文摘
背景和目的。mir - 223最近的失调与各种疾病与全身性炎症反应如2型糖尿病、癌症和细菌感染。然而,矛盾的结果是可用的潜在改变在脓毒症血清mir - 223水平。我们因此旨在评估mir - 223的诊断和预后价值重要疾病和脓毒症患者血清浓度。方法。我们使用输液注射脂多糖(LPS)以及盲肠的结扎和刺杆(CLP)小鼠脓毒症诱导的幼童腹壁薄弱和测量改变血清mir - 223水平。这些结果从老鼠翻译成一个良好的大群危重病人承认医疗重症监护室(ICU)。最后,结果分析患者相关临床资料和广泛的常规和实验生物标记集。结果。虽然注射LPS诱导小鼠血清mir - 223水平轻度升高,血清mir - 223水平无显著变化被发现在老鼠CLP-induced败血症。依照这些结果来自动物模型血清mir - 223水平危重患者和健康对照组没有差异。然而,ICU患者更严重的疾病(APACHE-II分数)显示,适度降低循环mir - 223。引人注目的是,mir - 223水平没有差异被发现在病危或没有脓毒症患者,血清mir - 223水平并没有与古典炎症或细菌感染的标志。最后,低血清mir - 223水平适度与不利预后相关的患者在ICU治疗但没有预测长期死亡率。结论。最近的报告改变在脓毒症血清mir - 223水平揭示矛盾的结果,防止潜在的microrna在临床常规使用。我们清楚地表明,血清mir - 223水平不能反映脓毒症的存在在小鼠模型和群体的ICU患者和不表明危重患者的临床结果。因此血清mir - 223水平不应被用作生物标记在此设置。
1。介绍
脓毒症是一个危重病人死亡的主要原因在重症监护室(ICU)治疗1]。在这种背景下,早期诊断和启动的具体治疗措施被证明大大减少危重患者脓毒症的死亡率。因此,除了建立实验室参数和临床评分、新型生物标志物可能显著改善病人的治疗和预后评估的重症监护室(2]。
小分子核糖核酸(microrna)表示小rna的22个核苷酸长度不保留顺序信息转录蛋白但功能在真核生物基因表达的关键监管机构(3,4]。microrna参与多种病理生理过程,如细胞损伤,细胞增殖,或致癌作用5- - - - - -7]。描述了特定放松管制的microRNA mir - 223在不同疾病状态与系统性炎症反应有关,如细菌感染或自身免疫性疾病。虽然这可能代表这些疾病的附带现象,最近的证据表明,mir - 223是积极参与炎症过程的监管限制防止附带损害的炎症和组织损伤8]。符合这一假设的不同目标mir - 223属于炎症基因的总科如granzyme B, IKK-alpha, STAT3。此外,mir - 223的表达本身是由炎症通路如NF -κB或TLR4通路,暗示深度集成的microrna的炎症信号级联产生炎症和anti-infectious反应(8]。
除了他们的功能参与基因表达,microrna可以释放到细胞外室,很容易检测到体液,如血液、汗液和尿液。然而,目前对血清microrna管制的重要疾病和脓毒症患者。这是表明血清水平等不同的microrna mir - 133 a, mir - 150, mir - 146 a显著改变在危重患者与健康对照组(9- - - - - -11]。重要的是,改变血清mir - 223水平描述在脓毒症患者,但尚未导致冲突的结果。王等人的描述发生在败血症患者更高水平的mir - 223 (12),建议直接联系高血清mir - 223水平,病人的结果(13),王等人报道低水平的血清mir - 223的感染性疾病患者(11),从而强调需要进一步研究阐明mir - 223的规定在细菌感染和败血症。
考虑人类感染性疾病的复杂性,我们首先分析血清mir - 223水平在不同的脓毒症小鼠模型实验幼童腹壁薄弱如盲肠的结扎手术穿刺(CLP)和脂多糖(LPS)注入。翻译我们的发现从这些动物模型与人类发病机理,分析血清mir - 223水平在一个大的特征明显的221名危重患者(有或没有脓毒症),证明血清mir - 223水平不能反映感染性疾病的存在,不与病人的临床结果在重症监护室治疗。
2。材料和方法
2.1。研究设计
