勘探乳腺癌血液生物标志物：死亡相关蛋白激酶1（DAPK1），其为潜在的候选

摘要

背景．乳腺癌是全世界女性中最常见的恶性肿瘤。据估计，乳腺癌每年影响约150万妇女，是妇女中与癌症有关的死亡人数最多的原因。2018年，乳腺癌死亡人数为62.7万，约占女性癌症死亡人数的15%。在加纳，乳腺癌是癌症死亡的第二大原因，每年发病率为2,900例;患有这种疾病的8名女性中有1人死亡。这推动了改善早期检测、治疗和/管理的斗争。因此，我们研究了死亡相关蛋白激酶1 (DAPK1)作为乳腺癌生物标志物的潜力。作为一种肿瘤抑制因子，它的表达被多种致癌物激活，从而影响细胞凋亡、自噬、免疫反应和增殖的通路。目标.研究DAPK1作为乳腺癌血液生物标志物的作用。方法。收集并处理被诊断为乳腺癌的参与者和健康对照者的血样，以获取血清。从文件夹中检索年龄、治疗、诊断和病理编号的信息。病理编号用于检索KBTH病理科患者的乳腺组织块。组织块切片，用抗DAPK1进行免疫组织化学染色，用苏木精进行复染，以确定DAPK1的表达水平。使用商用抗DAPK1 ELISA试剂盒对血清中的DAKP1水平进行定量。使用单向方差分析和卡方检验对病例组和对照组的平均值进行比较。统计显著性设置为 ．结果与讨论．乳腺癌患者的血清和乳腺组织的DAPK1水平高于对照。增强的DAPK1表达可以被解释为一种应激反应生存机制，以修复由癌变协调的细胞中正在发生的有害事件。在丰富的DAPK1存在下，细胞的增殖力（癌癌和非癌症）增加。这可以解释为什么高DAPK1表达强烈地与腐蚀性乳腺癌表型相互作用，如ER阴性乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌（TNBC），这是最具侵略性，快速增长和高度转移的。结论．在乳腺癌患者的血清和乳腺组织中，DAPK1的表达高于非乳腺癌患者。在循环而不是在乳腺组织表达升高DAKP1的使得它用作血液生物标志物和在药物开发的治疗靶点的潜在用途的候选者。

1.介绍

世界卫生组织（WHO）2018年报告指出，癌症是导致死亡的第二大原因在全球占960万组的死亡和进一步指出，近1/6的死亡人数在全球是由于癌症约70这些死亡％的低发生- 和中等收入国家的[1］．乳腺癌是女性世界上最常见的癌症。据估计，每年大约影响210万妇女和负责妇女癌症相关死亡的人数最多。在2018年乳腺癌死亡率独自站在627000名妇女代表妇女[所有癌症死亡的大约15％2，3.］．目前，在全球几乎所有区域，乳腺癌发病率和死亡率都呈现令人担忧的上升趋势。这与过去世界上较发达地区的女性享有的特权截然不同[4］．然而，尽管总的来说，发展中国家的乳腺癌发病率(每10万名妇女的病例数)仍低于发达国家，但与发达国家相比，发展中国家的乳腺癌死亡率较高[5- - - - - -7］．

特别是在非洲的发展中国家，乳腺癌的发病率增加了，这与早先的报告不符[8］．在许多国家的疾病已超过子宫颈癌是最常见的癌症在非洲妇女[9，10.]通过从加纳[报告所示例11.，12.)、尼日利亚(13.]，和乌干达[14.］．据世卫组织2012年报告，仅加纳一地就有约2000名加纳妇女被诊断患有乳腺癌，其中1000人(50%)死亡。目前，乳腺癌已被确定为加纳第二大癌症死亡原因，每年发生2900例，8名患此病的妇女中至少有1人死亡[2，15.］．

