在体外灵敏度的配对莱山岛（弗尼尼亚）braziliensis皮肤利什曼病治疗前和治疗失败或恢复后的标本分离

摘要

这项研究评估了在体外灵敏度的配对Leishmania Braziliensis.在接受脑内给药或注射的患者中，从相同的患者和治疗失败或治疗失败或皮肤Leishmaniaisis重新激活（样品B）中的样品（样品B）（5 mgs/ kg / d）meglumine锑酸盐。研究了7名患者的十四个样本。24小时后，药物暴露后，50％致命剂量（LD₅₀)，处理前(A)和处理后(B)的前鞭毛体含量分别为0.37 mg/mL ~ 5.86 mg/mL和0.89 mg/mL ~ 7.80 mg/mL₅₀值分别为0.37mg / ml至5.75mg / ml，分别为A和B样品的0.70mg / ml至7.68mg / ml。48小时后，LD₅₀无鞭毛虫的值为11.7 ~ 44.3μ.用于样品的g / ml，13.7至52.7 μ.g/mL。7例患者中，停用1例，再用两性霉素B(4例)或锑胺葡胺(2例)治疗6例。总体而言，B类样品的LD较高₅₀值大于A样本;但差异不显著。这些结果不支持低剂量和病灶内治疗诱导耐药寄生虫选择的假设在体外并提示其他因素可能会影响对初次治疗反应较差的患者的治疗结果。

1.介绍

美国皮肤利什曼病(ACL)是由该属的原生动物种引起的莱山岛由受感染的白蛉叮咬传播[1]．在巴西,利什曼虫braziliensis (Viannia)是皮肤、粘膜和粘膜皮肤前交叉韧带的主要病因[2- - - - - -4]．莱山岛是一种寄生的寄生虫，有两种发育形式:无鞭毛体和原鞭毛体。无鞭毛体呈圆形，位于细胞内，见于脊椎动物宿主的吞噬单核细胞，特别是巨噬细胞的寄生液泡中。相比之下，原鞭毛被拉长，有游离鞭毛，它们在白蛉昆虫载体和无菌培养的肠道中发育。这两种形式都在在体外评估治疗敏感性的试验[5]．

五价锑（）是治疗皮肤LeishManiaisis（CL）的选择药物，推荐剂量为10-20毫克 20天[6]．多年来，巴西里约热内卢的埃万德罗·查加斯国家传染病研究所/奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会(INI/FIOCRUZ)一直给药5毫克肌肉内连续的或连续的[4，7- - - - - -9]或通过内部（IL）给药[10，11]．无论何种方案，里约热内卢de Janeiro的治疗反应通常是有利的。然而，在各流行地区均有治疗失败或治疗后皮损重新激活的报道[5，6，12- - - - - -14]．作者认为，治疗失败或重新激活与宿主免疫反应、药物吸收和感染部位灌注等药理学因素有关，特别是与寄生虫对锑的耐药性有关的因素[15，16]．

已报道抗锑[16- - - - - -19]它应该被认为是由于患有这种疾病的有限药瓶有限的有限问题[20.]．利什曼虫donovani(利什曼虫)分离株耐已在印度和尼泊尔地区确认。最近在新大陆发现了抵抗[21]．已经努力比较临床治疗响应在体外锑的敏感性。然而,可用的在体外技术无法检测原虫肯定的抵抗[5，22，23]．

在这项研究中，我们评估了在体外易感性原虫通过比较同一患者治疗失败或皮肤损伤恢复前后分离的无鞭毛体和前鞭毛体对锑铵的影响。

2.材料和方法

2.1。患者和样品

符合条件的患者包括接受30次连续肌注5mg治疗的患者甲氨蝶呤锑铵，10剂量肌肉注射系列，每组间休息10天(低剂量)，或IL剂量足以浸润病灶基底部，每次治疗间隔约15天。两个莱山岛（V。）braziliensis从同一病灶诊断时治疗前(样本A)和治疗失败或病变重新激活后(样本B)分离样本。

