文摘
膀胱癌(BCa)是最常见的一种移行细胞癌发病率仍然明显。早期发现BCa与成功的治疗结果高度相关。我们之前显示apurinic / apyrimidinic酶1 /氧化还原因子- 1 (APE1 / Ref-1)表达在BCa患者的血清水平增加相比,健康对照组的水平。在这项研究中,我们调查是否尿APE1 / Ref-1 BCa患者也升高。在这个病例对照研究中,废弃的尿液收集从277年受试者包括169 BCa患者和108年non-BCa控制。尿APE1 / Ref-1水平评估酶联免疫吸附试验(ELISA)。APE1 / Ref-1水平显著升高BCa non-BCa控制和患者相对于水平与肿瘤级别和阶段。尿APE1 / Ref-1水平也高复发患者BCa的历史。接受者操作特征(ROC)曲线APE1 / Ref-1显示曲线下面积为0.83,表明这种生物指标的信度和效度。敏感性和特异性的最佳组合是确定为82%和80%的截止值0.376 ng / 100μL APE1 / Ref-1尿液的检测。总之,尿APE1 / Ref-1水平从无创测量获得的体液将临床适用于BCa的诊断。
1。介绍
膀胱癌(BCa)是第二个最常见的泌尿系恶性肿瘤(在美国1)和韩国(2]。大多数人用BCa早期诊断,没有肌肉入侵,肤浅的移行细胞癌可以期待5年生存率超过90%3]。然而,如果BCa入侵与膀胱肿瘤细胞扩散到周围组织或到附近的淋巴结,或器官,后期BCa的迹象,5年生存率急剧下降。因此,早期干预可以大大增加的概率BCa病人的生存。无创性BCa患者经常表现出高复发和疾病的进展(2年内经尿道4,持续跟踪测试是必需的。几项研究都集中在工具的开发BCa使用尿生物标志物的诊断和预后5- - - - - -9]。
在以前的报告中,我们提出了一种新的BCa诊断蛋白质,apurinic / apyrimidinic酶1 /血清中氧化还原因子- 1 (APE1 / Ref-1) (10]。APE1 / Ref-1蛋白最初发现作为一个多功能蛋白质参与DNA修复和氧化还原信号。APE1 / Ref-1水平被发现与细胞增殖特异表达升高,通常是看到在癌症10- - - - - -12]。APE1 / Ref-1主要定位在细胞核和显示动态穿梭于细胞核和细胞质之间在应对各种压力刺激。此外,APE1胞外分泌物/ Ref-1进入循环显示这种蛋白质可以作为血清生物标志物(13,14]。还支持APE1 / Ref-1细胞分泌物的存在自身抗体对APE1 / Ref-1在肺癌患者的血15和系统性红斑狼疮16]。
临床需要特定的和敏感的移行细胞肿瘤诊断仍然是紧急的问题。理想的诊断测量BCa蛋白生物标志物的水平在一个单步的抽样方法。尿蛋白成分的定性相似的血液虽然他们更稀释(17]。基于病人的诊断尿有一些优点大量尿液是可用的,并且可以通过非侵入性方法重复测量,连续监测,或建立测定的重现性。
在这项研究中,我们比较了尿APE1 / Ref-1 BCa患者和健康者的水平。使用现有的定量APE1 / Ref-1血清化验修改用于尿样,我们旨在量化尿液样本中APE1的水平/ Ref-1 cystoscopic检查膀胱患者结果建立一个新的、非侵入性尿BCa生物标志物。
2。材料和方法
2.1。病人和尿液样本
从277例患者获得的尿液样本。内的所有分析收集的6个月。研究对象被分为非癌症控制(),没有证据表明恶性肿瘤患者或患者膀胱肿瘤()。控制病人被诊断为良性的泌尿疾病,包括良性前列腺增生()、神经性膀胱功能障碍()、尿石病()、压力性尿失禁()和尿道狭窄()。肿瘤是根据2011年举行tumor-node-metastasis (TNM)分类18)和分级根据世界卫生组织(世卫组织)系统(19)由两个无视这项研究的病理学家。BCa组术后泌尿道上皮细胞癌组织学确认,包括成绩和阶段,被记录。所有患者的临床病理资料,包括以前的病史和治疗,复发和临床阶段,从电子医疗记录(表检索1)。废弃的尿液样本来自患者膀胱镜检查前BCa,然后在液态氮冷冻和储存在−70°C到使用。所有样本都来自泌尿外科部门的档案,忠南国立大学,从2011年到2012年。所有样本的收集和分析忠南国立大学医院的机构审查委员会批准的,并从所有研究对象知情同意了。
2.2。尿液样品制备
每个尿液样本解冻,离心沉淀(10000 g×10分钟)去除杂质。上层清液是精心收集并没有额外的蛋白质浓缩步骤做好准备。
2.3。测量尿APE1 / Ref-1
