尿可溶性Fas与血管内皮生长因子在膀胱尿路上皮癌中的相关性及意义

摘要

目的．探讨尿路上皮性膀胱癌(UC)患者尿可溶性Fas (sFas)与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关性及意义。方法．采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血管内皮生长因子(VEGF)水平，免疫组化法筛选UC手术标本中VEGF的表达。采用SPSS 13.0软件对数据进行分析。结果．UC患者尿sFas水平明显高于非UC患者(168.0 ng/mL±84.6 vs 56.2 ng/mL±37.0;< 0.05)，且分期或分级较高的病例比分期或分级较低的病例(各< 0.05)。VEGF蛋白表达与UC组织的病理分期及分级呈正相关(各有差异)< 0.05). Spearman秩次相关检验显示sFas水平和VEGF表达之间存在显著相关性(= 0.882,< 0.05)。结论sFas和VEGF的作用可能在UC的发生和发展中共同发挥重要作用。联合检测尿液sFas和VEGF蛋白可能为改善UC的诊断和治疗提供有价值的解决方案。

1.介绍

尿路上皮性膀胱癌(Urothelial bladder carcinoma, UC)是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤。这种癌症的复发率是所有实体瘤中最高的。不幸的是，使用临床和病理参数，包括肿瘤大小、分级、分期、病变的多样性和既往复发率，可能无法很好地预测疾病的复发和进展[1］．因此，寻找新的生化因子至关重要。显然，确定UC潜在的肿瘤标志物可以提示患者不同的复发和进展风险;它甚至为病人提供有针对性的诊断和治疗。而肿瘤标志物有助于设计个体化治疗策略，将大大提高UC患者的生存时间和生活质量。然而，目前还没有一种泌尿道上皮癌的肿瘤标志物单独应用于临床，并被多中心、大规模的研究证实。

已有研究表明，细胞凋亡在膀胱癌的发生发展中起着非常重要的作用[2为UC的诊断和治疗提供了新的途径。Fas/Fas配体(FasL)系统是细胞凋亡的关键调控因子。Fas是一种跨膜细胞表面受体，与FasL结合后触发细胞死亡，FasL是一种暴露于细胞外间隙的锚定细胞膜蛋白[3.］．Fas有两种形式，跨膜形式和可溶形式。可溶性Fas (Soluble Fas, sFas)可与膜结合的FasL结合，阻断配体与Fas受体的结合，防止靶细胞诱导凋亡，增强肿瘤的免疫抑制作用。有研究表明，在膀胱癌患者的尿液或血清中可以检测到sFas。我们(4，5]和Svatek等人[6]注意到接受尿路上皮癌监测的患者的尿可溶性Fas水平在癌症患者中高于对照组，并且在既往有UC病史的患者中，尿sFas是膀胱癌复发和侵袭性的独立预测因子。

有趣的是，血管内皮生长因子(VEGF)可以抑制细胞凋亡[7]VEGF被认为是肿瘤血管生成过程中最重要的血管生成刺激因子，被认为是主要的生存（抗凋亡）因子[8]血管生成，即从现有血管中生长出新血管，是侵袭性的标志，已知其在恶性肿瘤的生存、增殖和转移潜能中起主导作用[8，9］．它是胎儿发育和创伤愈合过程中正常的生理过程。但是，在癌症中，它是肿瘤生长和转移扩散的关键。VEGF在膀胱肿瘤中表达，VEGF表达的增加与肿瘤分期和进展的增加相关[8- - - - - -10］．但据我们所知，尚未有研究将尿可溶性Fas和VEGF联合检测应用于UC。