治疗失败定义为治疗完成后没有进展性病变愈合。重新激活被定义为在初始治疗明显成功且有愈合迹象后病变的重新激活。

所有患者都来自里约热内卢的状态，并参加了Ini / Fiocruz的Leishmaniaisis门诊诊所。

该研究得到了INI/FIOCRUZ研究伦理委员会的批准。所有患者在临床评估前均签署同意书，以提供病变样本进行培养。病变片段接种于Novy-MacNeal-Nicolle (NNN)双相和Schneider双相培养基中果蝇培养基(Sigma，圣路易斯，密苏里州)添加10%胎牛血清(FCS)和抗生素(200 U青霉素+ 100μ.g链霉素)。分离菌株通过同工酶电泳鉴定，并仅在培养中维持第5代，以保持寄生虫的传染性。

２.２.药物

Meglumine Antimoniate（Glucantime，Sanofi-Aventis），Lot 604898，适用于81毫克的5毫升安瓿 ，由卫生部，巴西卫生监督部提供。该药物在施耐德或RPMI-1640（Gibco，Brl，Grand Island，NY，USA）培养培养基中稀释在体外化验。用原鞭毛体和无鞭毛体对各标本进行评价在体外药物敏感。

2．3.Promastigote化验

首先，生成样品生长曲线:试管(16 × 150 mm)含有添加10% FCS的4 mL施耐德培养基，1 × 10接种抗生素⁷寄生虫/ mL并储存在26-28℃。使用Neubauer室和台盼蓝染色，在24小时间隔中以三份以三份进行量化。

基于这些生长曲线，用于固定相的寄生虫和培养中第五段在培养物之前用于敏感性试验。测定在96孔培养板中进行，并在暴露于MeGlumine Antimoniate的24和48小时后评价。A和B样品在同一板上进行评估。一100 μ.L悬液含1 × 10⁶将用施耐德培养基稀释的寄生虫置于含有相同体积药物(100μ.L)。使用两倍连续稀释的锑铵，从8.1 mg开始到3.955μ.g．将板在生物培养箱（26-28℃）中温育，使用Neubauer室和台盼蓝染色在24和48小时后进行寄生虫。不暴露于药物的A和B寄生虫样品用作对照。与无药物对照相比，实验以三份和值进行。50％寄生虫死亡率所需的药物（LD₅₀)由这些测量确定，并使用Microsoft Excel软件计算，如Machado等人所述[24]．

２.４.无鞭毛体化验

对无鞭毛虫进行了敏感性试验在体外培养的小鼠巨噬细胞感染。简单地，用大约10 mL的rmi -1640培养基注射器冲洗离系瑞士韦氏小鼠腹腔，分离巨噬细胞。这些细胞被镀(2 × 10)⁶宏观物/ ml）在腔室幻灯片（Lab-Tec，Nange Nunc International），然后在5％CO中在37°C下孵育2小时₂的气氛。用添加10% FCS的RPMI-1640培养基洗涤去除非贴壁细胞。感染前细胞在相同的培养条件下维持24小时。在此期间后，每只巨噬细胞加入5-10只原鞭毛体(样本A和B)。2 h后，用无血清培养液清洗单层膜，去除游离寄生虫，更新培养液(RPMI + 10% FCS)。浓度分别为20,40,80的药物μ.g在感染后24小时加入24小时，在24,48和72小时中加入24小时，在相同培养基中加入24小时。在每个时间点，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）pH 7.2（37℃）洗涤载玻片，用甲醇固定，并用Giemsa染色。对照是巨噬细胞感染的样品A和B没有麦芽糖锑。在光学显微镜下计算来自样品A和B的每个时间点的100种随机巨噬细胞，并在光学显微镜下计数以确定药物浓度的效果。使用受感染细胞和平均每种细胞Amastigot的百分比（％）来计算感染率。LD.₅₀，在感染动力学48小时表达，使用GraphPad Prism(版本5.04)从剂量-反应图计算。

