康政策”Memórias做研究所奥斯瓦尔多·克鲁兹，卷。104，LOVEN 1，PP。17-30，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
2. P. J. Hotez, E. Dumonteil, L. wocl - colburn等，"南美锥虫病:美洲新的艾滋病毒/艾滋病"，"PLoS被忽视的热带病，第6卷，第2期5, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
3. K. M.Ninney，“21世纪的Chagas病：公共卫生成功或新兴威胁？”寄生虫，卷。21，p。11，2014年视图:出版商的网站|谷歌学术
4. J. Gascon, C. Bern，和M. J. Pinazo，“西班牙、美国和其他非流行国家的恰加斯病”，Acta Tropica第115卷第1期1-2页，22-27,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
5. M. Flores-Chávez, I. de Fuentes, T. Gárate和C. Cañavate，“进口南美锥虫病的实验室诊断”，EnferMedades Infecciosas YMicrobiologíaClínica， vol. 25, pp. 29-37, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
6. R. G. Strout， "一种集中血鞭毛虫的方法"寄生虫学杂志，第48卷，第48期1962年，第100页。视图:出版商的网站|谷歌学术
7. C. Bern, S. Kjos, M. J. Yabsley, S. P. Montgomery，“美国的克氏锥虫与恰加斯病”，临床微生物学评价，卷。24，不。4，第655-681，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
8. WHO，恰加斯病的控制:世卫组织专家委员会的第二份报告，世界卫生组织，日内瓦，2002年。
9. M. Flores-Chávez，I.Cruz，M.Rodríguez等，“常规和非常规血清学检测对西班牙进口进口的Chagas病诊断”的比较“EnferMedades Infecciosas YMicrobiologíaClínica第28卷第2期5，页284-293,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
10. A. G. Schijman，“克氏锥虫的分子诊断”Acta Tropica，卷。184，pp。59-66,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
11. A. G.Schijman，M. Bisio，L. Orellana等，“国际研究，评估PCR方法，用于检测来自Chagas病患者的血液样本中的血液样本中的滴血管瘤瘤瘤，”PLoS被忽视的热带病，第5卷，第5期。1, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
12. M. L. Gomes，L. M.Galvao，A.M.Macedo，S. D.Pena和E. Chiari，“Chagas疾病诊断：寄生树学，分子和血清学方法的比较分析”美国热带医学和卫生杂志，卷。60，否。2，pp。205-210，1999。视图:出版商的网站|谷歌学术
13. 。C.巴纳比，T.德Meeûs，F. Noireau等人，“_Trypanosoma cruzi_离散打字单元（DTU的）：微卫星DNA和DTU TCV和TCI玻利维亚和秘鲁的群体遗传学”感染，遗传和演化，卷。11，不。7，pp。1752-1760，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
14. i Prat, F. Salvador等，“泊沙康唑和苯硝唑治疗慢性南美锥虫病的随机试验”，新英格兰医学杂志，卷。370，没有。20，第1899年至1908年，2014。视图:出版商的网站|谷歌学术
15. T. Duffy, M. Bisio, J. Altcheh等，“恰加斯病患者血流寄生虫负荷监测的精确实时PCR策略”，PLoS被忽视的热带病，第3卷，第2期。4、2009。视图:出版商的网站|谷歌学术
16. M.派伦，R. FISA，N. Casamitjana等人，“下的实时PCR测定法开发锥虫瘤Cruzi.血液样本的检测，”Acta Tropica号，第103卷。3，页195 - 200,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
17. Y. Qvarnstrom，A. G. Schijman，V.贝隆，C.阿斯纳尔，F. Steurer，和A. J.达席尔瓦，“敏感和特异的检测在使用多靶的实时PCR方法的临床标本克氏锥虫DNA的，”PLoS被忽视的热带病，第6卷，第2期7，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术
18. H. M. Valadares, J. R. Pimenta, J. M. de Freitas et al，“利用巢式PCR多态性微卫星直接在感染组织中分析克氏锥虫的遗传图谱”，国际寄生虫学杂志，卷。38，不。7，第839-850，2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
19. S. A.Beschio，M.Llano Murcia，A.F.Benatar等，“环介导的等温扩增（灯）的分析敏感性和特异性，用于检测人血样中的脑瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤瘤，”PLoS被忽视的热带病，卷。11，不。7日，2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术
20. M. Parida, S. Sannarangaiah, P. K. Dash, P. V. Rao, K. Morita，“环介导等温扩增(LAMP):新一代创新基因扩增技术;传染性疾病的临床诊断展望《医学病毒学评论》第18卷第2期6，页407-421,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术
21. D. H.巴黎，M. Imwong，A. M.法伊兹等人，“环介导等温PCR（LAMP）为恶性疟疾的诊断，”美国热带医学和卫生杂志，卷。77，没有。5，第972-976，2007。视图:谷歌学术
22. 黄永平，S. Othman, Y. L. Lau, S. Radu, cheh . Y.，“环介导等温扩增(LAMP):一种检测微生物的通用技术”，应用微生物学杂志，卷。124，没有。3，第626-643，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术