这种疾病在发展中国家的高死亡率主要是由于诊断晚和治疗难。为了改善乳腺癌的预后和生存率，早期发现至关重要。生物标志物已经证明了它们在预测疾病发病率、疾病进展和疾病结局方面的有用性。死亡相关蛋白激酶1 (DAPK1)是一组激酶的一部分，如DAPK2、DAPK3、DAP激酶相关凋亡诱导蛋白激酶1 (DRAK1)和DRAK2 [16.]位于9号染色体第3区4.1亚区长臂上，是一种钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶，参与多种细胞信号通路，触发死亡、自噬和细胞存活[16.］．DAPK1是一种由钙通过p53依赖途径调节的蛋白，用于刺激死亡信号[17.- - - - - -19.］．它编码结构独特的160kD蛋白，由8个锚蛋白重复和2个假定的p -环共识位置组成。它是一种肿瘤抑制蛋白或候选肿瘤抑制蛋白[20.］．

物理，这刺激DAPK1化学和生物致癌物通过P14 / p19ARF基因通路，经由SER 308和p53的去磷酸化的活化增加该蛋白的表达，其导致程序性细胞死亡（细胞凋亡），自体吞噬，免疫反应，和增殖21.，22.］．DAPK1的作用可以根据小区设置改变。细胞生长是由通过DAPK1的TSC1 / TSC2复合物形成中mTOR途径的调制调节。TSC1和TSC2导致上调的细胞生长和蛋白质合成和由此确保生存和死亡之间的信令体内平衡平衡的磷酸化。然而，p53突变细胞中，p53的防止DAPK1从诱导细胞凋亡的功能障碍，而是从向细胞凋亡生长途径的激活转移其功能。赵和他的同事[16.]已经报道，在p53野生型中，DAPK1调节凋亡，但在p53突变设置中改变作用，并成为促增殖的，因此其在不同癌症中的表达模式不同。该报告表明某些癌症，如卵巢癌和胰腺癌对DAPK1抑制剂的敏感性。因此，研究DAPK1及其在乳腺癌中的功能相关性是值得的。本研究关注的是DAPK1作为乳腺癌预后血液生物标志物的有效性及其在化疗中的可靠性。

2.材料和方法

2．1.研究参与者

参与者是在加纳阿克拉Korle-Bu教学医院(KBTH)临床诊断为乳腺癌的妇女。对照组是在同一设施及其周围环境中显然健康的个人。

2.2。样本采集程序

2.2.1。血液样本

血液（5 （毫升）从Korle Bu教学医院外科化疗室的同意参与者中抽取，在患者的常规治疗期间，使用给药套管穿刺患者静脉。这是在给药之前完成的，以防止参与者静脉双重穿刺由指定的护理人员准备。血样收集到血清分离管中，在室温下凝固，并在2500℃下离心 将血清收集到新鲜试管中，并在-20°C下储存，直至使用。总共有32名乳腺癌患者和32名明显健康的女性分别作为病例和对照参与了该研究。

2.2.2。乳房组织活检

在患者的医院文件夹(患者的临床记录)中记录患者的病理报告中的病理标识号，并从医院病理学处追踪并检索归档的乳腺活检组织块和苏木精伊红染色组织切片。对取出的H&E染色的组织切片进行筛选，并由病理学家确认肿瘤分级。将H&E染色的组织玻片制备相应的石蜡包埋组织块进行切片，得到4μM厚组织切片，置于聚赖氨酸涂层玻片上。

2．3.酶联免疫吸附试验(ELISA)

将储存的血清检索并使其在室温下解冻。遵循制造商的说明，洗涤了抗DAPK1（中华民国Genway Elisa套件）的ELISA板的井被洗涤，以调节抗原 - 抗体相互作用。100. μ将1XPBS轻轻分散在孔中，轻轻摇晃30秒，然后滗出。进一步的干燥使用滤纸或垫。在这之后,50μl的样品和标准品移入预先涂有抗dapk1的指定ELISA板孔。将样品加入到井中针对DAPK1的辣根过氧化物酶标记的识别抗原中，37℃孵育1小时。每孔加入TMB底物溶液，孵育10分钟;之后，在每口井中加入停止液。用分光光度计在450nm处测量光密度(OD)。根据标准曲线测定DAPK1浓度。

