文摘

背景。急性淋巴细胞白血病B型(B)是一种肿瘤疾病死亡率高。本研究的目的是验证了45个基因的表达谱与信号通路参与白血病和与b的预后评估他们的协会。方法。219份外周血单核细胞从73 b患者在诊断进行了研究,获得四项,开始治疗后8周。分析了基因表达定量实时聚合酶链反应。结果。规范化三角洲Cq 23 b基因显示差异值在诊断和控制时间(值< 0.05)。之间有重要关联b患者复发/死亡和IL2RA的表达水平,SORT1 DEFA1, FLT3基因至少在一个时代的评估(值< 0.05和优势比范围:3.73 -27)。FLT3放松管制和复发之间的关系/死亡是一个常数乘以研究及其超表达显著增加复发的可能性/死亡的3.73和6.05在研究人群中(值< 0.05)。结论。超表达FLT3和DEFA1基因保留独立的预后意义b的结果,反映了复发的风险增加/研究人口死亡。

1。背景

急性淋巴细胞白血病(ALL)是一种肿瘤疾病的淋巴祖细胞具有不同的细胞遗传学和分子异常的患病率与山峰2-5-year-old病人和50岁以上(1]。治疗策略使用risk-adapted化疗治愈80%以上儿童病例,但大约20至30%复发发展严重的并发症包括死亡(2,3]。在所有情况下源于B淋巴细胞祖细胞代表85%的儿童和75%的成人病例,分别为(2,4]。在墨西哥,白血病死亡率代表死亡的第二大原因在童年和青春期和18的病人生产力时代(15 - 64岁)5,6]。

TEL-AML1等常见细胞遗传学异常亚型(ETV6-RUNX1) / t (12; 21), bcr - abl (bcr - abl1) / t (9; 22), MLL重排/ t (11 q23处),E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) / t (1; 19), MYC-IGH / t (t(8; 14),(2, 8)或t(8; 22)],和超二倍性/染色体(50)通常与所有的预后和与年龄、白细胞(WBC)计数,白血病细胞immunophenotype,和时间响应治疗定义危险分层组(7]。然而,主要预后异常染色体数目或结构缺席在大约10 - 30%的患者中,相当数量的情况下预测不成功(8- - - - - -10]。管制基因表达的几个关键的细胞通路已经被认为是一个有用的工具来改善预后和确定新的治疗目标在所有11]。虽然有许多研究基于微阵列的基因表达技术,表明候选基因为所有患者预后或结果(11- - - - - -15),到目前为止所有验证的研究集中在一小部分基因或子组策略针对特定疾病。

参加需要改善复发的预测,本研究的目的是一个全面的基因表达谱的纵向验证45候选基因参与的关键细胞信号通路和确定他们的表达是与一群墨西哥b患者的复发。在这个面板中,基因和通路之前报道所改变的表达或拷贝数变异(CNV),已知的目标序列变异,通常在其他癌症突变基因,所有nonrelated关键信号通路相关基因进行了研究[16- - - - - -18]。

2。方法

2.1。病人和样品

患者纳入本研究新诊断通过细胞学检查,外周血、骨髓或吸入物分析和血统B淋巴细胞前体决心通过流式细胞术(见表1b病例特点)。所有的病人(成人和儿童的父母或监护人)为参与和治疗提供了书面知情同意的标准协议的血液学服务医院大学”博士。何塞·e·冈萨雷斯”,新莱昂州大学的医学院(UANL),墨西哥。患者接受感应与3或4药物缓解方案,基于以前公布的协议(19,20.]。儿童b被分层标准和高危人群根据公认的标准(见表1额外的治疗细节在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/828145)[8,21]。研究遵循赫尔辛基宣言的标准和制度伦理委员会批准的参考号码bi05 - 006。

共有73名患者提供诊断时外周血和一两个月后,b诊断。所有的样品收集2005年9月至2008年2月和3年的随访。共有225个样本用于研究,其中包括219名白血病(73年诊断,73,和73年的第二个月,resp)和6健康外周血控制。还有全血细胞计数(CBC)是为每个病人和bcr - abl易位的分子筛查评估定量实时聚合酶链反应(存在)的标准化协议失去德记录分子del Departamento de Bioquimica y药物分子de la Facultad药物de la UANL,墨西哥。

2.2。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

单核细胞被histopaque净化- 1077 (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)和保存在RNAlater解决方案(生活技术,卡尔斯巴德,CA)−20°C。从单核细胞总RNA提取使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒,西萨塞克斯郡,英国)根据制造商的协议。RNA浓度和其质量测定光密度测量的260/280,在260 nm和关系分别使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)。样品260/280 > 1.8的关系被用于下一步的分析。RNA是储存在−80°C到使用。1.0的互补脱氧核糖核酸合成μ克总RNA,在最后一卷20μL使用SuperScriptTM三世六聚体合成第一链SuperMix和随机(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。最后cDNA浓度测定和样本存储在−20°C。