23. T. Hall，“Bioedit：Windows 95/98 / NT的用户友好的生物序列对齐编辑器和分析程序，”核酸研讨会系列， 1999年第41卷，第95-98页。视图:谷歌学术
24. A.Gonzalez，E.Pregiger，M.E.Huecas，N.Nogueira和P.M.Lizardi，Trypanosoma Cruzi的MicoComosomal重复DNA：它在高灵敏度寄生虫检测测定中使用，“美国国家科学院学报，卷。81，没有。11，第3356-3360，1984。视图:出版商的网站|谷歌学术
25. A. M.西尔伯，J.的Bua，B. M. Porcel，E.L。Segura的，和A. M. Ruiz的，“克氏锥虫：特异性检测寄生虫通过PCR在感染人类和使用一组靶向核DNA序列的引物（BP1 / BP2）载体，”实验寄生虫第85卷第1期3，第225-232页，1997。视图:出版商的网站|谷歌学术
26. J.M. Requena，A.JIMENEZ-RUIZ，M.Soto，M.C.Lopez和C.Alonso的表征，“胰蛋白酶瘤Cruzi的高度重复间隙DNA序列：其在诊断和应变分类中的潜在用途”分子与生化寄生虫学第51卷第1期2，第271-280，1992。视图:出版商的网站|谷歌学术
27. P. Wincker, C. Britto, J. B. Pereira, M. a . Cardoso, W. Oelemann, and C. M. Morel，“使用简化聚合酶链反应程序检测农村流行地区慢性锥虫患者血液样本中的克氏锥虫”，美国热带医学和卫生杂志第51卷第1期6，第771-777页，1994。视图:出版商的网站|谷歌学术
28. R. P.索托和B.津加莱斯，“灵敏检测和由核糖体RNA序列的扩增克氏锥虫的应变分类，”分子与生化寄生虫学，卷。62，没有。1，pp。45-52,1993。视图:出版商的网站|谷歌学术
29. E. M. Novak, M. P. de Mello, H. B. Gomes等，“克氏锥虫核糖体基因间间隔的重复序列”，分子与生化寄生虫学，卷。60，否。2，第273-280，1993。视图:出版商的网站|谷歌学术
30. J. Araya, M. I. Cano, H. B. M. Gomes等人，“克氏锥虫基因组中分散的重复DNA元素的特性”，寄生学第115卷第1期6，pp。563-570,1997。视图:出版商的网站|谷歌学术
31. M. A. Chiurillo, I. Cano, J. F. Da Silveira，和J. L. Ramirez，“原生动物寄生虫克氏锥虫染色体端粒和亚端粒区域的组织”，分子与生化寄生虫学，卷。100，没有。2，pp。173-183,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术
32. S. F. Altschul，W. Gish，W. Miller，E. W. Myers和D. J. Lipman，“基本的本地对准搜索工具”分子生物学杂志第215卷第1期3，第403-410页，1990。视图:出版商的网站|谷歌学术
33. P. Fernández-Soto, J. G. Arahuetes, A. S. Hernández, J. L. Abán, B. V. Santiago, A. Muro，“一种用于早期检测粪便样本中曼氏血吸虫的环介导等温扩增(LAMP)方法:鼠模型中的诊断方法”，PLoS被忽视的热带病，卷。8，不。9，2014年视图:出版商的网站|谷歌学术
34. J. Gandasegui, P. Fernández-Soto, C. Carranza-Rodríguez等，“快速热lamplet方法:人类泌尿生殖系统血吸虫病的潜在诊断方法”，PLoS被忽视的热带病，第9卷，第5期。7日,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术
35. 新M. El-Sayed, P. J. Myler, D. C. Bartholomeu et al， "南美锥虫病原科克氏锥虫的基因组序列，"科学号，第309卷第2页，第2 - 3页，2005。视图:出版商的网站|谷歌学术
36. E. C. Grisard, S. M. R. Teixeira, L. G. P. de Almeida等，“克氏锥虫克隆Dm28c基因组草图序列”，基因组的公告，卷。2，不。2014年1日。视图:出版商的网站|谷歌学术
37. R.T.Souza，F.Milea，R. M.Barros等，“基因组大小，核型多态性和锥形瘤Cruzi的染色体演进”，《公共科学图书馆•综合》，第6卷，第2期8, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术
38. E. Ghedin, F. Bringaud, J. Peterson等，“锥虫基因组结构的基因共同性和进化”，分子与生化寄生虫学第134期2，页183-191,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术
39. L. L. Naves, M. V. da Silva, E. F. Fajardo等，“DNA含量分析可区分克氏锥虫和朗格里锥虫，”《公共科学图书馆•综合》，第12卷，第2期12日,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术
40. O. M. Thekisoe, N. Kuboki, A. Nambota等，“用于诊断锥虫病的种特异性环介导等温扩增(LAMP)”，Acta Tropica第102卷第1期3，页182-189,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术
41. O. M. Thekisoe, C. V. Rodriguez, F. Rivas等，“通过环介导等温扩增(LAMP)检测淡色罗氏锥虫克氏锥虫和朗氏锥虫感染”，美国热带医学和卫生杂志，卷。82，没有。5，PP。855-860，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术
42. K. A. M. Ferreira, E. F. Fajardo, R. P. Baptista等，“克氏锥虫和rangeli锥虫的鉴别诊断和rangeli锥虫的多态性检测的物种特异性标记”，寄生学研究，第113卷，第113期。6、pp. 2199-2207, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术

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