在本研究中,我们前瞻性地招募了221名患者(141名男性,80名女性),平均年龄为63岁(范围:18岁到89岁),连续承认一般内科重症监护病房(ICU)医院亚琛大学(14]。收集血液样本住进加护病房时(治疗前),在2000 g离心10分钟,血清样本存储在−80°C到使用。此外,75名健康献血者(47岁男性,29岁的女性,平均年龄33年,和范围18 - 67)与正常血值计数、c反应蛋白和肝酶是从当地招募献血中心健康对照组(14]。患者纳入研究时提供书面知情同意和伦理委员会批准同意过程。研究协议符合赫尔辛基宣言》,并经当地伦理委员会批准(RWTH亚琛大学医院的伦理委员会大学、亚琛,德国,参考号EK 150/06)。我们不包括患者将有一个短期(< 72 h)重症监护治疗由于postinterventional观察或急性中毒为本研究[14]。患者达到相关标准提出的美国胸科医师学会和危重病医学的社会共识会议委员会严重脓毒症和脓毒性休克被归类为脓毒症患者和其他人nonsepsis病人。按照目前所有患者治疗脓毒症治疗指南(拯救败血症患者运动)和各自的具体指导方针。病人的临床过程是跟进一段三年通过直接接触病人,病人的亲戚,或者他们的初级保健医生(10]。
2.2。病人的特点
细菌性败血症的标准进入加护病房的时间点完成到137年的221例患者(表1)和肺炎感染最常见的网站(表表示2)。脓毒症患者经常和更长时间条款需要机械通气的水平明显高于有经常性地使用生物标志物的炎症(原降钙素c反应蛋白,白细胞计数)和nonsepsis病人的队列(表1)。nonsepsis患者心肺疾病(心肌梗死、肺栓塞和心脏肺水肿),失代偿肝硬化,或其他重要条件代表的主要病因,没有不同的脓毒症患者的年龄或性别。两组没有差别在急性生理和慢性健康评估(APACHE)二世和简化的急性生理评分2 (SAPS2)得分,血管加压的需求,或实验室参数表明肝脏或肾脏功能障碍(表1)。
2.3。盲肠的结扎和穿刺(CLP)
盲肠的结扎小鼠模型和穿刺(CLP)使用作为一个完善的脓毒症模型幼童腹壁薄弱。雄性C57Bl / 6小鼠(,年龄6 - 8周)从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)和受到CLP手术,如前所述[15]。血液被前和手术后24小时和血清存储在−80°C到使用。根据欧洲动物收到人道关怀,国家、和制度规定。
2.4。有限合伙人注入
内毒素介导脓毒症是由脂多糖(LPS),这是革兰氏阴性细菌的一个组成部分。2.5μg每克体重在雄性C57BL / 6小鼠腹腔注射,和老鼠8小时后被杀害。
2.5。从血清microrna的隔离
对于microrna的隔离我们使用400年μ从70年人类或血清Lμ从小鼠血清L。如前所述(16),血清就被掺入了miScript microrna的模仿SV40(试剂盒2μM, 1μL / 100μ血清L)样本归一化。800年μL苯酚(Qiazol)和200年μL氯仿被添加到示例和混合大力15秒之后,在室温下孵化了10分钟。然后样本离心机15分钟在12000 g和水相,包含总RNA,沉淀了500年μL 100%的异丙醇,2μL糖原(Fermentas、圣Leon-Rot、德国)隔夜−20°C。在4°C离心后30分钟(12000克)丸是洗一次与70%乙醇沉淀RNA resuspended 30μL RNase-free水(Ambion、奥斯汀、TX) (9]。
2.6。microrna与组织
如前所述(16)总RNA从组织使用试剂盒纯化试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。RNA的数量和质量是决定光谱方法使用nanodrop(美国ThermoScientific沃尔瑟姆,MA)。
2.7。定量实时聚合酶链反应
相对表达mir - 223测定了血清和组织定量实时PCR (qPCR)最近所描述的16]。详细,总RNA (1μg组织RNA, 5μL对血清RNA)被用来合成cDNA利用miScript逆转录酶工具包(试剂盒)根据制造商的协议,然后resuspended合适数量的H2o . cDNA样品(2μL)被用于qPCR 25的总量μL使用miScript SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒)和miRNA-specific引物(试剂盒,序列:5′UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA) qPCR机器上(应用生物系统公司7300序列检测系统,应用生物系统公司,促进城市,CA)。实时PCR反应都是在重复执行。数据分析使用SDS 2.3和RQ经理1.2软件包和相对基因表达是使用生成的方法(目标基因控制基因)。
