文摘

我们分析了794−之间的关系−173 G > CMIF多态性与mRNA和可溶性MIF在年轻的肥胖受试者。共有250名年轻的学科,150正常体重和100名肥胖受试者招募了研究中。794年−基因分型−173 G > CMIF多态性是由PCR和PCR-RFLP分别。MIF mRNA表达由实时PCR和使用酶联免疫试剂盒测定血清MIF水平。对于这两个MIF启动子多态性,没有显著差异基因型和等位基因频率在两组之间被观察到。MIF在肥胖受试者mRNA表达略高于正常体重者(1.38倍),而可溶性MIF水平并未显示差异组。此外,我们发现增加MIF mRNA表达在运营商的6中,6和C / C基因型和6克−794的单体型−173 G > CMIF多态性,尽管它并不重要。总之,本研究没有发现肥胖和之间的关系MIF肥胖基因启动子多态性与MIF mRNA表达年轻学科。

1。介绍

肥胖是一种慢性的、复杂的、多因素的疾病,其特征是慢性轻度全身炎症状态。这种慢性炎症参与胰岛素抵抗(IR),这是潜在的2型糖尿病(T2DM)病人体内的条件和代谢综合征1,2]。多项研究表明,肥胖是与血清水平升高相关的广泛的炎症标记物包括c反应蛋白(CRP)、白介素6 (il - 6)、白介素8(引发)和单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) [3,4]。

巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种蛋白质分子量为12.5 kDa [5];这是1966年报告的第一个细胞因子,称为T细胞衍生的细胞因子抑制巨噬细胞的随机迁移在体外和促进巨噬细胞积累在dth反应(6,7]。由于MIF是公认的促炎细胞因子和肥胖与慢性炎症反应有关,MIF可能影响肥胖的病理生理学(5,8]。MIF是由不同的细胞和组织,包括T细胞,巨噬细胞,单核细胞,脑垂体,成纤维细胞,内皮细胞,脂肪细胞9- - - - - -11]。此外,MIF counterregulates免疫抑制的行为表达和分泌的糖皮质激素,促进肿瘤坏死因子等促炎介质α(肿瘤坏死因子α)、白介素1β(il - 1β)、白介素2 (2)、il - 6、引发和干扰素(干扰素γ)[5,12,13]。

先前的研究已经报道,循环MIF在类风湿性关节炎(RA)水平升高,系统性红斑狼疮(SLE)红斑,胰岛素抵抗(IR),和2型糖尿病(T2DM)病人体内。因为这些疾病都伴随着持续的炎症不同程度的14- - - - - -17),重要的是进行研究,试图阐明MIF在疾病发展的作用。

增加可溶性MIF水平也被报道在肥胖受试者;一些流行病学研究与循环MIF水平增加炎症的标记和标记β细胞功能障碍。此外,它已被观察到,身体活动和dietary-focused体重管理项目导致减少肥胖受试者(MIF水平18- - - - - -20.]。

的MIF基因位于染色体22 q11.23已经与腹部肥胖在全基因组连锁扫描的白种人。这可能表明,染色体区域是一个敏感性轨迹腹部肥胖的一个特定的人口(21]。两个多态性已确定在启动子区域相对于网站的转录功能重要性:(1)短串联重复序列(STR)−794MIF (rs5844572),这是一个微卫星重复Cytosine-Adenine-Thymine-Thymine−794个基点(土)位置,和重复长度(5到8个重复),与基因表达增加,循环MIF水平;(2)单核苷酸多态性(SNP)−173 G > C MIF−173 (rs755622)位置MIF基因改变与鸟嘌呤(G)胞嘧啶(C)。−173 * C等位基因与mRNA表达和传播有关MIF水平(22- - - - - -24]。在先前的报道中,两个功能MIF多态性与自身免疫/炎症相关疾病如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病关节炎,以及肥胖和糖尿病15,22,25- - - - - -31日]。

