质/ MS方法的验证尿乳果糖、甘露醇量化:导致肠易激综合症患者

文摘

目的。乳果糖/甘露醇比率是用来评估肠道屏障功能。这项工作的目的是开发一个健壮的和快速的方法分析尿乳果糖、甘露醇的液相色谱法耦合串联质谱分析。乳果糖/甘露醇比率一直以儿科患者患有肠易激综合症。方法。校准曲线和棉子糖,作为内部标准,准备在水:乙腈20:80。五十μL的尿液样本添加到450年μL(内部标准的解决方案。使用卢娜NH色谱分离了₂列操作流量达到200μL / min和筛选了一个线性梯度在乙腈20%到80%的水。总运行时间是9分钟。在电喷雾质谱操作负模式。方法充分验证根据欧洲药品局的指导方针。结果和结论。线性范围从10到1000 mg / L为甘露醇和2.5为乳果糖1000 mg / L。不精确的内部分析物和interassay低于15%。精度高于85%。乳果糖/甘露醇在儿科患者比例明显高于以控制。提出的方法,快速、敏感,适用于临床实验室。

1。介绍

肠道微生物群中扮演重要角色的代谢和免疫功能,和损伤的成分可能会改变体内平衡和导致microbiota-related疾病的发展1]。肠易激综合征(IBS)是一种功能性胃肠疾病患病率范围10至30% (2,3]。相关的主要症状是慢性腹痛腹泻和便秘。

尽管这种疾病并不是与死亡率相关,有针对性的治疗和治疗方法是可取的,尤其是肠易激综合症的原因仍然是部分误解。有证据表明,IBS患者改变了肠道通透性(4,5];因此肠道通透性的评估与罗马标准及粪便证明钙卫蛋白可能有助于有机疾病之间的歧视IBS并且[6]。

提出了不同的方法测量肠道通透性。

我们室技术,即使高度敏感,太入侵经常因为他们需要使用各种各级小肠活检(7]。

肠道通透性(IP)测试是一种廉价的和精确的方法来评估胃肠道黏膜的完整性不使用侵入性方法如内镜或放射学(7,8]。

的使用⁵¹Cr EDTA并不总是保证可靠的结果因为使用单分子检测变化与渗透率变化(8]。

一个有用的和非侵入性标记肠道通透性的评价可能会寻求nonmetabolized尿排泄的糖(9]。

肠道通透性的评价基于量化的吸收两个大小不同的糖给更多的信息和更高的灵敏度比使用单一糖(10]。在生理条件下吸收的速度大约是10%甘露醇和乳果糖的不到1%。粘膜的完整性的损失应该主要原因增加乳果糖吸收由此增加了lactulose-mannitol比(L / M比值)尿液样本(11]。

不同实验室程序提出了量化的甘露醇和尿乳果糖,如光谱光度测量的(12和酶13- - - - - -15色谱法()方法,16],高效液相色谱法(HPLC) [17- - - - - -19]。

本文的目的是开发和验证一个敏感的和特定的液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)方法测量甘露醇和尿乳果糖含量适合临床化学的例程。此外,该方法应用量化的L / M在儿科患者患有肠易激综合症与对照组相比。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

水和乙腈(质等级)从默克公司购买(默克公司,达姆施塔特,德国)。甲酸(质成绩98%)购买的贝克(意大利米兰,意大利Mallinckrodt Baker)。

乳果糖、甘露醇和洗必泰买来加压(美国密苏里州AppliChem Inc .)。

股票的解决方案的甘露醇(4 g / L),乳果糖(4 g / L),和棉子糖(1 g / L)也准备了水和储存在80°C。

解决方案准备工作在水/乙腈(20/80,体积/体积)的浓度1600 mg / L为乳果糖甘露醇和800 mg / L。连续稀释工作解决方案被用来准备六点校准曲线对甘露醇和乳果糖(0-50-100-200-400-800 mg / L;0-25-50-100-200-400 mg / L、职责)并将其保持在−20°C到使用。棉子糖作为内部标准(是)在80%乙腈25 mg / L。

2.2。主题

15例男性和7女性(5-16年,8)与肠易激综合症的诊断被招募。肠易激综合症的诊断是使用罗马III标准执行20.]。症状严重程度的评估进行了使用Visuoanalogic规模(血管)得分。我们发现8 IBS-D患儿(53%),2 IBS-C(13%),和5 IBS-U (33%)。