2.3。基因选择和引物的设计

共有45个基因表示关键信号通路和功能流程被选为这个研究(表2);32他们以前相关的所有(的列表引用这些研究可能在额外的表2)咨询。此外,两个参考基因RPL13A和HPRT1被选为内部定量控制。选择特定基因引物实时qPCR化验底漆银行数据库(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)和表达载体提供的。CCR5的引物序列和产品尺寸,IL10, WNT5, FZD3, CTNNB1, GSK3B,物,SOS1、BCL11A, JAK2, STAT5,小君,BCL2A1, IL2RA, CCND2, RXRA, PDE4D, STAT1, CD10, CREB1,安全系数,CYLD, RAPGEF2, SORT1, HK2, S100A8, DOCK10, MYH9, PAPD5, CD2, CD3D, CD8A, PBX1,脂肪,NKG2-D, HOXA9, CD44, TNFRSF7, NOTCH1, DEFA1, OPAL1, CASP8AP2, PAX5, FLT3, MYC, RPL13A, HPRT1额外的表2中列出。每个引物组的效率和特异性被证实与标准曲线和融化的概要文件评估,并证实了相对于参考基因扩增效率标准曲线;后所有程序进行了各自的标准指南之前报道(22]。

2.4。定量实时聚合酶链反应

存在分析ABI 7900高通量实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)总量的20倍μ包含15 L ng的cDNA、1 x SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司Inc .)和每个引物的300海里。所有样本分析一式两份,并融化曲线分析来证实放大和缺乏特异性的引物二聚体。热循环程序由一个初始变性为10分钟在95°C,紧随其后的是一个放大的步骤40 15秒的周期在95°C和1分钟60°C。每个实验包括两个nontemplate污染控制,以发现任何模板。的方程应用于计算的相对表达b样品(23]。的均值量化周期(Cq)正常的血液样本被用作校准器。

2.5。统计分析

简单的比较规范化ΔCq值(平方ΔCq值)b例和健康对照组之间由学生决定以及或Mann-Whitney等级和测试。评价的b诊断能力选择的基因和/或截止值的基因表达,接受者操作特征曲线(ROC)分析。基因表达水平差异乘以被重复评估措施配对测试或魏克森讯号等级测试。Log-Rank生存分析评价生存曲线之间的差异(构造使用风平浪静生存(EFS)和复发存活率(RFS)所有病例)考虑截止值计算之间的基因差异表达* (ROC分析)。在这个评估定义的事件是复发或死亡和没有经验的情况下事件归类为EFS。EFS计算从诊断到最后随访的日期或发展的一个不利事件的3年期间监测。组织的优势比分析进行了积极的生存曲线之间的差异;案例分组是根据感兴趣的基因的基因表达水平高于或等于或低于截止之前计算。SORT1 IL2RA的有用性的评价,FLT3, DEFA1表达的独立预测因子b是由多元逻辑回归结果使用EFS / RFS作为因变量。最后,斯皮尔曼等级次序相关分析是用来测试之间的相关性与生存相关的基因表达水平和临床数据,如白细胞计数,百分比的白血病细胞,和/或诊断的年龄。统计检验,值低于0.05被认为是具有统计学意义。统计分析进行了σ的阴谋v。11和GraphPad拘谨的v5.03软件,分别。

3所示。结果

此次研究调查的对象包括73 b的情况下;75.3%(55岁)儿童(年龄范围:0 - 18岁)和24.7%(18)成年人(年龄范围:19岁到44年)。形态学、免疫和细胞遗传学(MIC)工作分类分组病例的90%的三个最常见的b诊断:所有常见,Pre-B-ALL,和b(表1)。39例(53.4%)被列为高危风险诊断和34(46.6%)作为标准。bcr - abl重排的存在被发现在3例(4.1%);其中一个研究的3年期间复发。的73 b包括19例(26%)患者在随访复发,4例(5.5%)死亡。