2.4。组织科治疗及免疫组化

组织切片在50°C(5分钟)和二甲苯(5分钟)中脱蜡。他们随后被放入等级降低的乙醇中;绝对的，90% 70% 50% 40% 25%，最后变成水。柠檬酸缓冲液( ）随后用于抗原提取。装有1x柠檬酸盐缓冲液的科普林瓶在热板上的压力锅中加热到沸点。在沸点时，打开高压锅，将水合组织切片转移到高压锅内的府绸罐中，并将盖子固定。当炊具达到最大的压力时，让coplin坛子和里面的东西沸腾5分钟，之后关掉暖气，放在一个空水槽里。随后，压力阀被释放出来，冷水流过了炊具。一旦减压，盖子就被打开，让它静置并冷却，然后幻灯片被移走并转移到蒸馏水中。

为抑制内源过氧化物酶活性，将冷却后的组织切片用3%过氧化氢溶液(H₂O₂)在室温下静置10分钟。切片之后用1XPBS彻底清洗。随后，用牛血清白蛋白(BSA)进行阻断。切片在室温下用BSA覆盖10分钟，用1XPBS冲洗。然后将组织切片与一级抗dapk1溶液(博斯特生物技术有限公司，中华民国)在室温下孵育5小时。以1XPBS为稀释剂，抗dapk1溶液稀释倍数为1:50。切片在孵育期后用1XPBS冲洗，然后在室温下用生物素化二抗孵育20分钟。切片用1XPBS再次冲洗，并在室温下用辣根过氧化物酶结合链霉亲和素(HRP)(博斯特生物技术有限公司，中华人民共和国)溶液处理10分钟。然后将DAB基板溶液涂在切片上进行显色。组织切片用自来水彻底冲洗，并用Mayer 's苏木精(Sigma-Aldrich，德国)进行反染色，并用DPX (Gain Chemical公司)安装。

2．5．免疫组织化学评分

评分由两位独立专家使用奥林巴斯光学显微镜(奥林巴斯CX31，型号CX31RBSF)进行。评分依据显微镜下DAB反应在组织切片上的显色强度。无DAB反应的切片评分为0(0)，轻度反应的切片评分为+1，中度染色反应的切片评分为+2，反应强烈的切片评分为+3。32例招募的乳腺癌患者对应的32例组织活检被成功地提取、切片和染色。此外，32例已被确认为非乳腺癌的乳房活组织检查被随机选择作为对照(非乳腺癌)和作为比较。切片的照片是用安装在奥林巴斯显微镜(型号BX51 TF)上的奥林巴斯数码相机(型号DP20)拍摄的。

2.6。统计分析

采用SPSS 23软件进行统计学分析。用描述性统计方法总结数据。学生的 -使用检验和单因素方差分析比较分组定量数据的平均值。使用卡方检验比较分类数据。在所有分析中，值≤0.05为有统计学意义。值表示为 到小数点后两位。

2.7.道德认可

的机构审查委员会(IRB) Korle-Bu教学医院伦理审查委员会和协议的生物医学和盟军的健康科学学院,健康科学学院,加纳大学的批准进行研究与间隙数字STC / IRB和MD / 000100/2016 / 10550649 / AA / 5 a / 2016 - 2017,分别。

3.结果

３．１．参与者的人口统计和临床信息

六十四（64）的参与者被招募;32名乳腺癌患者（例）和32个健康个体（对照组）。所有的参与者为女性生活加纳及其周围的大阿克拉地区内。乳腺癌病例中，10例小商人，15人失业，7个政府工作人员（表1）．他们的平均年龄为45岁，而正常对照组为40岁。浸润性导管癌是通常被诊断的（94％）乳腺癌类型，以及优势肿瘤等级为II级。30种诊断浸润性导管癌的，8（25％）已经历乳房切除术而剩余的24（75％）没有。