2．5．统计分析

Windows（版本17.0）的SPSS统计数据用于执行Wilcoxon测试，以比较来自A和B样本的Promastigotes和Amastigotes;被认为具有统计学意义。

3.结果

本研究中包含来自7例患者的14种成对样品（A和B）。患者年龄从18岁到71岁;4是女性。在初始治疗后，分别在5例和2名患者中观察到治疗失败和再活化。在这7例患者中，1例患者停止治疗和6患者用两性霉素B（4例）或MEGLUMINE锑酸盐（2例）治愈。

原鞭毛体生长曲线在第3 ~ 4天呈现平稳期;因此，试验中使用了生长第三天的寄生虫。来自同一患者的配对样本(A和B)显示出相似的生长情况。除1例患者外，A组寄生虫在曲线各点的平均数量均高于B组。然而，它们对小鼠巨噬细胞的感染能力没有差异。

我们观察到，在大多数样本和所有药物浓度(20、40和80)中，感染细胞的百分比和细胞内无鞭毛体的平均数量急剧下降μ.g/mL)。因此，我们使用48 h时间点来计算LD₅₀．

表格1显示有关治疗和结果的患者数据，以及LD₅₀样本A和B的原鞭毛和无鞭毛形态的值。各样本灵敏度水平间无显著差异。

4。讨论

五价锑剂用于治疗利什曼病已有大约70年的时间，疗效不一;已报告有耐药性，特别是内脏利什曼病[17，18，20.]．在这项研究中，我们评估了14对原虫样品以验证与之间的关联在体外用锑葡胺治疗的患者的易感性和治疗结果。

Grogl及其同事发表的论文突出了关于疟原虫抗锑性发展的假设[16，25]基于结果在体外试验表明，不适当的治疗剂量可以诱导抗锑的寄生虫克隆的选择。Sundar等人的报告加强了这一观察[26在印度，治疗内脏利什曼病时未能控制锑的使用。里拉等人[27)表明,l . donovani从印度对锑无反应的患者中分离出来的LD高出3倍₅₀比药物响应患者的分离物的值。在使用配对样品的另一个研究中，治疗后分离的样品显示出较高的LD₅₀与治疗前采样相比的值[28]．尽管猜测，寄生虫抗动抗性仍然没有明确的标志物[29]．

我们研究的患者是在INI/FIOCRUZ进行诊断、治疗和随访的，该机构有长期且成功的肌肉注射治疗历史(5mg)或用IL治疗锑葡胺[4，8- - - - - -11]．在本研究中注册的7例患者中，用肌肉内施用的低剂量方案和2次接受IL处理治疗。撤退由治疗医师自行决定管理。关于治疗结果，1例患者停止治疗。用最初使用相同的治疗方案治愈两名患者（5毫克 )， 4例经两性霉素B再治疗治愈[6]．

由于可能涉及其他因素，通常很难将治疗失败仅仅与寄生虫耐药性联系起来[22，23，30.]．然而，了解在不同情况下分离出的寄生虫的特征可以为这一讨论提供重要的内容。

具有遗传多态性的寄生虫种类和亚群也可能影响临床病程和治疗反应。原虫众所周知，具有高遗传变异性的群体，可引起皮肤和粘膜病变。然而，尽管在里约热内卢的状态下报告了不同的临床模式和不同的治疗反应，但是原虫基因图谱是同质的[31]．本研究的样本也具有同质表型，没有同工酶变异。

生成所有样品的生长曲线，以确定固定相的时间。正如Moreira等人所报道的，这一阶段在所有样品生长的第三天和第4天之间达到。[23]．来自同一患者的配对样本(A和B)显示出相似的生长情况。生长剖面的差异也可能是由于样本的异质性;进一步考虑在体外生长参数是必要的[32]．在我们的研究中，一个有趣的观察是，除了1例患者外，A样本与B样本相比，曲线上所有点上的寄生虫平均数量最大。这一发现表明，事先接触治疗可能会损害原鞭毛体的繁殖能力在体外．然而，A和B样本感染小鼠巨噬细胞的能力没有差异。