附加的表3显示了规范化ΔCq值获得了学习小组。45个基因表达分析,标准化ΔCq值23基因诊断,在一个月23,28日在第二个月开始治疗后b例和健康对照组(显示统计差异值< 0.05)。差异中发现19基因诊断(IL10、WNT5A FZD3,物,SOS1、小君,OPAL1, MYC, CCND2, PDE4D, CREB1,安全系数,CYLD, RAPGEF2, SORT1, DOCK10, PAPD5, HOXA9,和CASP8AP2)保持不变至少在第三个月的随访(表3)。截止值的测定和b诊断能力IL10, WNT5A OPAL1 CCND2, CASP8AP基因是决定(图1)考虑其显著区别的控件(值≤0.001)。获得的值的范围为曲线下的面积(AUC)和截止值这些基因是0.8673到0.953和4.015到44.79,分别。WNT5A一直显示,中华民国是最好的参数分析。考虑44.79规范化ΔCq WNT5A截断值,AUC曲线计算是0.953,敏感性为0.863,特异性的1,阳性预测值(PPV)等于1,和阴性预测值(NPV)为0.41。

基因的表达水平,显示ΔCq统计差异之间至少有一个时间学习小组确定使用健康对照组校准器(附加的表4)。额外的表4显示了30个基因表达水平的描述性统计评估。一般来说,ΔCq IL10观察组间差异,WNT5A, OPAL1, CCND2,和CASP8AP基因反映他们的超表达对控制和每个基因的表达水平的中位数是2.2,5.4,7.7,6.2,和6.6,IL10, WNT5A, OPAL1, CCND2和CASP8AP分别。

识别的结果与统计的差异表达基因通过时间显示在表中2。在b情况下考虑健康对照组校准器,23个基因的表达水平显示差异乘以评估(表2)。其中23个基因,只有IL2RA表达水平,观察到的差异SORT1 DEFA1, FLT3基因的至少一个学习时间与复发有关(表3)。差异值b之间FLT3表达水平的情况下,事件(复发或所有相关死亡)和风平浪静组三次研究一个常数()。当队列的分类诊断时间或组织被认为是风险,FLT3观察组织表达差异只在开始治疗的孩子(一个月)和标准风险()子组,分别。在同样的意义上,微分表达式IL2RA基因的组间(有/没有事件)是观察到b所有儿童的病例和诊断时间组(值< 0.05)。DEFA1表达差异在时间3的所有病例和高危患者(值< 0.05)。SORT1差异只在时间观察3成年人组()。

IL2RA确定之间的关系表达式,SORT1, DEFA1, FLT3基因和b生存,表达水平截止值之和的特异性和敏感性最高的(最近的两个)确定每个基因的ROC分析。在这个测试中,b病例分组风平浪静的病人和那些事件(复发或死亡)。计算截止值被用来构建和比较生存曲线使用b患者表达水平高于截止和b的情况下表达水平等于或低于计算截止。获得的结果在图所示2和表4,分别。生存曲线之间有统计学差异的学习小组(由图中定义的值)的所有基因和时间评估(值< 0.05);IL2RA表达式所代表的例外是在b诊断时间在儿童和DEFA1 3高危组,分别为(值> 0.05)。生存时间之间的差异群体范围从6.13 (FLT3-T1)到22.5(表(FLT3-T2-standard风险)个月4)。识别风险由这些差异,口服补液盐计算保留相同的分类标准团体(高于或等于/低于截止值)。b为IL2RA表达式值,患者SORT1, FLT3基因DEFA1截止值以上复发/死亡的风险增加从3.73到27倍相比,患者表达式值等于或低于被切断(值< 0.05)。FLT3表达式仅能检测不同的生存时间的6.13到11.8个月,复发/死亡风险增加从3.73到6.05在诊断时,在一个月,两个月后开始治疗,分别。只考虑时间3 b的成年人,一个表达式FLT3-T3 >−0.304水平显著事件复发/死亡的几率增加了27.0倍(或= 27个;95%置信区间:2.0—-368.4,),风险最高的计算从一个特定的基因。在这群提到截止,观察到不同组之间的生存时间是13.43个月()。FLT3表达也与生存相关儿童时2 (标准风险组)和一个月后开始治疗()。独立于FLT3状态,患者的表达水平高于1.173 IL2RA b诊断时候显示减少生存时间6.35个月()和风险增加的3.73倍(95%置信区间:1.3—-10.72;)复发/研究人口死亡。

2个月后开始治疗,而b的情况下表达水平低于或等于3.041,患者表达水平因为DEFA1 > 3.041事件的几率增加了4.38倍(95%置信区间:1.5—-12.5;)。最后,在成人时3 b的情况下与SORT1表达水平> 5.007显示不同的生存曲线相比,例表达水平低于或等于截止这个基因();然而,尽管增加复发的风险/死亡患者的14倍SORT1表达水平高于5.007,他们值反映的仅仅是一个统计趋势()。