本研究的目的是调查794−之间的关系−173 G > CMIF多态性与MIF mRNA和可溶性MIF表达年轻肥胖受试者。

2。材料和方法

2.1。主题

我们招募了总共250例,18 - 30岁,150正常体重者和100例肥胖格雷罗州,墨西哥。排除标准包括急性炎性疾病或任何药物摄入量的调查。所有科目研究之前给他们的书面知情同意。这个协议是研究大学的伦理委员会批准的格雷罗州(注册号012/2013)。

2.2。人体测量和临床测量

体重决定在光的衣服和鞋子,使用Tanita身体成分监测(转发Tanita延长- 300 GS),和高度使用测距仪测量精确到0.1厘米(Seca,汉堡,德国)。从这些测量,计算体重指数(BMI(体重/身高²公斤/米²)。对象被划分的BMI,肥胖≥30公斤/米²和正常体重< 24.9公斤/米²根据标准,由肥胖类由世界卫生组织(32]。身体测量周长与人体测量磁带准确在±0.1厘米(Seca, 201年,德国汉堡)。血压测量的坐姿与自动血压计(欧姆龙)休息10分钟后左胳膊。收缩压(SBP)、舒张压(菲律宾)计算从两个读数的最小间隔10分钟。

2.3。实验室测量

5毫升的静脉血液样本是来自每个主题后至少12小时禁食。生化参数,如总胆固醇、脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度)、甘油三酯(TG)、空腹血糖水平,分析了立即通过酶比色方法与商用设备(Spinreact)。MIF血清水平的确定是由一个商业工具(传说马克斯人类活跃的MIF酶联免疫试剂盒,BioLegend)根据制造商的指示。MIF检测灵敏度为17.4±9.2 pg / mL。代谢综合征的诊断的标准是基于国家胆固醇教育计划成人治疗小组III (NCEP ATP III) [33]。

2.4。794年−基因分型和−173 G > C MIF多态性

从外周血白细胞基因组DNA提取和存储−20°C到分析。794−MIF多态性分析了常规聚合酶链反应(PCR)在热循环(Techne tc - 412)使用以下引物:5′tgt有条件现金转移支付总部有条件现金援助GCT ATG TC-3′(向前)和5′cac TAA TGG TAA行动CGG GG-3′(反向)。循环条件如下:最初在94°C变性5分钟紧随其后30周期30年代在94°C, 30 s 60°C, 30年代在72°C,然后最后一个延长5分钟在72°C。放大产品可视化在8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳后AgNO沾2%₃。片段的129、133、137和141个基点794−凯特表示₅794年−土生₆794年−土生₇,以及794−凯特₈分别等位基因。

−173 G > CMIF多态性是通过聚合酶链反应和限制性片段长度多态性的基因(PCR-RFLP)。放大的366个基点片段完成使用之前报道引物(34];28日周期和60°C的退火温度。获得的片段被消化Alu我限制性内切核酸酶(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)在一夜之间孵化37°C。最后,消化解决6%的聚丙烯酰胺凝胶AgNO沾2%₃。−173 g等位基因导致了268年和98年英国石油碎片而−173 c等位基因被发现,到206年,98年和62年英国石油碎片。

2.5。MIF表达分析

外周血EDTA血液中收集收集管(美国新泽西州BD Vaccutainer)。抽血后立即(< 1 h),总白细胞分离使用右旋糖酐试剂(USB公司,克利夫兰,哦,美国),和总RNA是获得使用试剂盒试剂(生命技术)根据Chomiczyki和萨基方法(35]。分光光度法测定RNA浓度和纯度(NanoDrop 2000 c,热科学)。互补脱氧核糖核酸合成的1μ克总RNA,用oligodT和逆转录试剂的制造商(Promega公司(美国)。互补脱氧核糖核酸样本存储在−80°C到实时PCR检测。MIF和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达量化使用TaqMan探针和样品都是运行在一式三份使用TaqMan基因表达分析协议的条件表示在光周期计纳米系统(罗氏应用科学)。相对基因表达水平计算使用方法(相对表达式表示为单位),验证后类似反应的效率感兴趣基因(MIF)和参考GAPDH基因通过运行连续稀释的基因(36]。