2.8。统计分析
所有与SPSS统计分析20 (IBM SPSS统计)最近所描述的9]。数据显示值和范围考虑大多数参数的偏态分布。高斯分布与Kolmogorov-Smirnov测试测试。两组之间的差异被学生的评估以及或Wilcoxon rank-sum测试和多个超过两组之间的比较与Bonferroni由方差分析测试或邓恩的测试进行事后分析。Box-whisker-plot图形说明统计汇总。这里的盒子代表中位数和四分位范围(差)和“胡须”包括所有的值小于上四分位数+ 1.5差和下四分位数大于- 1.5位差。胡须之外的值显示为单独的点和代表异常值。包含所有的值,包括异常值,进行统计分析。使用斯皮尔曼相关变量之间的相关性进行了分析测试。接受者操作特征(ROC)曲线分析和推导曲线下的面积(AUC)统计数据提供了一个全球的准确性和标准化升值标志或预测事件的综合得分。ROC曲线被绘制敏感性对1−特异性生成。绘制kaplan - meier曲线显示影响生存和使用生存率较差异进行了评估。Cox回归分析是用来确定预测ICU死亡率或整体死亡率的因素。所有报告双尾和一个值值小于0.05被认为是显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。血清mir - 223水平感染性疾病的小鼠模型
矛盾的数据改变的基础上在脓毒症患者血清mir - 223水平,我们决定首先分析血清mir - 223浓度在高度标准化的感染性疾病的小鼠模型。因此,CLP程序和C57Bl / 6小鼠注射LPS。由miRNA-specific qPCR, mir - 223水平中等,但值得注意的是,有限合伙人(图8 h后注入的提升1(一))。相比之下,mir - 223水平仍然影响诱导后不同时间点的使用CLP脓毒症模型,近似人类败血症(数字1 (b)和1 (c))。最后,mir - 223表达分析在不同器官的脓毒症诱导CLP手术后进一步确定潜在机制调节血清mir - 223水平脓毒症。这些分析显示显著upregulation肺,而mir - 223的表达在肾脏表达下调,影响感应的感染性疾病的其他器官,包括肝脏、大脑、心脏和肌肉(图1 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。血清mir - 223水平危重患者和健康对照组
我们接下来分析循环221年血清mir - 223水平的患者在ICU住院和75名健康志愿者。mir - 223浓度略低危重患者与健康对照组(;图2(一个))。当我们分析血清mir - 223水平与疾病严重程度,我们发现显著降低水平较严重疾病患者根据APACHE-II得分较高(> 10),而患者APACHE-II得分较低(< 10)(;图2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
患者的代谢状况被证明影响危重病人的结果(17]。自从mir - 223被证明参与2型糖尿病的病理生理学8),我们分析了潜在血清mir - 223水平之间的相关性和肥胖和2型糖尿病的存在。重要的是,我们没有发现显著差异之间的循环mir - 223肥胖患者和正常体重(图2 (c)2型糖尿病)和那些有或没有,分别(图2 (d))。此外,没有发现差异当患者相比,他们的年龄或性别(数据没有显示)。
3.3。血清mir - 223水平并不意味着危重患者的脓毒症