本研究探讨UC患者尿可溶性Fas与血管内皮生长因子表达的相关性及意义。

2.方法

2．1．病人

本研究随机招募2008年1月至2013年5月在石家庄市第一医院和承德医学院附属医院就诊的UC患者。根据2002年TMN分级和世界卫生组织(WHO)标准(2004版)进行肿瘤分期和分级。所有患者术前均未接受辅助化疗或放疗。无癌症对照组，没有癌症或其他遗传疾病的家族史，频率与性别和年龄匹配(±3年)，从同一家医院的个人中招募。排除患有肾功能不全、心力衰竭、上尿路肿瘤、术中膀胱穿孔或明显血尿的受试者。我们分析了82例UC患者(男51例，女31例)，平均年龄58.8岁(21-84岁)。82例膀胱移行细胞癌病例,直径大小从0.2到4厘米,56是经病理诊断为nonmuscle浸润性膀胱癌(NMIBC), 26日是肌肉浸润性膀胱癌(MIBC), 42是低品位乳头状移行细胞癌(LGPUC)和46个优质乳头状移行细胞癌(HGPUC)。对照组包括82名无癌个体，包括15名良性前列腺增生患者，17名结石患者，20名非特异性尿路感染患者和30名健康志愿者。

本研究经石家庄市第一医院伦理审查委员会批准，符合1964年赫尔辛基宣言的伦理指南。所有UC患者和无癌对照组均在入组前提供书面知情同意书。

2．2.酶联免疫吸附试验

第一个上午的排尿样本(10-20 mL)用于测量术前患者和对照组的sFas。尿液标本立即在2000g下离心10分钟，然后在−70°C下冷冻直到检测。尿液样品中的sFas水平由市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(R&D Systems Inc.， USA)根据制造商的方案进行定量，以ng/mL表示。每个样本测量3次，并计算平均值进行数据分析。

２．３．免疫组化研究和评分

对福尔马林固定的石蜡包埋组织进行免疫组化(IHC)研究。从存档的石蜡包埋的组织块中获得肿瘤组织的连续切片。所有病例均通过苏木精-伊红(HE)染色证实原发性病理诊断;然后对玻片进行VEGF染色。简而言之，所有载玻片在二甲苯中脱烃，然后在乙醇中再水合。随后，所有切片用3%双氧水处理5分钟，用蒸锅在柠檬酸缓冲液中加热，然后用多克隆一抗(VEGF, Boster生物技术有限公司，中国;1:10 0稀释)，37℃保存2小时。二抗和链霉亲和素-生物素复合物(Boster Biological Technology, Ltd, China)分别于37℃下应用20 min。冲洗后用二氨基联苯胺染色，常规苏木精反染色。

我们采用半定量分析系统，根据小于500个细胞中阳性细胞的百分比和强度确定VEGF免疫染色评分[9］．0~4分分别占标记细胞的<5%、5~25%、26~50%、51~75%和>75%。在强度上，0~3分分别为无、弱、中、强染色。两项评分相乘后得出最终评分(VEGF评分)，评分范围为0~12。由两位独立的病理学家进行双盲分析。每个样本都被评分两次。如果最终分数相差超过3分，将进行第二次评估。使用−~+++，VEGF评分分别为0、4、>、>、8、>、VEGF评分≥4、VEGF评分≥8。

２.４.统计分析

收集每个患者的临床和病理资料。对患者资料进行分析，并采用描述性统计方法总结研究人群特征。采用SPSS 13.0软件(SPSS Inc.， USA)进行统计学分析。尿可溶性Fas水平为中位±四分位间(M±IQR)。连续变量的差异由Mann-Whitney检验测试。为了得到用于诊断UC的最合适的sFas截止值，我们构建了受试者工作特征(ROC)曲线。选取敏感性与假阳性率差异最大的值(约登指数=敏感性+特异性- 1)作为临界值。

变量间的相关性采用Spearman秩相关检验。所有统计分析均为双侧小于0.05的值定义为统计显著性差异。

3.结果

采用ELISA法测定尿sFas浓度;试验内变异系数为6.09%。的Mann-Whitney检测结果表明，UC患者尿液中sFas水平显著高于非癌症患者（168.0%） ng/mL±84.6对56.2 ng/mL±37.0；= 333.5,=0.000）。根据ROC曲线，曲线下面积（AUC）为0.928（95%可信区间0.887–0.969；图1）.经ELISA检测，sFas对UC患者的敏感性和特异性分别为85.3%和88.2% (；)，如果sFas的截止值选择为91.0 根据Youden指数，ng/mL（图1）.

临床病理特征与尿sFas、VEGF表达的关系见表1曼惠特尼在试验中，分期或分级较高的患者的尿sFas水平显著高于分期或分级较低的患者（各期）<0.05），但不因性别或年龄而有所不同（各> 0.05).

