中国急性髓系白血病患者临床特征、复杂免疫表型、染色体核型与预后的关系

摘要

混合表型急性白血病(MPAL)是一种同时表达淋巴和髓系免疫表型的复杂实体。在本研究中，47例MPAL, 60例淋巴抗原阳性的急性髓系白血病(Ly⁺90例急性髓系白血病伴常见髓系免疫表型(Ly⁻对AML患者进行调查。我们发现在MPAL患者中，骨髓母细胞比例高，肝脾肿大、淋巴结肿大、费城染色体发生率高。MPAL患者的总生存期(OS)和无复发生存期(RFS)明显短于Ly患者⁺AML和供应⁻AML。对于仅具有正常核型的患者，MPAL的OS和RFS明显低于Ly⁺AML和供应⁻AML;而复杂核型患者的OS和RFS差异无统计学意义。3组复杂核型患者的OS率均低于正常核型患者。在Cox多因素分析中，复杂核型是OS和RFS的独立贬损因素。因此，MPAL被确认为低危险疾病，而Ly⁺AML不影响预后。复杂核型是不同免疫表型AML患者的不良预后因素。混合免疫表型和复杂核型共存时增加不良风险。

1.介绍

急性白血病（AL）通常根据母细胞的形态、抗原、细胞遗传学和分子特征分为髓系或淋巴系。然而，近2%至5%的病例[1.,2.]，母细胞谱系尚不清楚，因为淋巴和髓系免疫表型均可检测到。1995年，欧洲白血病免疫学鉴定组织(EGIL)明确确立了AL的双表型标志物诊断标准[3.，然后在1998年对谱系模糊的AL进行了改进。该评分系统基于免疫标记物，包括髓系或T/B淋巴母细胞，专门用于分类双表型AL和多年的临床结果测量。在这些标准中，为临床治疗和研究建立了新的混合表型急性白血病(MPAL)诊断分类。根据这一标准，MPAL(或双表型或真混合型急性白血病)指的是在一个以上谱系中含有两种特异性抗原评分高于2的急性白血病，无论是否存在一种或多种原始细胞群体。此外,在供应⁺AML髓系母细胞共表达淋巴抗原，但淋巴抗原评分小于2分。

迄今为止，尽管据报道缺乏根据世界卫生组织2008年分类的MPAL病例研究，但众所周知，MPAL似乎是一个具有不同生物学特性的复杂实体[4.和低存活率[5.］．此外，后续研究表明，同时表达髓系和淋巴系标记物被认为是AL的负预后因素[6.,7.].迄今为止，关于Ly预后的随机研究⁺AML患者的结论不一致，缺乏对比MPAL与Ly的临床特征和结果的报道⁺AML。因此，该亚型白血病的治疗方法并不一致。本研究的目的是根据WHO 2008分类分析MPAL患者的分子遗传学、细胞遗传学和免疫表型特征，以及临床结果与实验室特征之间的关系。

2.材料和方法

2．1.病人

根据世界卫生组织2008年标准诊断为急性髓系白血病的197例患者[8.]，谁是在2002年1月和2013年10月间的南方医院（广州，中国）住院治疗，进行回顾性纳入本研究。这些中，47是例混合免疫急性白血病（MPAL），60是与淋巴抗原阳性急性髓性白血病（Ly的⁺AML），和90分别与常见的骨髓免疫急性骨髓性白血病（Ly的⁻根据亚型、性别和年龄进行匹配（表1）1.）．骨髓增生异常综合征(MDS)或慢性髓系白血病(CML)后急性髓系白血病(AML)， PML/RARα艾滋病患者被排除在外。通过形态学和细胞化学方法对病例进行分类，包括髓过氧化物酶(POX)、氟化钠敏感的萘乙酸酯酶(NAE/NAF)和糖原(PAS)。研究方案经过了医院伦理委员会的全面审查和批准程序。所有纳入研究的患者均获得知情同意。

2．2．Immunophenotyping

根据标准程序收集后，通过流式细胞术对分离的骨髓单个核细胞进行FCM免疫分型。所有病例均通过一组白细胞相关标记物进行分析，包括髓系的cMPO、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15、CD64和CD11b/c；T细胞系的cyCD3、CD2、CD5、CD7和CD8B细胞系的年龄、cyCD79a、CD22、CD19、CD10、CD22和CD20；干/祖细胞克隆的CD34和HLA-DR。当超过20%的母细胞显示阳性信号时，标记物被视为阳性。

2．3.细胞遗传学

常规细胞遗传学分析采用直接制备或24 h无刺激培养骨髓细胞，按标准g显带技术进行。同时，根据国际细胞遗传学命名系统(ISCN)的标准对异常克隆进行了定义。FISH研究旨在检测AML1/ETO、PML/RARa、CBFβ/根据制造商的说明进行MYHll、BCR/ABL和MLL重排以及P53、Del（5q）、Del（7q）、Del（20q）和+8。

２.４.治疗方案

为分析临床结果，参与本研究的患者至少接受了2次化疗。所有患者均根据中国医学会血液学会制定的指南接受诱导和维持治疗。诱导治疗如下：① 联合AML/ALL方案（DOALP和DOAP），② 所有类型的诱导治疗（VDLP和VDCP），以及③ AML型诱导治疗（DA/DAE/HA/TA）。同时，他们接受以下缓解后治疗：④ 3次巩固治疗，少于3次MD-Ara-C/HD-MTX，⑤ 等于或超过3圈MD-Ara-C/HD-MTX或超过3圈Hyper-CVAD-A/B或自体移植，标准剂量诱导治疗中位数为5圈，范围为3到10圈，以及⑥ 异基因造血干细胞移植经过3-6个周期的巩固或强化治疗。诱导方案和巩固治疗的病例分布总结在表中2.．