对照组10,显然健康,主题(5-16年4雄性和雌性6)招募了。

患者的糖尿病、甲状腺疾病、腹部手术、结缔组织疾病,和呼吸测试lactose-positive或患有胃肠疾病以外的IBS被排除在外。

研究机构伦理委员会的批准,并得到一个消息灵通的书面同意从每个主题符合赫尔辛基宣言的原则。

2.3。样品采集和处理

受试者被要求遵循乳果糖,mannitol-free饮食分析前24小时,以减少甘露醇浓度基底尿液样本。通宵禁食后尿液基底样本收集;然后,病人喝了解决方案包含5 gr的乳果糖和gr的甘露醇120毫升的去离子水。收集尿液样本在接下来的6小时。在收集管,根据文献数据,1毫升的洗必泰(1毫克/毫升)添加抗菌剂。总尿量测量,和几个1.0毫升整除储存在−20°C到分析。

尿液样本被允许在室温下解冻,然后使用旋涡混合器搅拌1分钟,然后在5000年离心机4分钟去除泥沙根据实验室过程。

到50μL的尿液样本,控制和标准增加了450μL是解决方案的混合后,200μL整除被转移到一个玻璃小瓶注射HPLC-MS /女士。

2.4。仪表

质/ MS系统包括高效液相色谱法和autosampler Accela(美国热费希尔,帕洛阿尔托,CA)和一个三重四极质谱仪TSQ量子访问(美国热费希尔,帕洛阿尔托,CA)配备一个电喷雾离子源。

2.5。色谱条件

高效液相色谱法分离进行了使用150×2毫米,5月神μm NH₂100列(美国Phenomenex)操作流量达到300μL / min,筛选了4分钟从70年30%的乙腈水线性渐变。烤箱温度设定在40°C。注射体积是10μL,总的分析时间是9分钟。

2.6。质谱条件

ESI源在负模式运营。毛管电压的温度设置为3400 V 310°C。天然气的来源是如下:鞘气体压力,40(任意单位);辅助气体压力,5(任意单元);离子扫气压力,0(任意单元)。氩是用作碰撞气体压力为1.5毫托。

每个选择反应监测(SRM)过渡收集阿姆河全宽0.7解决半极大(应用)在第一个四极,扫描时间为0.1。建立了管透镜和碰撞设置单独为每个化合物对SRM检测。条件(表1)检测乳果糖、甘露醇和棉子糖是通过直接注入一个标准的解决方案(10μg / mL)的高效液相色谱法在初始流动相条件。

2.7。方法验证

验证的方法评估了以下参数:线性、定量限,不精确,精度,复苏和基体效应。线性和量化的限制(定量限)是通过测量计算,一式三份,连续稀释解决方案的乳果糖、甘露醇股票的解决方案。不精确的方法评估使用尿池(乳果糖、甘露醇不检测,本名叫QC0),掺入了三个不同数量的糖(100,和200 mg / L乳果糖和100年,400年和600 mg / L甘露醇;见表2)。这三个样品也被用作质量控制样品(QC1;QC2;QC3)。intra-assay评估不精确,每个QC准备根据协议和测量8次在同一个分析运行,而interassay不精确评估通过测量在重复相同的QC样品连续十天。精度评估使用十QC1复制;QC2;QC3和表达为偏见%:((确定价值/理论值)×100%)。在恢复研究中,尿池(QC0)分为两个管。第一个整除(示例1)添加不同量的乳果糖、甘露醇(集中值见下表2根据协议)和治疗。第二个整除(样2)是治疗根据协议然后用相同数量的浓缩乳果糖、甘露醇,为了达到相同的最终浓度两个整除。样品被注入到质/ MS系统。回收率计算的平均值/和/并表示为%。

基体效应评估,QC0治疗后根据协议和富含不同数量的乳果糖和甘露醇(50,100,和200 mg / L乳果糖和100年,400年,甘露醇和600 mg / L)。相同数量的乳果糖、甘露醇是加入流动相以相同的最终浓度浓缩尿池。样品被注入质/ MS系统。结果表示为每个分析物的领域获得的比例在尿液和流动相,用%表示。

稳定的乳果糖、甘露醇和棉子糖是评估通过分析重复5样品后立即准备和24和48 h后储存在4°C和−20°C。平均浓度每一层应该在±15%的名义浓度。

参考范围进行评估尿10日样本看似健康的话题。

数据采集和使用质谱仪进行定量分析软件(亚瑟王的神剑2.0.7,热费舍尔,帕洛阿尔托,CA,美国)。统计分析了使用GraphPad Prism 4.00 (GraphPad软件有限公司、钙、美国)和Microsoft Excel 2007 (Microsoft Office 2007)。

3所示。结果

图1显示了一个典型的SRM色谱乳果糖、甘露醇和其内部标准棉子糖的尿液样本。图中显示了一个足够的色谱分离的三分子和明显没有观察到的干扰。

量化的限制10 mg / L为乳果糖甘露醇和2.5 mg / L。分析是线性1000 mg / L为甘露醇和乳果糖1000 mg / L。方法开发期间,八个校准曲线进行分析的三个星期²对分析物总是高于0.99。此外,校准曲线的参数(斜率和截距)相比,用尿校准曲线。结果表明一个好的重叠的校准点。