VEGF的阳性表达为膜染色或强细胞质反应（图2)82例中VEGF阳性表达61例（74.4%），经Spearman秩次相关检验，VEGF蛋白表达与病理分期或分级呈正相关<0.05），因此随着膀胱癌病理分期或组织学分级的进展，VEGF的阳性率逐渐增加（表1）2）.与VEGF阴性表达组相比，VEGF阳性表达组sFas水平升高(、表1）.然后Spearman秩相关检验显示，尿sFas水平与VEGF表达之间存在显著相关性(= 0.882,= 0.000,表3.）.

4.讨论

近年来，基于Fas/FasL系统的研究已成为分子生物学领域的重要进展之一[11，12]，血清中较高的sFas水平已在各种癌症类型中进行了研究[4，13，14]Mizutani等人[15]据报道，膀胱癌患者血清中sFas水平升高，提示sFas水平升高与这些患者的不良预后相关[16]认为血清sFas作为一种肿瘤标志物似乎无效，在膀胱癌的实验室研究中相关性有限。目前文献中有关膀胱癌患者尿sFas的资料很少[5- - - - - -7，17］．在本研究中，我们发现UC患者的尿sFas水平在癌症患者中高于对照组。与目前的检测方法相比，ELISA法检测尿可溶性Fas具有较高的灵敏度和特异性，且成本较低的优点。然后，根据我们的研究结果，sFas随着膀胱癌侵袭性的增加而持续升高，可以作为膀胱癌恶性程度的指标。我们推测UC中sFas蛋白的高表达可能参与了UC的发病和进展，导致细胞凋亡的开始，导致膀胱癌细胞对术后膀胱灌注不敏感，从而更有可能导致肿瘤复发。然而，确切的机制仍不清楚。

VEGF主要有四种形式，每一种都具有多种功能，包括内皮细胞的募集和有丝分裂刺激[18]VEGF水平已被证明影响尿路上皮癌的复发和生存[9，10］．根据本研究结果，VEGF在侵袭性疾病和非侵袭性疾病中均可检测到表达，VEGF表达的增加与膀胱癌分期或分级的增加相关，这说明VEGF在膀胱癌的进展中起着重要的作用，其表达可能是重要的预后指标。

此外，我们首次发现sFas水平随着VEGF表达的增加而升高，因此sFas抑制细胞凋亡和VEGF激活血管生成的作用与UC的发生发展密切相关。可溶性Fas和VEGF可能在尿路上皮性膀胱癌的发生发展过程中共同发挥重要作用，并通过信号转导网络相互作用进而影响肿瘤的生物学行为，但具体机制尚需进一步研究。本研究也提示，联合检测尿液sFas + VEGF蛋白对评估UC进展和预后具有实用价值，将为提高膀胱癌的诊断和治疗提供有价值的解决方案。

在局限性方面，由于本研究为初步调查，患者数量相对较少。我们认为，除非对具有相同重量和不同级别的病例进行比较，否则在高级别的早产儿中可溶性Fas水平较高。同时，尿液中sFas的来源尚不清楚，尽管这对最终评估没有明显影响。

综上所述，结果显示UC患者的尿sFas水平在癌症患者中高于对照组。同时，VEGF在侵袭性疾病和非侵袭性疾病中均有表达，VEGF表达的增加与膀胱癌分期或分级的增加有关。此外，我们发现sFas水平随着VEGF表达的增加而升高，因此sFas和VEGF的作用可能共同在尿路上皮性膀胱癌的发生发展中发挥重要作用。本研究也提示，联合检测尿液sFas + VEGF蛋白将为提高膀胱癌的诊断和治疗提供有价值的解决方案。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