评估的有效性IL2RA SORT1, FLT3, DEFA1表达的独立预测因子b使用EFS多元逻辑回归结果/ RFS作为因变量进行。在统计建模,白细胞计数,年龄、性别、年龄(儿童/成人),b immunophenotype,和SORT-T1 DEFA1-T1, FLT3-T1-3, IL2RA-T1表达水平作为独立变量。白细胞计数明显b的结果预测(),immunophenotype(或= 2.6,95% CI -5.1 = 1.4,),DEFA1-T1(或= 6.1,95% CI -36.9 = 1.01,)和FLT3-T2(或= 8.6,95% CI -69.3 = 1.1,),分别。

,目的是为了测试如果临床数据包括不同的白血病细胞细胞的计数恢复跨样本影响了基因的表达水平与生存相关,进行相关分析。白细胞计数,在这个分析时代,b诊断和诊断数据爆炸的31个参与者包括与FLT3-T1及其相关性,SORT-T1, DEFA1-T1表达水平进行评估。显著的年龄之间的相关性,白细胞,与FLT3-T1爆炸细胞计数,SORT-T1或DEFA1-T1表达水平没有观察到(值> 0.05)。以下对变量之间的正相关关系被确认:FLT3-T1 / FLT3-T2 (,),FLT3-T2 / FLT3-T3 (,),FLT3-T1 / IL2RA-T1 (,),IL2RA-T1 / DEFA-T1 (,),分别。

4所示。讨论

在基因表达分析研究在所有已经确定了与复发性细胞遗传学异常和相关基因表达特征在体外药物反应,很少有研究报告和验证基因表达生存的分类器(12]。在这项研究中,基因表达的生物标记物无复发生存来自三个不同的时间点的基因表达谱的样本73例b(55儿童和18岁成人)。我们评估45-probe-set含有独特的基因与白血病的主要改变细胞信号通路有关数据显示基地(NCBI GeneCards,等等)。

规范化ΔCq值19基因显示一致的差异情况和控制至少要等到第二个月的随访。有趣的是,观察到的差异是独立的治疗。IL10、WNT5A OPAL1、CCND2 CASP8AP2规范化ΔCq提出最显著区别的控制;WNT5A是最好的敏感性和特异性的基因交换,因此最好的潜在生物标志物评估b诊断。这些发现是相关的,因为这组23基因可能被视为一种b相关签名和未知在白血病生成过程中的作用应该在将来的研究中得到解决。控制相比,规范化ΔCq IL10差异,WNT5A, OPAL1, CCND2,和学习小组之间CASP8AP2翻译这些基因的超表达;高表达的IL10、OPAL1 CCND2之前已经报道过(24- - - - - -28]。与我们的研究使用PBMC样本下CASP8AP2和WNT5A基因的表达在骨髓标本之前报道b的情况下(29日,30.]。这种冲突可能相关的不同来源生物样品评估的研究(PBMC或骨髓)。

比较b基因表达水平随着时间的病人显示一致的一组23基因差异至少两三个时间点的评价和表达水平的差异IL2RA, SORT1 DEFA1, FLT3基因至少在一个时代的研究与复发和/或有关B-ALL-related死亡。有趣的是,过度的FLT3 b一,两个月后开始诊断和治疗与复发/死亡在我们学习小组;这些研究结果建立了不考虑子分类的临床特征和重要的儿童(时间2)成年人(时间3),标准风险(2)子组。IL2RA在b超诊断是重要的在孩子们的小组。在同样的意义上,而DEFA1超表达是重要的所有b例(3)和高风险群(时间3),SORT1超表达只是不同成人之前(时间3)。结果表明,通过在特定的基因表达谱差异可能有助于识别基因能力确定b例复发更高的潜在风险。

分组b例风平浪静的病人和那些事件(复发或死亡),我们计算表达式IL2RA截止值水平,SORT1 DEFA1, FLT3 ROC分析。这些截止值允许我们构建和比较生存曲线(并计算各自的口服补液盐),b组患者表达水平高于计算截止和患者的基因表达水平等于或低于各自的截止。在我们的研究中患者为IL2RA表达式值,SORT1, FLT3, DEFA1基因超过截止值/复发死亡的风险增加从3.73到27倍相比,b患者表达值等于或低于这些短裤(值< 0.05)。FLT3基因表达的有用性来预测复发/死亡的风险增加更明显比其他的基因;因为考虑到他们被切断,这种基因能够识别不同的生存时间在6 - 22个月,和复发/死亡风险从3.73增加到27次。例如,在成年人在2个月后开始治疗的最高风险观察患者FLT3-T3 >−0.3036的表达水平,这提出了一个减少平均生存时间为13.43个月,增加的可能性事件(复发或死亡)的27倍(或= 27个;95%置信区间:2.0—-368.4,)。这一趋势b FLT3结果是有效的情况下没有子分类研究在任何时间,一个月后开始治疗的儿童和高危组,分别。FLT3基因是一个第三类受体酪氨酸激酶信号通路参与调节多能干细胞的增殖,早期祖细胞,不成熟的淋巴细胞。异常表达FLT3已经观察到高水平的血液恶性肿瘤,包括AML的70%到100%,b、t细胞的一小部分,在爆炸淋巴CML危机31日];然而,这是第一个报告,评估其潜在作用和关联b预后。这些结果表明,FLT3表达谱的不断监测可能会导致一个更好的监控与治疗协议。

