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李记者陈Huibing王濛Linqi杨,飞飞谅解备忘录,Bhupinder辛格Jing-Yu他(音译), ”6,12-Diphenyl-3 9-diazatetraasterane-1 5 7 11-tetracarboxylate抑制增殖,迁移和促进在卵巢癌细胞凋亡”,疾病标记, 卷。2020年, 文章的ID5068067, 9 页面, 2020年。 https://doi.org/10.1155/2020/5068067
6,12-Diphenyl-3 9-diazatetraasterane-1 5 7 11-tetracarboxylate抑制增殖,迁移和促进在卵巢癌细胞凋亡
记者陈,1 Huibing王,1 孟李,1 Linqi杨,1 飞飞谅解备忘录,2 Bhupinder辛格,3 Jing-Yu他
,4
和
(音译)1
1基础医学院药理学系、河北中医药大学,石家庄050200河北,中国
2石家庄石家庄医学院护理学系,050500年河北省,中国
3基础医学学院、河北医科大学、石家庄050017河北,中国
4化学工程学院,石家庄大学,石家庄050035河北,中国
文摘
6,12-Diphenyl-3 9-diazatetraasterane-1 5 7 11-tetracarboxylate (DDTC)合成的光二聚4-phenyl-1, 4-dihydropyridine-3 5-dicarboxylate。theercvantitumor活动和机制研究的潜力在体外用MTT试验在人类肺癌细胞株A549,卵巢癌细胞系SKOV3和A2780乳腺癌细胞系MCF-7,胃癌细胞株bgc - 823,结肠癌细胞系HT29,前列腺癌DU145细胞行,和肝癌细胞SMMC7721行。结果表明,DDTC可以抑制卵巢癌SKOV3和A2780细胞的生长。最好的集成电路50价值大约是 和 μM,分别。DDTC诱导细胞周期阻滞在G2期流仪分析。迁移和入侵A2780和卵巢癌SKOV3细胞被DDTC抑制。DDTC可能增加A2780细胞钙粘蛋白的表达蛋白质水平和提升表达蛋白质和钙粘蛋白mRNA水平SKOV3细胞。DDTC也可以减少蛋白质和mRNA的表达EMT (epithelial-to-mesenchymal产品化)标记N-cadherin和波形蛋白。信使rna和蛋白质表达水平的检查点激酶1 (Chk1)明显增加,细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1)的表达和细胞分裂周期25 (Cdc25a) SKOV3和细胞系A2780的下降。此外,DDTC解理和激活诱导细胞凋亡的半胱天冬酶3和半胱天冬酶9。
1。介绍
6的结构,12-diaryl-3 9-diazatetraasterane-1 5, 7日11-tetracarboxylates(图1)已被合成为治疗剂抑制hiv - 1蛋白酶的活动(1,2]。然而,3的抗肿瘤效果,9-diazatetraasterane癌症(DDTC)和底层机制仍然未知。我们与DDTC调查影响合成抗肿瘤活动和DDTC的影响在人类癌的细胞的增殖和凋亡。
2。材料和方法
2.1。试剂和化学物质
胎牛血清(的边后卫)获得HyClone(美国),和RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所)1640中、DMEM(杜尔贝科的修改鹰介质),青霉素、链霉素和所有其他试剂获得Gibco(美国)。DDTC,合成化学工程学院,石家庄大学在DMSO溶液溶解,最后在文化≤0.1% DMSO溶液的浓度( )。
2.2。细胞培养
人类肺癌细胞株A549,人类乳腺癌细胞系MCF-7、人胃癌细胞株bgc - 823,卵巢癌细胞系SKOV3和A2780人类肝癌细胞株smmc - 7721,大肠癌HT29细胞,和前列腺癌DU145细胞在RPMI1640培养介质与10% ( )的边后卫和青霉素(100 U /毫升)/链霉素(100毫克/毫升)在37°C moisture-saturated大气中含有5%的股份有限公司2。
2.3。抗增殖活性分析
简而言之,人类肺癌A549细胞,卵巢癌SKOV3和A2780细胞,乳腺癌MCF-7细胞,胃癌bgc - 823细胞,结肠癌HT29细胞,前列腺癌DU145细胞和肝癌细胞SMMC7721被播种到96 - 24孔板,48岁,分别和72小时37°C。一个抗MTT法进行测定。(3)测试是重复三次。
2.4。迁移和入侵检测