参考文献

1. L.Cheng、S.Zhang、G.T.MacLennan、S.R.Williamson、A.Lopez Beltran和R.Montiri，“膀胱癌：将分子遗传学观点转化为临床实践，”人类病理学，第42卷，第2期4, pp. 455-481, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. H.F.O'Kane，C.J.Watson，S.R.Johnston等人，“膀胱癌、前列腺癌和肾癌中的靶向死亡受体，”泌尿学杂志，第175卷，第2期，第432-438页，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. E. Ulukaya, C. Acilan, M. Yilmaz等，“肺癌患者顺铂化疗后sFas水平升高，”细胞生物化学与功能，第28卷，第7期，第565-570页，2010年。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. Yang H.， H. Li, Z. Wang, J. Gao, and Y. Guo，“尿液可溶性Fas是非肌肉浸润性膀胱癌的独立预测因子吗?一个前瞻性的图表研究，”Urologia国际明爱会第91卷第1期4, pp. 456-461, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. “尿液中可溶性Fas的检测对膀胱癌的诊断价值，”中国现代医学杂志，第23卷，第2期。7，第38-41页，2013。视图:谷歌学者
6. R. S. Svatek, M. P. Herman, Y. Lotan等，“可溶性fas -一种检测复发性浅表性膀胱癌的有前途的新尿液标记物，”癌症，第106卷，第8期，第1701-1707页，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. “上调自分泌血管内皮生长因子(VEGF)/VEGF受体-2循环抑制血管瘤来源的内皮细胞凋亡，”英国皮肤病杂志第170卷1, pp. 78-86, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. A. Verma, J.降解，A. B. Hittelman, M. A. Wheeler, H. Z. Kaimakliotis, R. M. Weiss，“丝裂霉素C对膀胱癌细胞和膀胱内灌注丝裂霉素C大鼠血管内皮生长因子及其受体浓度的影响”，英国国际泌尿学杂志，第107卷，第2期7, pp. 1154-1161, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. J.-X。“一种新的分子分级模型:Ki67和VEGF联合预测非侵袭性尿路上皮性膀胱癌的肿瘤复发和进展，”陈宁等，“一种新的分子分级模型:Ki67和VEGF联合预测非侵袭性尿路上皮性膀胱癌的肿瘤复发和进展，”亚太癌症预防杂志，第13卷，第2期5, pp. 2229-2234, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. P. K. Kopparapu, S. A. Boorjian, B. D. Robinson等，“VEGF及其受体VEGFR1/VEGFR2的表达与膀胱癌的侵袭性相关，”抗癌的研究第33卷第3期6, pp. 2381-2390, 2013。视图:谷歌学者
11. C.-L。郭,X.-H。Yang, W. Cheng等，“Fas/FasL在CD8⁺T和CD3⁺Foxp3⁺Treg细胞与循环CD8细胞凋亡的关系⁺肝细胞癌患者的T细胞亚太癌症预防杂志，第15卷，第5期。6、2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. 戴晓林，周世林，邱建军，刘玉发，和华，“Fas，NF的相关表达-κB和VEGF-C在乳腺浸润性导管癌中的作用欧洲妇科肿瘤学杂志第33卷第3期6，第633-639页，2012。视图:谷歌学者
13. J. Codony-Servat, X. Garcia-Albeniz, C. Pericay et al.，“可溶性FAS预测西妥昔单抗和伊立替康对晚期结直肠癌的益处”医学肿瘤学，第30卷，第1期，第428条，2013年。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. S.Boroumand Noughabi，H.R.Sima，K.Ghaffarzadehgan等人，“可溶性Fas可作为胃腺癌的诊断工具，”骨髓细胞癌， 2010年第10卷第275条。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. Y. Mizutani, O. Yoshida, B. Bonavida，“膀胱癌患者血清中可溶性Fas的预后意义”，泌尿学杂志号，第160卷。第2页，第571 - 576,1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. F. G. E. Perabo, R. H. Mattes, A. Wirger等，“膀胱癌中可溶性Fas和Fas配体的体外和体内研究，”泌尿肿瘤，第6卷，第2期4，页163-169,2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. A. K. Srivastava, P. K. Singh, D. Singh, D. Dalela, S. K. Rath, M. L. B. Bhatt，“尿液可溶性Fas在膀胱癌筛查中的临床应用，”亚太临床肿瘤学杂志, 2014年。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. 一个。Pinto, a . Redondo, P. Zamora, B. Castelo, E. Espinosa，“血管生成作为尿路上皮癌的治疗靶点”，抗癌药物第21卷第2期10, pp. 890-896, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2015杨惠祥等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。