提到在本研究中是很重要的bcr - abl重排的存在是在b的情况下评估;只有三个病人(4.1%)为这个分子异常积极。考虑到患者的数量这个易位是低和其它分子的筛选异常并不包含在描述的情况下,我们决定不删除它们从分析;然而,尽管这种限制,获得的结果(没有分子异常分类)显示一个重要的预后与b,和三个基因的表达了其效用来识别风险的复发/死亡患者的b(不包含额外的临床分类),考虑到在染色体数目和结构异常出现在70 - 90%的b的情况下8- - - - - -10),有可能预后协会观察可能是一个独立的因素存在的分子重组。然而,重要的是要注意,其他的角色no-BCR-ABL异常基因的表达特征评估在这个协议代表了一个重要的问题去探索,因此其对预后影响这些基因应该评估的价值。

我们已经表明,早期治疗反应评估通过分子动力学方法b最初诊断和/或2个月后开始治疗是高度与b患者的预后有关。临床应用这些预后标记可能允许未来的识别的一个重要子群的所有患者治愈的可能性很小,如果与现代化疗方案治疗,可能表明需要一个早期的干细胞移植或生物靶向治疗。进一步分析这些表达谱加上额外的全面的基因组研究将有望导致小说的成功识别这些患者的治疗目标和更有效的疗法。

5。结论

早期治疗反应的动力学评估分子措施1和2个月后开始治疗是高度与白血病预后相关。超表达FLT3和DEFA1基因保留独立的预后意义b的结果,反映了复发的风险增加/研究人口死亡。

缩写

全部:	急性淋巴细胞白血病
慢性淋巴细胞白血病:	慢性淋巴细胞白血病
AML:	急性成髓细胞的白血病
CML:	慢性成髓细胞的白血病
存在:	定量实时聚合酶链反应
Cq:	量化周期
PBMC:	外周血单核细胞
中华民国:	接受者操作特性曲线
AUC:	曲线下的面积
EFS:	风平浪静的生存
RFS:	复发存活率。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

研究的概念和设计由Rocio Ortiz-Lopez和Idalia Garza-Veloz;采集的数据是通过Idalia Garza-Veloz,玛格丽塔l . Martinez-Fierro卡罗尔Carrillo-Sanchez,和天使Lugo-Trampe;分析和解释数据是由玛格丽塔l . Martinez-Fierro Idalia Garza-Veloz,玛丽亚瓜达卢佩Ramos-Del Hoyo, Jose Carlos Jaime-Perez;起草论文和评论是由玛格丽塔l . Martinez-Fierro Idalia Garza-Veloz, Jose Carlos Jaime-Perez玛丽亚瓜达卢佩Ramos-Del Hoyo,天使Lugo-Trampe,大卫•Gomez-Almaguer塞萨尔赫Gutierrez-Aguirre,奥斯卡Gonzalez-Llano,罗萨里奥Salazar-Riojas,阿尔弗雷多Hidalgo-Miranda,奥古斯托Rojas-Martinez, Rocio Ortiz-Lopez;论文的最后批准通过Idalia Garza-Veloz,玛格丽塔l . Martinez-Fierro Jose Carlos Jaime-Perez卡罗尔Carrillo-Sanchez,玛丽亚瓜达卢佩Ramos-Del Hoyo,天使Lugo-Trampe,奥古斯托Rojas-Martinez,塞萨尔赫Gutierrez-Aguirre,奥斯卡Gonzalez-Llano,罗萨里奥Salazar-Riojas,阿尔弗雷多Hidalgo-Miranda,大卫Gomez-Almaguer Rocio Ortiz-Lopez。Idalia Garza-Veloz和玛格丽塔l . Martinez-Fierro同样导致了这项工作。

确认

作者感激地感谢所有参与者的协议。这项工作是支持的CONACYT-SALUD批准号祝您健康- 2004 - co2 - 26所示。

补充材料