３.２．血清中DAPK1的表达

乳腺癌患者血清中DAPK1的表达显著高于对照组，为4.95 ( ）Ng /ml和3.49 ( ）ng / ml,分别值为0.039(表2）．通过比较已经接受治疗的乳腺癌患者之间的DAPK1表达模式，进一步分析(治疗)及尚未接受治疗者(预处理）．32例中，17例被分类为“治疗“和15”预处理”。从表2,虽然治疗组血清DAPK1表达略高于对照组预处理组间差异无统计学意义。

3.3.乳腺组织活检中DAPK1的表达

免疫组化染色的乳腺组织切片由两名合格的专家评分。在染色强度方面，观察者之间没有差异。表格3.和图1显示了乳腺癌(病例)和非乳腺癌(对照)活检中DAPK1的表达水平。与非乳腺癌活检相比，乳腺癌活检中DAPK1水平显著升高( ）．

4.讨论

我们之前报道过，与非乳腺癌患者相比，乳腺癌患者存档血清样本中DAPK1升高，因此该蛋白与加纳人侵略性乳腺癌表型相关[23.].为进一步推进早期报告，我们提出了一项前瞻性研究的结果，该结果证实了我们早期的报告，并加强了我们对DAPK1及其作为潜在生物标记物的可靠性的看法。我们报告乳腺癌患者血清和乳腺组织样本中的DAPK1表达水平高于非BRE患者ast癌症对应物。

在生理学上，DAPK1的表达被几种致癌物激活，从而影响导致凋亡、自噬、免疫反应和增殖的细胞途径[21.，22.］．DAPK1作为肿瘤抑制因子调节自噬和凋亡(γ -干扰素诱导程序性细胞死亡的中介)，从而在内质网应激诱导的凋亡通路中扮演重要角色[24.，25.]。在此背景下，DAPK1表达增加提示可能对人体细胞产生致癌损伤。因此，与对照组相比，本研究中的乳腺癌患者记录到DAPK1表达升高。DAPK1血清水平增加可能是乳腺癌细胞内干扰的指征分子水平的患者[23.］．患者乳腺组织中高水平的蛋白质证实了这一点(见表)3.和图1）．增强的DAPK1表达可以被解释为一种应激反应生存机制，以修复由癌变协调的细胞中正在发生的有害事件。在试图促进分子紊乱的乳腺细胞凋亡和自噬的过程中，机体提高了DAPK1的表达。这是一个积极的行动，以清除组织中的紊乱细胞。然而，在系统中丰富的蛋白质，虽然是需要的，却带来了不希望的伴随结果，包括促增殖的细胞活动。癌细胞有缺陷的细胞控制机制，因此具有高增殖和生长速率的特点。在丰富的促增殖DAPK1存在下，细胞(包括癌细胞和非癌细胞)的增殖能力增加[24.］．这可能解释了为什么DAPK1高表达与侵袭性乳腺癌表型(如er阴性乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌(TNBC))密切相关[26.，它们是侵袭性最强、生长速度最快、转移性最强的病毒[16.，27.］．但是，该报告没有包括乳腺癌患者的ER、PR、Ki67、HER2等信息，因为这些信息不容易获得。这可能是进一步研究的课题。

根据免疫组化结果(表3.和图1)，来自乳腺癌患者的组织切片往往有升高的DAPK1表达。75%(32例中24例)的癌组织呈DAPK1阳性，而对照组中只有13%(32例中4例)呈阳性。大约88%(32例中有28例)的非乳腺癌组织样本显示DAPK1阴性，相比之下，25%(32例中有8例)的癌症组织样本显示DAPK1阴性。这表明，通常情况下，细胞和组织中的DAPK1水平可能相当低，因此只有在面对基因组侮辱或细胞扰乱时才会升高。然而，乳腺癌患者和对照组的血清中DAPK1水平相对较高，尽管对照组明显低于乳腺癌患者。值得注意的是血清和组织活检中DAPK1水平的差异，因为DAKP1似乎在循环中比在乳腺组织中更丰富。这提高了它作为一种无创血液生物标志物的潜力。