2.6。统计分析

数据分析使用占据软件(v.11.0)和GraphPad棱镜5软件。组间差异特征进行了分析使用卡方检验分类变量(数据作为百分比),学生的以及对参数变量(数据作为平均±标准差),和Mann-Whitney以及非参数变量(数据值和5日第95百分位数)。哈迪温伯格平衡测试和基因型和等位基因频率的计算是通过卡方检验。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。人体测量和生化特征

正如预期的那样,肥胖受试者高体重、体重指数、腰围、臀围、腰臀比值,以及葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平比正常体重者()。没有明显差异在年龄、性别、群体之间或高密度脂蛋白胆固醇水平()(数据未显示)。

人体测量和生化特征以及代谢异常的研究对象根据性别如表所示1。两组的正常体重和肥胖,体重、身高、腰围、腰臀比、血压参数在男性高于女性(),而正常体重的男性有着较低的高密度脂蛋白胆固醇水平和身体脂肪量()和肥胖男性有高TG水平(从每个各自组)与女性相比。

表1也显示了代谢综合征的患病率及其组件,我们发现在正常体重组高血压患病率较高(分别为12%和2%,)和高胆固醇血症(20%和6%,男性比女性)。肥胖组高血压患病率(41%比16%,)、空腹血糖受损(8%和0%,)、高甘油三酯血症(51%和25%,),代谢综合征男性高于女性(49%比28%,)。

3.2。−分布794和−173 G > C MIF多态性

这两个MIF启动子多态性分析哈迪温伯格平衡在对照组(−794,−173 G > C,)。−794的分布−173 G > CMIF多态性在正常体重和肥胖受试者如表所示2。基因型和等位基因频率的比较分析−794−173 G > CMIF多态性团体之间没有显著差异。我们还比较了临床和生化变量通过基因型MIF多态性,但我们没有观察到显著差异(数据没有显示)。此外,我们进行单体型分析的多态性考虑以下组合:5克,6克,7 c。估计频率的5 g, 6 g和7 c单是14%,48%,和38%,分别在总人口(数据没有显示)。

3.3。MIF表达启动子多态性的关系的研究团体

相对MIF mRNA表达总在肥胖受试者白细胞略高于正常体重者(1.38倍)(图1)。研究两种多态性的功能影响,定量MIF mRNA表达在不同基因型多态性进行了分析。当我们分析了表达式根据STR−794MIF我们发现,运营商的6 6表达基因型略高于7相比,7基因型,而后者对5 5基因型,在总人口(1.38 > 1.08 > 1)(图2(一个))。同样的,当我们组的表达相比,适度增加MIF mRNA表达在6日6运营商两组,而7,7航空公司低表达在肥胖组。此外,6 6肥胖运营商表示mRNA表达略高于正常体重6 6运营商(图2 (b))。运营商−173 C / C基因型的表达稍微高于G / G基因型携带者的总人口(1.47 > 1)(图3(一个))。当我们组的表达相比,适度增加观察MIF mRNA的表达载体的C / C基因型相比,G / G基因型在两组(图3 (b))。分析794年−的综合效应−173 G > CMIF多态性MIF mRNA表达,我们分析了表达式根据5克,6克,7 c单。我们发现6克的运营商单体型表达最高7 c单体型相比,而后者对总人口的5 g单体型(1.38 > 1.21 > 1),尽管它不显著(图4(一))。同样,在两组中,6 g单体型的航空公司有很高的MIF mRNA表达(图4 (b))。

3.4。血清MIF水平和MIF启动子多态性

我们分析了MIF血清在肥胖和正常体重者,但我们没有发现两组之间的显著差异()(图5)。当MIF根据794−血清水平进行了分析−173 G > CMIF多态性,我们没有观察到显著差异(数据没有显示)。此外,MIF血清水平之间的相关分析和措施执行中央肥胖。两组的正常体重和肥胖的主题,我们没有观察到MIF血清水平与体重之间的正相关关系,BMI,周长腰部和臀部和腰臀比值()(数据未显示)。