的变量在体外春季和Amastigotes的易感性可能与实验条件或进化形式的固有特征有关。在这些测试中使用Promastigotes的显着限制是它们不是脊椎动物宿主中的进化形式。与我们的研究结果类似，其他人报告了突出病，抗MeGlumine锑酸盐，需要比Amastigots更高的药物剂量[5]．Vermeersch等人[33]提出，细胞内的Amastigote模型应该是标准参考在体外敏感性测试。尽管我们的结果显示LD有很大的异质性₅₀价值观，他们普遍同意其他使用原鞭毛的研究[5，32]．无法建立治疗反应之间的关系在体外具有Promastigotes的敏感性数据，因为4例患者增加了样本B LD₅₀经葡胺锑酸盐再处理后回收。这表明，在这一背景下，其他变量可能有积极或消极的影响。Zauli-Nascimento等人[21也没有发现两者之间的相关性在体外ACL患者的结果和治疗反应。

除了LD的变异很大₅₀在原鞭毛和无鞭毛的绝对值中，我们发现B样品的LD较高₅₀值与A样本比较。这一结果可能表明，活化后分离的样品对葡胺锑的敏感性较低在体外;然而，差异没有统计学意义。这些结果不支持低剂量或IL治疗诱导选择抗性寄生虫的假设在体外．其他因素，如对感染的免疫反应可能影响患者的治疗结果，对初始治疗反应差;因此，应谨慎对待相关性。

Zauli-Nascimento等人[21也没有发现两者之间的相关性在体外ACL患者的结果和治疗反应。根据这些作者的说法，没有证据表明寄生虫对与其他流行地区的报告不同。由于ACL的治疗反应是多因素的，应该考虑不同的方法，并鼓励使用有反应和无反应患者的样本进行额外的研究。使用更多的分离株和新的标记物进行进一步的研究可能会增加本研究的结果，并有助于更好地了解其中涉及的机制阻力。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究得到了国家研究发展委员会(CNPq)和巴西金德研究所(IKB)的资金支持。a . Schubach和M. F. Madeira拥有研究生产力基金(CNPq)。舒巴赫是作者所在州的科学家，马德拉是他们所在州的年轻科学家(FAPERJ)。