精密度和准确度的结果总结表2。within-run精度和准确度范围从2.9 - 5.1%和85.6 - 96.8%,分别。between-run精度和准确度范围从5.1 - 12.4%和85.8 - 96.7%,分别。

两个糖回收率范围从93.5到118.6%。

乳果糖、甘露醇的平均峰值区域移动阶段和尿液中没有显著的不同。事实上,乳果糖的信号强度和甘露醇当尿矩阵(含洗必泰)注射完全比得上,当流动相注入相同的实验。基体效应对乳果糖和甘露醇低于20%。而且这表明洗必泰,即使出现在不同的浓度不同的尿标本(因为不同的卷收集),不干涉甘露醇和乳果糖信号。

的意思是基底乳果糖和甘露醇浓度分别mg / L和mg / L病人和对照组之间无显著差异。

L / M的平均值比对照组的0.014标准偏差为0.007。截止值(M + 2 sd)是0.03,完全与文献中报道的数据。

在表3L / M的比率控制,每个病人的报道。

L / M比值的平均值IBS患者是0.096标准差为0.078。之间的差异的统计分析L / M的比例控制与IBS患者是统计学意义()(图2)。IBS-D患儿肠道通透性增加相比其他IBS子组:IBS-D和IBS-C IBS-U。

没有胃肠道不良事件观察(呕吐、腹泻、或恶心)在任何孩子。

4所示。讨论

缺陷的屏障功能,导致上皮细胞层结构的破坏可能导致肠道疾病。尤其是肠易激综合症病理生理学是非常常见的疾病,不清楚。肠道通透性似乎发挥重要作用的发病和严重程度相关的症状,而很少有研究能澄清机制(21,22]。

肠道渗透性测试代表一个有效、经济、简单的工具来评估肠道屏障的完整性的识别功能和肠道粘膜的改变。乳果糖、甘露醇比(L / M比率)是一个快速和简单的测试评估肠道通透性的肠道屏障的完整性,经常用于临床实践(18,23]。描述了几种色谱方法分析使用不同的检测系统(乳果糖、甘露醇16- - - - - -19]。高效液相色谱与质谱是理想的解决方案的高选择性、灵敏度和效率。

最大的问题之一在质谱分析是最小化矩阵的效果。可能的策略是采用如下:样品净化或更有效的色谱分离21]。

的尿液样本,由于蛋白质含量最小,可以只执行一个样本稀释前注射,但这个过程减少了干扰由于矩阵只有部分组件。

胺的色谱分离柱允许充分保留矩阵分析物分离的组件淋洗附近的空隙时间主要负责基体效应。

胺列并不能保证更多的表演使用C18柱;为该应用程序实际上观察到的平均寿命大约是400注射,CQ后,重复在每个会话,显示出色谱峰的分辨率损失。

选择使用一个相对较长的色谱运行允许简化过程的准备至少和优化实验室技术员的工作。有可能以这种方式准备大量的样本在相对较短的时间,然后在夜间执行分析质/女士。ESI -电离源和三重四极分析器在SRM模式下确保高特异性进一步减少可能的其他物质的干扰,也因此增加了灵敏度。验证的研究方法除了真实的尿液样品初步数据表明,该方法完全符合标准要求的指导方针的欧洲药品局24]。描述的方法可以准确地确定尿乳果糖、甘露醇浓度。在本研究参考区间评估在一群儿童主题为了比较他们和一群小儿肠易激综合症患者。结果L / M在IBS患者比例明显升高。两组之间的比较突出的IBS患者肠道通透性的改变。事实上,分数的比例分泌乳果糖的甘露醇(L / M比值)IBS患者的尿液样本中观察到明显高于健康受试者的比率。此外,IBS-D孩子腹部疼痛的严重程度越高(以血管得分来衡量,数据未显示)相对于其他子组提出更高的肠道通透性在这个群。事实上,肠道渗透性测试本身并不是诊断肠易激综合症和目前不是经常执行,剩余的局限于研究设置。

此外,这种方法允许一个简单的评价小儿肠道通透性的学科,它是不可能的⁵¹Cr-EDTA测试。

未来的角度来看,我们想确认这项研究的结果在更大数量的个人更好地定义的截止值相关的各种疾病。此外,这将是有用的划分在两组研究对象(青春期前和青少年)更好的定义,如果肠道屏障的不同发展阶段可能影响乳果糖、甘露醇的测量。它是更有趣的澄清如果老化和肠道微生物群可能会影响肠道通透性。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

引用

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