APE1 / Ref-1水平在每个尿液样本定量分析使用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)如前所述10),一些修改。简而言之,96 - microwell板块(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)与100年预镀在一夜之间μL 1: 5000稀释的一只兔子anti-APE1 / Ref-1抗体(Abcam,剑桥,英国)涂层缓冲区(0.5碳酸盐缓冲,pH值9.6)在每一个。盘子都洗五次磷酸缓冲盐(PBS)含0.05% 20 (PBS-T)之间的所有渐变孵化的步骤。与阻断缓冲区阻塞后(5%牛血清白蛋白PBS-T)在室温下2 h,盘子和PBS-T洗五次。尿样、标准和空白(100μ信用证)被添加到井。盘子在37°C孵化了90分钟,然后与PBS-T洗五次,确保消除可能影响抗体识别的残余。这是紧随其后的100年μL 1: 5000稀释鼠标anti-APE1 / Ref-1抗体(Abcam,剑桥,英国),进一步在室温下孵化2 h。与PBS-T盘子然后洗了七次,和100年μL(辣根peroxidase-conjugated anti-mouse抗体(1:5000)添加;板是在室温下孵化了30分钟。洗后,100μ刚做好的四甲基联苯胺基体上的L添加到井中。显色反应于100年停止增加μL 2.5 H2所以4在450 nm,吸光度测量自动微量滴定板读者(日出Xfluor4;Tecan系统,Inc .)、美国加州圣何塞)。每个样本重复化验,并确定平均值。6个标准曲线建立了使用纯化重组人类APE1 / Ref-1 (rh APE1 / Ref-1) (10]。蛋白质(1μg / mL)连续稀释(5倍),在0.0064 - 4 ng / 100稀释剂和使用μl
2.4。统计分析
数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。一个重复测量方差分析是用来比较以上三个变量,而学生的t以及用于评估两个变量之间的区别。接受者操作特征(ROC)曲线生成的策划对假阳性的灵敏度值率()。我们评估的预测价值APE1 / Ref-1 BCa通过计算曲线下的面积(AUC),我们估计最优截止值(Youden指数),根据最大敏感性和特异性(20.]。SPSS 18.0版Windows是用来分析数据。被认为具有统计显著性差异如果能够拒绝零假设的信心(> 95%)。
3所示。结果
3.1。尿水平的人类APE1 / Ref-1膀胱癌患者
确定尿液APE1 / Ref-1水平升高的患者BCa,我们使用一个夹心ELISA对人类APE1 / Ref-1 rh APE1 / Ref-1蛋白质作为标准。患者的尿液APE1水平/ Ref-1 BCa明显高于对照组(ng / 100μL ()BCa的病人,ng / 100μL ()为对照组,(图1(一)))。ROC分析控制和BCa(图组1 (b))产生的AUC 0.83;ROC曲线和相应的AUC表明尿液APE1 / Ref-1作为生物标志物有预测能力区分BCa患者和正常人。最优截止值设置为最大化敏感性和特异性的总和。基于这些结果,最佳组合的敏感性(81.7%)和特异性(79.6%)获得的截止值0.3765 ng / 100μL(表2)。
(一)
(b)
3.2。尿液APE1 / Ref-1水平与膀胱肿瘤相关年级,阶段,和复发
之间的关联程度的APE1 / Ref-1尿液和肿瘤分级,舞台,入侵状态和复发进行调查,以确定APE1 / BCa Ref-1水平预测诊断。如图2(一个)显著差异,平均尿APE1 / Ref-1水平被发现之间的控制()和低度恶性肿瘤组(ng / 100μl;)和控制和高档肿瘤组之间(ng / 100μl;)。中华民国AUC为低级和高级BCa分别为0.73和0.95,分别(图2 (b))。这些结果表明,增加尿APE1 / Ref-1水平与BCa疾病的严重程度,因此,可以帮助指导治疗。我们还确定尿APE1协会/ Ref-1水平和BCa阶段,肿瘤侵犯深度进入膀胱壁。尿APE1 / Ref-1水平显著升高患者的T1 (ng / 100μL)、T2 (ng / 100μL)和T3-T4 (ng / 100μBCa L)阶段,水平相比对照组(图的主题2 (c)),这表明尿APE1 / Ref-1水平可能区分肿瘤的阶段。中华民国AUC为T1, T2, T3-T4阶段是0.79,0.85,和0.99,分别(图2 (d))。此外,患者尿APE1 / Ref-1中位数水平non-muscle-invasive BCa (NMIBC;ng / 100μl)明显低于muscle-invasive膀胱癌患者(MIBC;ng / 100μl,;图2 (e))。中华民国AUC NMIBC和MIBC分别为0.81和0.99,分别(图2 (f))。BCa的两组都明显比控制(控制与NMIBC水平较高;控制与MIBC)。如表所示2,71名患者(42%)复发的历史在169年膀胱癌患者。患者尿APE1 / Ref-1水平之前反复BCa (ng / 100μL)明显高于没有复发的患者(ng / 100μl;图2 (g))。在ROC分析中,患者无复发BCa的AUC是0.78,和之前复发患者BCa的AUC是0.88(图2 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。尿液APE1 / Ref-1血尿患者的水平