SKOV3和RPMI1640 A2780细胞培养介质与2%血清伴随着0.1,1,10μM DDTC 48 h。迁移的能力是通过吸管清除伤口愈合实验提示(10毫升)。superculture室(美国康宁公司)与BD人工基底膜矩阵(美国纽约BD生物科学)是用于Transwell化验。这些细胞被沾0.5%甲紫(西格玛奥德里奇),评估由数字医学图像分析系统(德国徕卡DM2500)和光学显微镜(德国徕卡DMIL-PH1)。
2.5。流式细胞术分析
SKOV3和A2780细胞暴露在0.1,1,10μM DDTC 48 h。这些细胞被收获(胰蛋白酶化和离心)和75%乙醇固定。接下来,50μg / ml propidium碘在孵化phosphate-citrate缓冲区(pH值7.2)。通过流式细胞术细胞DNA含量测定使用FACSCalibur系统(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)对细胞周期进展评估。
2.6。免疫印迹分析
SKOV3和A2780细胞治疗与DDTC 0.1, 1, 10μM 48 h。与PBS三次洗涤后,30分钟的细胞细胞溶解冰和离心机在10000 g×5分钟在4°C。种族隔离的蛋白质在细胞溶解产物被量化的内容用nd - 1000分光光度计(美国特拉华州威尔明顿NanoDrop,)。等量的蛋白质样本隔离通过10% sds - page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,马萨诸塞州,美国)。5%的奶块2 h后,免疫印迹一夜之间完成了初级抗体在4°C。主要的抗体包括Cdc25a (AF6252 1: 300稀释),CDK1 (ET1605-54 1: 300稀释),Chk1 (et1609 - 71, 1: 300稀释)、波形蛋白(ab92547 1: 3000稀释),N-cadherin (AF4039 1: 500稀释),钙粘蛋白(AF0131 1: 500稀释),半胱天冬酶3 (ET1602-39 1: 500稀释),半胱天冬酶9 (AF6348 1: 500稀释),裂解半胱天冬酶3 (AF7022 1: 500稀释),裂解半胱天冬酶9 (AF5240 1: 500稀释)β肌动蛋白(AC026 1: 10000稀释)。接下来,膜与二次孵化山羊anti-rabbit IG的抗体(kpl074 - 1506, 1: 5000稀释)1 h在37°C。通过执行融合蛋白带的强度估计FX5光谱(融合、法国)。
2.7。实时荧光定量PCR (Q-PCR)
根据制造商的指示(日本基因有限公司、东京、日本),总RNA从SKOV3和A2780细胞采购,接受DDTC 48小时。在260纳米光谱光度测量的量化后,总RNA(1毫克)被转化成cDNA反向援助合成第一链cDNA工具包(美国热科学有限公司)。使用反应混合物(20μl)的实时PCR系统(骏有限公司有限公司、日本)包含cDNA、引物(表1)和铂SYBR绿色Q-PCR超级Mix-UDG(表达载体,生活技术有限公司、美国)。相对基因表达是using2计算- - - - - -ΔΔCt方法,如前所述。(3]
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3所示。结果
3.1。抗增殖活动DDTC
DDTC的抗增殖活动在人类肺癌细胞A549评估,卵巢癌细胞SKOV3和A2780,乳腺癌细胞MCF-7,胃癌细胞bgc - 823, HT29结肠癌细胞,前列腺癌DU145细胞、肝癌细胞SMMC7721在体外。表2显示的是集成电路50DDTC不同癌症细胞系24 h, 48 h,分别和72 h。结果,DDTC对SKOV3的生长的影响和A2780为48 h强于那些A549细胞,HT29, MCF-7, bgc - 823, DU145, SMMC7721细胞(表2)。所以,我们选择SKOV3和细胞系A2780进行后续实验。
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3.2。在卵巢癌细胞DDTC对迁移的影响
伤口愈合和Transwell试验探讨了DDTC机械研究卵巢癌细胞系。显著不同的结果表明,复合DDTC抑制卵巢癌SKOV3和A2780细胞迁移,分别(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。DDTC对EMT在卵巢癌细胞标记
EMT是上皮癌传播的关键因素包括癌症迁移,入侵,并通过血液运输/淋巴管肿瘤。(4)许多信号通路参与EMT的进展,如Wnt /β连环蛋白、TGF基质金属蛋白酶,Notch信号通路。(5)结果表明,DDTC可以调节蛋白表达水平下调表达的蛋白质和钙粘蛋白和mRNA水平N-cadherin A2780和SKVO3细胞波形蛋白,以及移植mRNA表达A2780的上皮细胞(图3)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。DDTC对细胞周期进程的影响