参考

1. 谁，“控制莱山西亚，”技术报告系列949，世界卫生组织，日内瓦，瑞士，2010年。查看在：谷歌学者
2. M. C. de A. Marzochi和K. B. F. Marzochi，《巴西的皮肤和内脏利什曼病——新出现的人畜共患病及其控制的可能性》，Cadernos de Saúde Pública，第10卷，补编2，第359-375页，1994。查看在：出版商的网站|谷歌学者
3. M. P. de Oliveira-Neto, M. S. Mattos, M. A. Perez等，“巴西里约热内卢州里约热内卢的美国皮肤利什曼病(ATL):主要临床和流行病学特征”，国际皮肤病学杂志，卷。39，没有。7，pp。506-514,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学者
4. A. de Oliveira Schubach, K. B. Feldman Marzochi, J. Soares Moreira等，“用锑铵治疗皮肤利什曼病151例回顾性研究，”Brasileira de Medicina热带医学俱乐部第38卷第2期3，页213-217,2005。查看在：谷歌学者
5. r.b. G. Azeredo-Coutinho, s.c.f. Mendonça, H. Callahan, a.c. Portal，和M. Grögl，“敏感性Leishmania Braziliensis.对葡聚糖的原鞭毛率高于其他菌株莱山岛物种与对美国Tegumentary LeishManiaisis的响应相关，“寄生虫学杂志》第93卷第5期3，页688-693,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
6. Ministério da Saúde, Ed，手册devigilânciada Leishmaniose tegumentar Americana， Editora do Ministério da Saúde, Brasília，巴西，第二版，2010。
7. M. P. Oliveira-Neto、A. Schubach、M. L. Araujo和C. Pirmez，“锑的高剂量和低剂量(Sb^v)在美国皮肤利什曼病。对15名患者进行了5年的随访研究。Memórias do Instituto Oswaldo Cruz，卷。91，没有。2，pp。207-209，1996。查看在：出版商的网站|谷歌学者
8. M. P. Oliveira-Neto, A. Schubach, M. Mattos, S. C. goncalvers - costa, C. Pirmez，“对159名美国皮肤利什曼病患者的低剂量锑治疗:广泛的随访研究(长达10年)，”美国热带医学和卫生杂志，卷。57，没有。6，pp。651-655，1997。查看在：谷歌学者
9. M. P. Oliveira-Neto, a . Schubach, M. Mattos, S. C. Goncalves-Costa, C. Pirmez，《美国皮肤利什曼病的治疗:低剂量(5 mg/kg/day)和高剂量(20 mg/kg/day)锑方案的比较》，Pathologie生物，卷。45，不。6，pp。496-499,1997。查看在：谷歌学者
10. M. P. Oliveira-Neto, A. Schubach, M. Mattos, S. C. Gonçalves da Costa，和C. Pirmez，“在巴西的里约热内卢de Janeiro用五价锑治疗美国皮肤利什曼病利什曼虫braziliensis (v)传播。”国际皮肤病学杂志第36卷第2期6，第463-468页，1997。查看在：出版商的网站|谷歌学者
11. E。D. C. Ferreira E Vasconcellos, M. I. Fernandes Pimentel, A. De Oliveira Schubach等，“从里约热内卢De Janeiro(2000至2006年)病灶内锑化葡胺治疗皮肤利什曼病禁忌症患者”，美国热带医学和卫生杂志，第87卷，第2期2, pp. 257 - 260,2012。查看在：出版商的网站|谷歌学者
12. A. M. Rodrigues, M. Hueb, T. A. Santos, C. J. Fontes，“与锑葡胺治疗皮肤利什曼病失败相关的因素”，Brasileira de Medicina热带医学俱乐部，卷。39，没有。2，pp。139-145,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学者
13. R. Rojas, L. Valderrama, M. Valderrama, M. X. Varona, M. Ouellette，和N. G. Saravia，“人类对锑的抗性和治疗失败莱山岛（弗尼尼亚） 感染，”中国传染病杂志第193卷第1期10，页1375-1383,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学者
14. D. O. Santos, C. E. R. Coutinho, M. F. Madeira等人，“利什曼病的治疗——一个仍然存在的挑战:综述，”寄生虫学研究号，第103卷。1，页1 - 10,2008。查看在：出版商的网站|谷歌学者
15. S. L. Croft, K. Seifert, V. Yardley，《利什曼病药物开发的现状》，印度医学研究，卷。123，没有。3，pp。399-410，2006。查看在：谷歌学者
16. 利什曼病的耐药:它在皮肤和粘膜皮肤疾病的全身化疗中的意义美国热带医学和卫生杂志，卷。47，没有。1，pp。117-126,1992。查看在：谷歌学者