假阳性结果的核基质蛋白22 (NMP22)测试已观察到用例血尿(21]。因此,我们调查的影响血尿尿APE1 / Ref-1水平在人类主题。如图3、尿液APE1 / Ref-1水平控制与微观或无血尿水平没有显著不同控制没有血尿(ng / 100μL,控制与血尿,;ng / 100μL,控制没有血尿,,)。尿液APE1 / Ref-1水平的控制与血尿(ng / mL,)明显低于BCa组(ng / 100μl,)。这些结果表明,尿液APE1 / Ref-1水平不受微观和无血尿。
4所示。讨论
在目前的研究中,测量尿APE1 / Ref-1水平,我们修改APE1 / Ref-1最初开发的ELISA检测血清APE1 / Ref-1 [10]。我们获得了ROC曲线运用人类尿液样本的测试结果,确定Youden基于索引,最佳切割点尿诊断测试(20.]。截止APE1 / Ref-1 0.3765 ng / 100的价值μL导致敏感性为81.7%,特异性79.6%的试验。我们也观察到,APE1 / Ref-1 BCa患者蛋白质含量升高,甚至那些低级的肿瘤,而正常对照组水平。此外,增加尿APE1 / Ref-1水平与BCa严重程度相关,表明这种蛋白质可以作为可靠的标记BCa诊断。
我们之前报道的血清APE1 / Ref-1 BCa生物标志物(10]。然而,迄今为止,仍没有blood-based生物标记测试用于诊断或监视BCa的临床实践虽然在血液是有用的在决定预后标记并通知治疗决策。然而,特别是对于监测膀胱疾病、生物标志物尿液中有其独特的优势,包括更大的样本数量,非侵入式取样重复测量,病原体传播的担忧比血液样本。一般来说,尿液中蛋白质源自肾小球滤过血液,排泄的尿路上皮细胞,脱落的上皮细胞和强制类型转换,形成尿液(22]。尿蛋白成分和浓度的变化可以直接表明泌尿道上皮细胞的功能障碍行膀胱内的uropoetic器官。因此,测量尿APE1 / Ref-1水平BCa监控是一个理性的策略。但是,还需要进一步的研究来确定尿的起源APE1 / Ref-1丁点儿得罪或膀胱本身,排泄尿液,机制的含义和血液,尿液APE1 / Ref-1比率;尿APE1 / Ref-1可以建立一个新的BCa生物标志物。然而,我们从尿APE1 / Ref-1分析结果证明可接受的敏感性,特异性和可靠性作为BCa诊断。
APE1 / Ref-1已经涉及到的开发和发展各种癌症(10- - - - - -12,23]。APE1基因变异/ Ref-1一直研究来确定具体的多态性和癌症易感性之间的关系。因为它的频率,最深入研究基因变异是Asp148Glu;D148E [24]。有趣的是,APE1 / Ref-1已经被证明能够表现出一种典型的亚细胞分布模式和细胞质定位在许多癌症类型(25]。根据我们的发现与先前的报道,我们建议的高频率和细胞质定位基因变异D148E APE1 / Ref-1 BCa细胞与尿液中蛋白质的存在。
在这项研究中,我们使用冰冻的尿液样本。避免改变蛋白质的成分在冷冻储存,我们最小的冻融循环次数(1 - 2)准备小整除的尿液样本。进一步沉淀包含细胞碎片,偏差测试结果,之前从尿液中删除存储。然而,它是可能的,刚废弃的尿液样本将产生不同的结果。蛋白质的细胞贡献来源于膀胱或肾脏组织或鳞状上皮细胞从尿道或外部生殖器也不能排除。
在我们的分析中,我们仔细考虑的影响,血尿,尿尿的血红蛋白水平当APE1 / Ref-1水平受到ELISA监控,因为很多人有血尿评估BCa,和一个APE1 / Ref-1 ELISA需要准确的表现尽管血红蛋白在尿液的存在。之前显示膀胱肿瘤抗原的水平(BTA)与尿血红蛋白水平高度相关,说明血液的BTA在尿26]。排除这种可能性,我们证实了猕猴的免疫反应APE1 / Ref-1血尿样本,通过尿液和血液混合重组。获得的结果,使用连续稀释rh APE1 / Ref-1模拟血尿样本,几乎完全实现不管血红蛋白。准确定量的血红蛋白血尿的临床效用可能提供有价值的见解APE1 / Ref-1 BCa生物标志物。
总之,APE1 / Ref-1 BCa的过度表达及其检测血液中(10)和尿液巩固APE1 / Ref-1潜力作为BCa生物标志物。APE1水平/ Ref-1尿液和血液中可能是有用的对于识别BCa患者。此外,测试尿液APE1 / Ref-1是一个方便的方法,可以区分BCa,从而减少不必要的痛苦,膀胱镜检查。额外的前瞻性群组研究使用较大的样品池,包括样本情况下各种预测,需要验证APE1 / Ref-1 BCa的生物治疗。
利益冲突
没有潜在的利益冲突披露。
作者的贡献
Sunga崔、Hyun Shin同样对本文亦有贡献。
确认
本研究支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF) (2014 r1a6a1029617, 2007 - 0054932)。此外,本研究韩国医疗技术研发项目的支持下,卫生部&福利,大韩民国(A091291)。