细胞的增殖与细胞周期密切相关。MTT测定的结果提供了第一个DDTC的抗增殖效果的证据,所以我们用流仪分析评估是否DDTC诱导细胞周期阻滞。根据流量仪的结果分析,DDTC增加了在G2期细胞群SKOV3和A2780细胞(图4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。监管机构DDTC对细胞周期的影响
Chk1 Cdc25a, CDK1被证明是与细胞周期阻滞,从而调节细胞增殖。与细胞周期蛋白CDKs控制细胞进程绑定。细胞周期蛋白B1诱导细胞周期G2的M阶段CDK1的激活。Cdc25a是细胞增殖的重要调节器。Chk1导致DNA损伤通过抑制Cdc25a活动(6,7]。如图5,CDK1的表达、Chk1和Cdc25a蛋白质和信使rna通过免疫印迹和Q-PCR表明DDTC可以减少Cdc25a的表达和CDK1 Chk1和增加,这是符合G2逮捕DDTC引起的。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。DDTC Apoptosis-Relevant蛋白质的影响
细胞凋亡是一个基因调控过程的细胞自杀,这是由各种细胞信号通路的调节。凋亡机制的中心组件组成的蛋白水解系统还存在(8]。因此,我们用免疫印迹和Q-PCR分析DDTC-induced细胞凋亡的机制。DDTC治疗的效果还存在的表达还存在3和9和裂解3和9也检查了。DDTC减少半胱天冬酶3和9蛋白质和mRNA的表达,但增加了表达裂解半胱天冬酶3和9蛋白质和信使rna(图6)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
在这项研究中,我们提供了DDTC的抗肿瘤效果的证据。首先,我们选择了一些人类癌症细胞行包括肺癌细胞株A549,卵巢癌细胞系SKOV-3 A2780,乳腺癌细胞系MCF-7,胃癌细胞株bgc - 823,结肠癌细胞系HT29,前列腺癌DU145细胞行,和肝癌细胞株smmc - 7721确认DDTC是否能抑制癌细胞的生长。根据MTT测定的结果,DDTC的抑制作用卵巢癌的扩散是更有效的比上面提到的其他癌症。
因此,我们进一步研究DDTC的抗癌机制。
癌细胞的迁移细胞的增殖密切相关,所以我们使用了伤口愈合和Transwell化验检测DDTC迁移和入侵的影响。这些证实DDTC抑制迁移符合增加钙粘蛋白的蛋白表达水平和减少EMT标记的蛋白质和信使rna表达水平(N-cadherin和波形蛋白)在卵巢癌细胞。
MTT检测结果提供了第一个证据DDTC的抗增殖作用。流仪分析表明,DDTC诱导细胞周期阻滞在G2期A2780和SKOV3细胞。CDK1是一个关键调节器的细胞周期检查点。激活CDK1至关重要的细胞周期G2 M的过渡阶段。(3,6同时Cdc25a] Chk1抑制Cdc25a活动促进激活CDK1 [7,8]。我们的结果表明,DDTC Cdc25a的表达水平降低和CDK1 Chk1表达增加。
检查点诱导细胞周期阻滞,细胞DNA损伤和凋亡密切联系。细胞凋亡被证明是由许多细胞通路,降低半胱天冬酶3和半胱天冬酶的活动,这是与肿瘤发展(9,10]。在我们的研究中,Q-PCR和免疫印迹分析DDTC-induced细胞凋亡的机制。DDTC增加了蛋白质和mRNA水平的裂解半胱天冬酶9和半胱天冬酶3,并降低半胱天冬酶9和半胱天冬酶3基因的表达和蛋白质A2780和SKOV3细胞,这表明DDTC-induced还存在的乳沟和激活细胞凋亡。
5。结论
总之,DDTC可以抑制人类癌症细胞的生长和显示显著的抗癌活动,其中包括DDTC的影响细胞周期检查点,在卵巢癌细胞迁移和入侵。DDTC表现出的能力增加的表达裂解半胱天冬酶9和裂解半胱天冬酶3蛋白质和半胱天冬酶的表达减少9和半胱天冬酶3蛋白质SKOV3和A2780细胞,这表明DDTC caspase-dependent通路诱导细胞凋亡。所有这些结果表明DDTC可能是一个潜在的候选药物治疗卵巢癌。
数据可用性
的数据直接请求相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
记者陈和Huibing王同样都贡献给了工作。
确认
这项工作是由资金支持关键应用项目基础的河北省科技学系(15967730 d)授予(音译)。
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