高浓度的mir - 223提出了区分先生们和脓毒症患者具有高度的敏感性和特异性11]。我们群ICU患者出现脓毒症患者()和败血症病人不满足标准()。因此,我们进一步研究脓毒症对血清mir - 223浓度的影响在我们的队列。在这些分析,mir - 223水平无显著差异之间的感染性和nonseptic患者明显(;图3(一个))。值得注意的是,循环mir - 223是独立于脓毒症的存在进一步证实了相关性分析显示血清mir - 223水平不相关标记建立系统性炎症和细菌感染如c反应蛋白(CRP)、原降钙素(PCT)、白细胞介素- 6 (il - 6)、白细胞介素- 10”(il - 10)、肿瘤坏死因子(TNF)在危重病人(表3)。
(一)
(b)
为了研究脓毒症的潜在病因的影响/关键疾病血清mir - 223水平更准确地说,我们再次进行亚组分析。脓毒症患者的群体细分成肺感染nonpulmonary站点和nonsepsis患者分为肝硬化,心血管疾病等。然而,也没有这一分析显示血清mir - 223浓度差异不同的子组,从而排除,mir - 223水平的潜在变化可能只存在于一个特定组患者和蒙面如果这些患者与其他患者合并(图3 (b)、表2)。
总之,我们的分析显示,与先前的研究[差别报告对这些11]或upregulation [12)患者血清mir - 223的感染性疾病,mir - 223水平稍微改变疾病和脓毒症严重,表明mir - 223测量血清不适合检测败血症。
3.4。mir - 223血清浓度不预测危重患者的生存
多器官功能衰竭代表一个可怕的并发症的脓毒症和脓毒症休克综合征,通常导致危重患者死亡。确定血清mir - 223水平可能表明病人的预后ICU治疗期间及之后,我们首先执行mir - 223水平之间的相关分析和古典器官功能障碍的标志。而血清mir - 223水平显示与肾功能下降显著相关(表3),没有相关性急性肝损伤或损害肝脏合成能力可以建立。此外,我们没有发现相关经典预测成绩或其他参数表明病人的ICU治疗结果等通风时间或时间花在ICU治疗(表3)。
尽管这些负相关分析以及血清mir - 223水平没有显著不同危重患者和健康对照组之间或脓毒性和nonseptic病人,我们接下来分析他们是否可能是有用的在预测危重患者的死亡率。符合患者减少mir - 223浓度高APACHE-II得分(见图2 (b)ICU治疗显示),病人死于低水平的幸存者相比,mir - 223水平支持角色mir - 223在评估病人的结果在ICU治疗(;图4(a))。kaplan meier曲线分析显示,mir - 223水平较低的患者(例如,下四分位数)展示了一个受损的ICU生存患者相比,mir - 223浓度在所有患者的上四分位数;然而这些差异没有达到统计学意义Cox回归分析。
在我们的危重病人,49死在加护病房,而额外的45从ICU患者死亡后释放。在ICU的生存数据相比,病人死于长期随访显示,mir - 223水平没有差异相比,幸存者(;图4(c))。符合,kaplan meier曲线分析显示血清mir - 223测量没有角色在决定患者的长期预后(图4(d)),因此反对一个强大的角色mir - 223的血液标记为基础预测危重病人的预后。
4所示。讨论
尽管巨大的诊断方法的进步,筛选病人在急诊室搬迁到加护病房或指导治疗决策的第一周内ICU治疗是一个重大的挑战在危重病人的治疗。然而,这样的决定是巨大的相关性对危重病人的18]。在这种背景下,标记允许决定病人的治疗和临床过程可能是重要的好处。不同作者证明了常用标记CRP和PCT可能代表诊断和预后的生物标志物在此设置,尤其是当与临床严重程度得分或multimarker结合使用的方法(19,20.]。除了CRP和PCT suPAR等各种不同的蛋白质标记,诱导蛋白10 (IP10),中性粒细胞gelatinase-associated lipocalin (NGAL),利钠肽,成熟adrenomedullin (ADM)、促血小板生成素检测;然而这些实验标记可以转化为临床使用(14,21]。几个作者因此推测,小说,例如,miRNA-based标记可能会表现得更好,因此进入临床常规。
microrna最近与系统性炎症和感染的发病机理(22]。旁边其他人,这是表明,mir - 223是非常参与分化和成熟的关键球员的先天免疫反应。增加对感染的免疫反应等白色念珠菌mir - 223所示突变老鼠()。此外,在endotoxin-challenge模型,老鼠表现出升高组织破坏,从而突出的潜在作用mir - 223在感染性疾病的病理生理学和提供证据的分析在脓毒症患者的血清mir - 223。