17. S. SUNDAR，D. K.更多，M.K.Singh等，“印度内脏利伊尔曼西亚病中的五价锑失败：从印度流行的中心报告”临床传染病第31卷第1期4，页1104-1107,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学者
18. P. J. Guerin, P. Olliaro, S. Sundar等人，“内脏利什曼病:控制、诊断和治疗的现状，以及拟议的研究和发展议程，”《柳叶刀》传染病，第2卷，第2期8，页494 - 501,2002。查看在：出版商的网站|谷歌学者
19. K. Aït-Oudhia, E. Gazanion, D. Sereno等，“体外对锑和两性霉素B的敏感性Leishmania Infantum.从缺乏药物选择压力的区域中孤立的菌株，“兽医寄生虫学，第187卷，第1期。3-4, pp. 386-393, 2012。查看在：出版商的网站|谷歌学者
20. J. Mishra，A. Saxena和S. Singh，“Leishmaniasis的化疗：过去，现在和未来”，当前药物化学第14卷第2期10，页1153-1169,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
21. R. C. Zauli-Nascimento，D.C.C.Miguel，J.K.U. Yokoyama-Yasunaka等人，“含量敏感莱山岛（弗尼尼亚）braziliensis和莱山岛（莱山岛）amazonensis巴西分离到葡胺锑酸盐和两性霉素B "热带医学与国际卫生，卷。15，不。1，pp。68-76,2010。查看在：出版商的网站|谷歌学者
22. J. E. Jackson, J. D.塔利，W. Y. Ellis等人，“定量的体外药效和药敏评价莱山岛ssp。对五价锑治疗无反应的患者美国热带医学和卫生杂志号，第43卷。5，页464 - 480,1990。查看在：谷歌学者
23. E. S. A. Moreira, C. Anacleto，和M. L. de Petrillo-Peixoto，“葡聚糖对新大陆野外和病人分离株的影响莱山岛:使用原鞭毛体的生长参数来评估锑的敏感性，”寄生虫学研究(第84卷)9、1998年。查看在：出版商的网站|谷歌学者
24. M. D. C. Machado, L. L. Leon和S. L. de Castro，“巴西和保加利亚蜂胶对不同种类的蜂胶的活性莱山岛，“Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz，卷。102，没有。1，pp。73-77,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
25. M.Grogl，A.M.J.Oduola，L. D.C.CORDERO和D. E. Kyle，“莱山岛通过不连续药物暴露在体外开发戊酯耐药克隆"寄生虫学实验，第69卷，第2期1，第78-90页，1989。查看在：出版商的网站|谷歌学者
26. S. Sundar, B. B. Thakur, A. K. Tandon等，“印度黑热病耐药性的临床流行病学研究”，英国医学杂志，第308卷，第2期1994年第307条第6924条。查看在：出版商的网站|谷歌学者
27. R. Lira, S. Sundar, A. Makharia等人，“证据表明，印度黑热病治疗失败的高发生率是由于锑耐药菌株的出现Leishmania Donovani.，“传染病杂志，卷。180，没有。2，pp。564-567，1999。查看在：出版商的网站|谷歌学者
28. F. Faraut-Gambarelli, R. Piarroux, M. Deniau et al.，“体外和体内的耐药性Leishmania Infantum.对从内脏利什曼病患者收集的37株菌的研究抗微生物剂和化疗号，第41卷。4，第827-830页，1997。查看在：谷歌学者
29. J. Chakravarty和S. Sundar，《利什曼病的耐药性》全球传染病杂志，第2卷，第2期2，pp。167-176,2010。查看在：出版商的网站|谷歌学者
30. S. Rijal, V. Yardley, F. Chappuis等，“内脏利什曼病的锑治疗:目前的体外药敏试验是否足以判断体内治疗结果的预后?”微生物和感染，第9卷，第5期。4，页529-535,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学者
31. C. Baptista, A. O. Schubach, M. F. Madeira et al，”莱山岛（弗尼尼亚）braziliensis非典型或典型皮肤利什曼病患者病变中的基因型:通过两种分子标记进行评估寄生虫学实验号，第121卷。4，第317-322页，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者
32. H. L. Callahan，A.C.Portal，R. Devereaux和M. Grogl，“一种药物筛选的轴静脉amastigote系统”，抗微生物剂和化疗号，第41卷。4，pp。818-822，1997。查看在：谷歌学者
33. M. Vermeersch, R. I. Da Luz, K. Toté， j.p。Timmermans, P. Cos，和L. Maes，“体外敏感性Leishmania Donovani.Promastigote和Amastigote阶段到抗恋的语言中参考药物：特定阶段特异性差异的实际相关性，“抗微生物剂和化疗，卷。53，不。9，PP。3855-3859，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2015 CIBELE BAPTISTA等。这是分布下的开放式访问文章知识共享署名许可协议如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。