4所示。讨论

这项研究表明,MIF mRNA表达在白细胞总数略有增加肥胖受试者相比,正常体重组。然而,我们没有发现一个重要的关联−794−173 G > CMIF多态性与MIF mRNA表达年轻肥胖受试者。

6、794年−6基因型频率多态性和G等位基因的频率−173 G > C多态性在墨西哥混血儿类似于先前的研究从墨西哥西部的人口15,27,28,37]。相反,−794MIF多态性,5、6基因型是最常见的日本人口(29日),苏格兰民族党−173 G > C, C等位基因在高加索银屑病关节炎患者最常见的(38]。794年−的情况下MIF多态性,我们没有观察到的基因型794−土₈高表达基因报告为低频率(1%)在墨西哥混血儿RA患者和0.4%的日本主题27,29日]。这些差异可能是由于样本大小和入选标准在每一个研究中,以及种族影响种群中不同的民族起源,从而赋予更大的遗传多样性在这些多态性的分布39,40]。

几项研究已经报道的相对MIF mRNA表达在肥胖受试者。Dandona和同事表明MIF mRNA表达单核细胞是在肥胖病人与对照组相比显著增加,与血浆游离脂肪酸(FFA)浓度和BMI但不是MIF等离子体浓度或HOMA-index [18]。在另一项研究中,增加了MIF mRNA表达单核细胞中观察到肥胖与体重指数[主题和相关41]。我们的研究结果表明,MIF参与肥胖的病理生理学及其与代谢并发症之间的关系。

很少有研究报道之间的关系MIF基因多态性和肥胖。2006年,Sakaue和同事发现−794MIF日本人口(多态性与肥胖有关29日]。在另一项研究中,6、7基因型的MIF−794多态性与在墨西哥西部的人口对急性冠脉综合征(37]。据我们所知,这是第一个研究报告之间的关系MIF基因多态性和MIF mRNA表达在肥胖的年轻的学科。794年−多态性携带者的6 6基因型相比略高MIF mRNA表达的其他基因型肥胖和nonobese科目。除此之外,肥胖6 6运营商高mRNA表达与正常体重6相比,6运营商,尽管它并没有统计学意义。之前,有报道称这个重复调节基底和stimulus-induced转录活动,从而增加几乎与重复数比例的定义在体外分析系统。报告基因分析表明,土生₅等位基因最低基础水平以及刺激MIF子活动相比,凯特₆和土₇等位基因在体外(22,42),但它是未知的哪种类型的转录因子调节MIF表达通过启动子区域包含卡特重复,而土生的运营商₇等位基因显示高循环MIF水平(24]。

−173 G > C多态性,我们发现C / C基因型携带者的略高MIFmRNA表达G / G基因型相比,在肥胖和nonobese科目,尽管它并没有统计学意义。报告基因分析,表明−173 G > C多态性基因转录调节中扮演重要角色的程控依赖的方式C等位基因促进转录在人类T淋巴母细胞细胞系(CEMC7A),而G等位基因有利于转录在肺上皮细胞系(A549)。表达的变化可能是由于不同的转录因子MIF−173元素的交互。基于启动子序列分析,AP-4转录因子是一个特定的候选人(23]。此外,C等位基因与增加循环MIF水平(23,24]。这些发现提供了一种生物支持本研究的结果。

正如上面提到的,这两个多态性基因启动子活性的影响通过交互在体外;因此功能多态性的影响应该被认为是对单体型。我们发现6克的运营商和7 c单有适度增加MIF mRNA表达相比,5 g总人口的单体型,但在肥胖受试者和控制6 g单体型的运营商倾向于增加MIF mRNA的表达。等位基因6经常被发现在我们的人口和其他研究已被确定为一个高表达基因等位基因一起7和8;因此MIF表达的增加可以归因于等位基因6。这一发现与之前的研究一致报告基因分析,它表明,6 g单体型最高MIF发起人上皮细胞系A549的活动,显示功能的重要性MIF在确定启动子单体型的MIF基因转录水平(43]。此外,在白人和非洲裔美国人的人口与系统性红斑狼疮、7 c单体型与高循环MIF水平(26]。此外,794−凯特₇和−173 c多态性连锁不平衡在一个墨西哥混血儿人口(,),这表明这两个等位基因都隔离在块从一代到另一个,可能会带来类似的风险27]。