32例乳腺癌中，1例为ⅰ级，25例为ⅱ级，4例为ⅲ级2)和2个未评分。4个III级样本均显示DAPK1表达升高。其中2例为中等染色反应(评分+2)，2例为强染色反应(评分+3)。优势的II级组织标本显示轻度染色反应(评分+1)。在我们以前的报告中[23.]， DAPK1与肿瘤分级之间的关系尚未确定。从目前这项研究的观察来看，两者之间似乎存在关联，即DAPK1表达随着肿瘤分级的增加而增加。同时，88%的非癌组织样本没有染色反应(评分0)。

为了DAPK1作为无创生物标志物的可靠性，我们评估了化疗对乳腺癌患者血清DAPK1表达的影响。A“治疗研究小组的成员在加入研究之前已经接受了乳腺癌化疗，同时预处理组的参与者虽然被诊断出患有乳腺癌，但没有接受化疗。“治疗该小组已经在服用阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇、曲妥珠单抗和5-氟尿嘧啶等药物；这些药物旨在通过细胞凋亡破坏组织中的肿瘤细胞和血液中的转移癌细胞[28.，29.］．从表2，即使DAPK1的表达在治疗"组与"预处理组，差异无统计学意义。从结果来看，化疗药物似乎不影响DAPK1的表达。这可能是由于药物在服用后会被身体迅速降解。我们的观察证实了吕和朱的报告[30.比较了血清中有希望用于胃癌早期检测的非侵袭性生物标志物。根据上述观察，DAPK1有潜力作为监测乳腺癌患者化疗反应中的肿瘤负担的一种经济有效的手段，在这个方向的进一步研究将是有益的。

总而言之，肿瘤中DAPK1表达的增强可以被解释为一种应激反应生存机制，以修复由癌发生协调的细胞中正在发生的有害事件。与对照组相比，DAKP1在乳腺癌患者样本中高表达。比较表达水平，与乳房组织活检相比，该蛋白在血清中高度丰富。此外，化疗不会干扰DAKP1的表达水平，因此使该蛋白相当稳定和可靠。DAPK1可能作为乳腺癌的血液生物标志物有潜在的应用前景，也有开发新的治疗策略的前景。如果表达增加与侵袭性肿瘤相关，那么，靶向DAPK1可能也是一种减少肿瘤侵袭性和进展的治疗方法。

5.结论

在乳腺癌患者的血清和乳腺组织中，DAPK1的表达高于非乳腺癌患者。该蛋白的表达似乎与肿瘤分级有关，因此随着肿瘤分级的增加而增加。此外，血清中DAPK1水平比乳腺组织活检中相对较高。DAKP1在循环而非乳腺组织中的表达升高，使其成为血液生物标志物的候选者，并为开发新的治疗策略提供了前景。随着观察到与乳腺癌相关的DAPK1表达增加，该蛋白很可能成为治疗的靶点，并可能作为肿瘤侵袭性和疾病预后的生物标志物。在这一方向的进一步研究将是有见地的。

数据可用性

本研究中生成和分析的所有数据均包含在本文中。

的利益冲突

作者声明他们对这份手稿没有利益冲突。

作者的贡献

BAB，包，和SM概念化。BAO，ARA，BAB，吃饭，人民币和NAA被分配在设计，数据产生和数据分析。RKG，ANAA，NAA，BAB，吃，EDAO被分配的稿件发展。所有作者严格审查并同意最终的文本。

致谢

我们感谢Korle-Bu教学医院外科和化疗科的工作人员，他们在招募病人和采集血样方面给予了极大的帮助。我们还要感谢加纳大学生物医学和联合健康科学学院病理系的工作人员，特别是Daniel Potakey先生、Emmanuel Ametepe先生、Andrews Hooper先生、Maxwell Akanburichaab先生、Cecelia Krampah女士、Dinah Neequaye女士、Jonathan Kofi Adjei先生帮助组织块检索和处理。加纳大学生物化学、细胞和分子生物学系的实验室成功地进行了实验室实验，我们感谢教职员工和所有支持人员(行政和实验室)，他们帮助这个项目取得了成功。

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