mir - 223最近已被建议作为一种新颖的血清生物标志物对脓毒症和脓毒性休克脓毒症患者的疾病在两个不同的亚洲人。值得注意的是,这些研究的结果是相互矛盾的:一方面,它是在一群116例(43温和脓毒症和73年严重脓毒症/脓毒性休克),mir - 223水平升高表明感染性疾病的存在(12),与这些患者的不良预后[13]。另一方面,80年一群患者(30与众位和50败血症)mir - 223水平减少败血症的病人满足标准相比,健康对照组(11]。在目前的研究中,我们分析了血清mir - 223水平在223年一个定义良好的危重病人。然而,尽管大量的样本分析,我们未能证明显著改变血清mir - 223浓度至关重要的疾病和败血症。
冲突的结果之前发表的结果和我们目前的结果可能部分解释了实验过程的差异在不同的研究。当我们停在RNA (SV40)用于血清mir - 223水平正常化,王等人使用一个内部参考基因,即snU6,标准化的研究12,13]。最近我们和其他团体证明snU6可能监管本身在炎性疾病,可能影响这些先前的结果。值得注意的是,我们发现mir - 223的低水平的趋势至关重要的疾病,这是符合王的数据等。11也停在RNA用于规范化。此外,不同的研究之间的差异也可能与病人群的规模和特点分析了不同的研究。我们报告的数据从一个大连续招募群覆盖了广泛的危重病人对疾病的严重程度反映在APACHE-II和沙发上的分数。值得注意的是,除了脓毒症,冲突的结果,mir - 223肝癌患者的血清水平也被描述或慢性乙型肝炎(23- - - - - -25),强调需要进一步努力定义标准样品制备、数据标准化、数据分析在此设置。
我们最近发现mir - 133 a的整合调节患者的血清败血症和感染性疾病的小鼠诱导后9]。在目前的研究中我们证明,mir - 223水平保持不变在CLP后小鼠手术,从而反映病人的情况。从CLP过程与结果,我们发现升高血清mir - 223水平有限合伙人治疗后小鼠,这与先前的报道是一致的。这些第一个观点相互矛盾的结果可能解释为两个模型之间的差异:有限合伙人管理引发全身炎症,模仿一些最初的脓毒症的临床特征(如增加促炎细胞因子)但不功能菌血症,代表了脓毒症在人类疾病中定义事件(26- - - - - -28]。此外,有限合伙人导致更早和更高的峰值水平的细胞因子表达与水平观察人类脓毒症(27,29日,30.]。因此,LPS-induced小鼠脓毒症不能模仿人类的不同免疫阶段败血症:促炎阶段和补充抗炎阶段。相比之下,CLP-induced败血症淋巴细胞凋亡增加,模仿人类脓毒症免疫抑制的稍后阶段(31日- - - - - -33]。在这方面,CLP-induced败血症是完全不同于LPS-induced败血症和更紧密地模仿人类脓毒症(34,35]。
总之,血清mir - 223水平的危重和脓毒症患者不健康对照组相比显著监管,只有适度与疾病严重程度或结果。我们的数据因此强烈反对潜在的使用基于mir - 223作为血液感染性疾病的生物标志物。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
拖延时间的奔驰,弗兰克Tacke亚历山大·科赫和Christoph Roderburg同样对本文亦有贡献。这些作者分享第一或高级作者分别。
确认
作者想表达他们的感谢博士简求,米凯拉Roderburg-Goor,和成员的Luedde-Lab有益的讨论。这项工作是支持由德国研究基金会(SFB-TRR57 / P06) Mildred-Scheel赋予教授和单个项目资助(110043)从德国癌症援助(德意志Krebshilfe),一个伦理委员会开始格兰特(ERC - 2007 stg / 208237 - Luedde med3 -亚琛),EMBO青年科学家的资助计划,跨学科的临床研究中心(IZKF),亚琛,德国汉堡,恩斯特荣格基金会和资助亚琛工业大学的医学院汤姆Luedde Christoph Roderburg,和一个项目从德国研究基金会授予Christoph Roderburg (DFG RO 4317/4-1)。