同时,我们没有发现显著的MIF血清水平在两组之间的差异。然而,其他研究显示增加MIF与肥胖和2型糖尿病受试者的血清。Dandona等人报道血清MIF水平之间的相关性和身体质量指数(BMI),发现肥胖受试者平均BMI公斤/米²有一个显著的更高的空腹MIF浓度(ng / mL)比苗条对照组(BMI公斤/米²;ng / mL) [18]。同样,增加MIF血清水平被发现与正常体重超重的青少年相比,和MIF浓度与标记相关的炎症和肥胖20.]。其他研究证实MIF等离子体水平升高在肥胖个体相比,精益科目(41,44]。此外,一些药物的效果和循环MIF水平减少体重已经确定。在肥胖受试者与二甲双胍治疗,一种降糖药的MIF血浆浓度的下降来ng / mL后6周的干预,撤军的药物后,MIF水平回到初始值指示metformin-dependent效应(18]。此外,病态肥胖受试者参与饮食和身体活动基础体重管理项目循环MIF浓度明显下降后体重14.4公斤的19]。在另一个减肥计划,实现减重4.4公斤的MIF的循环水平下降了67% (45]。然而,在这些研究相比,病态肥胖受试者的BMI公斤/米²表明等离子体MIF水平低(约ng / mL);胃的手术后,体重指数显著下降(公斤/米²期间为6个月),而MIF浓度保持低体重,之后他们明显增加正常水平在术后24个月(46]。肥胖和MIF之间的关系不一致和肥胖之间的因果关系和MIF水平还有待确认47]。因素,可能导致这些研究包括性别差异的变化,因为MIF等离子体水平高于男性(30.),激素替代疗法(HRT)的使用,因为女性荷尔蒙替代疗法显示2-3-fold等离子MIF水平较高(19),昼夜节律(48),和差异MIF启动子基因启动子活性的变化和MIF血清水平(22- - - - - -24,30.]。然而,−794−173 G > CMIF多态性与MIF血清水平没有显著差异在我们的研究中,结果类似报道墨西哥混血儿RA患者(27,系统性红斑狼疮15],银屑病关节炎(28];然而,他们不能够复制的协会MIF多态性与MIF血清水平;这可能是由于我们的人口的遗传结构的差异可能会影响活动MIF基因位点。

我们的结果没有显示出mRNA表达之间的相关性和MIF血清水平,在肥胖受试者mRNA表达略高但不是MIF血清水平与体重正常组相比。众所周知,一个特定基因的mRNA表达并不总是预测蛋白质的表达,和两者之间的相关性有很大的差别49]。有几种可能的解释mRNA和蛋白水平之间的差异,这些可能不是相互排斥的,包括复杂的转录后的机制和差异蛋白半衰期因为细胞可以控制细胞中的蛋白质水平的利率下降或为给定的蛋白质合成,以及不同敏感性的方法检测mRNA和蛋白表达50]。这些可能性可以解释我们的数据。要理解这种不和谐的原因,合成与降解的动态过程MIF必须在未来的研究调查。

最后,一些限制我们的研究应该考虑异质性等并发症的研究对象,在参考我们的小样本大小,更肥胖组改善研究的力量是可取的。

总之,我们没有找到证据来支持肥胖和之间的关系MIF肥胖基因启动子多态性与MIF mRNA表达年轻学科。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持的Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia,格兰特infr - 2014 02/229958。CONACYT Ines Matia-Garcia收到奖学金(没有。231182)。