2.5.统计分析

两个独立样本的非参数检验用于定量数据的比较。Kaplan-Meier方法用于估计患者的长期生存率。Cox单变量和多变量分析用于确定与OS和RFS相关的风险因素。Pearson试验用于定性数据的分析。所有的分析都是用SPSS 17.0版本完成的值小于0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．病人

患者特征见表1.．我们确定了47例使用WHO 2008分类诊断的新MPAL患者。相比之下,供应⁺AML或Ly的⁻AML患者、MPAL患者的淋巴结肿大和肝脾肿大比例较高（63.8%），骨髓母细胞比例较高（67.6%），但两组间无统计学差异⁺AML和供应⁻AML。

３.２．Immunophenotype

免疫表型数据显示，MPAL和Ly中CD34阳性发生率为76.6%⁺AML亚型(81.7%)明显高于Ly亚型⁻AML组(47.8%)。相反，分化细胞的标记物CD117在MPAL中明显低于Ly (8.5%)⁺反洗钱（61.7%）和反洗钱⁻AML（51.1％）。

３．３．细胞遗传学

37例有核型资料的MPAL患者中有15例(40.5%)为复杂核型。多见于MPAL的复杂核型在Ly中发生率较低⁺AML(11/51, 21.6%)和Ly⁻AML（18/90，20%）。然而，在三组中，MPAL患者的正常核型发生率最低（27.0%）()，两组患者之间无统计学差异⁺AML和供应⁻AML。MPAL组患者中费城染色体和融合BCR-ABL基因的发生率最高(表)1.）．对34例MPAL患者进行了荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)检查，详情见表1.在34例分析的病例中，MLL基因重排和融合的AML1/ETO基因在1例（2.9%）中呈阳性，而BCR/ABL重排在7例（20.6%）中呈阳性。

3.4.不同免疫表型对生存结果的比较

为分析临床结果，本研究纳入了至少接受2次化疗的患者。总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）分别为35 MPAL、55 Ly⁺AML和Ly的79⁻表中显示了符合WHO 2008标准的AML患者2.和图1.．根据WHO 2008年的分类，三组患者的OS和RFS差异显著(和)通过应用配对比较的结果，我们发现MPAL患者的OS明显短于Ly患者⁺AML (）和Ly的⁻急性髓系白血病患者(）．同时，MPAL的RFS也明显短于Ly⁺AML (）和Ly的⁻AML集团(）．然而，Ly之间的OS和RFS没有显著差异⁺AML和供应⁻AML组(表2.和图1.）．

3.5.治疗反应和结果

在供应⁺AML和供应⁻核型正常的AML组，第二次诱导后完全缓解（CR）率分别为88.5%（23/26）和80.4%（37/46），高于复杂核型组(和）．然而，在MPAL组中，正常核型和复杂核型患者的CR率无差异(77.8% vs . 46.2%)。）．同时，不同免疫表型(MPAL、Ly) AML患者化疗两周期后的总最终完全缓解率⁺AML,供应⁻AML）在相同遗传背景下无统计学差异。详情见表3.．

当仅考虑核型正常的患者时，MPAL患者的中位生存时间（6.4个月）似乎低于Ly患者⁺反洗钱（29个月）和反洗钱⁻急性髓细胞白血病(46个月)患者。MPAL、Ly的总生存率和无复发生存率有显著差异⁺AML,供应⁻核型正常的AML患者(和）．应用配对比较的结果，MPAL患者的OS率明显低于Ly⁺AML (）和Ly的⁻AML ()，但Ly之间无统计学差异⁺AML和供应⁻AML患者。正常核型MPAL的RFS明显低于Ly⁺AML (）和Ly的⁻AML ()，但后两组之间无统计学差异，如图所示2.．对于核型复杂的患者(除Ph⁺染色体或BCR/ABL融合基因)，三组间OS和RFS差异无统计学意义。三组复杂核型患者中位生存时间MPAL组为7.5个月，Ly组为9.4个月⁺反洗钱和15个月的反洗钱⁻AML,分别为(数字3.,4.,5.）．

MPAL、Ly的OS和RFS率⁺AML,供应⁻AML患者正常或复杂的核型进行了示出，分别在图3.,4.,5.．除了Ly⁺AML集团，MPAL和Ly的RFS比率⁻复杂核型AML患者低于正常核型AML患者(和）．正常与复杂核型MPAL患者OS差异有统计学意义(）．同时，正常核型的MPAL患者的中位生存时间明显长于复杂核型的患者(中位18个月vs . 6个月)。此外，Ly也存在统计学差异⁺AML和供应⁻AML患者的核型介于正常和复杂之间(和）．在这两组中(Ly⁺AML和供应⁻AML)，核型正常的患者中位生存时间为37.4和46个月，而核型复杂的患者中位生存时间为7.3和15个月(图)3.,4.,5.）．

为了明确影响生存的参数是否增加了其他已知预后因素的信息，预后因素对预后的相对值的分析是基于Cox的DFS和OS的比例风险回归模型。在单因素分析中，我们纳入了6个变量(年龄、性别、外周血白细胞、骨髓母细胞、染色体核型和免疫表型)，试图确定与OS相关的危险因素。年龄、外周血白细胞、MPAL、复杂核型和异常核型显示OS的不良预后意义(表)4.）．然而，在OS的多变量分析中，只有外周血白细胞(WBC)和复杂核型维持其有害的独立因素(表)4.）．同时，对全部患者进行分析时，MPAL ()复杂核型()在单变量分析和复杂核型中()也是影响RFS的不良预后因素(表)4.和5.）．因此，复杂核型是OS和RFS的独立不利因素。

4.讨论

AML是一种遗传异质性疾病，其治疗结果和生存率差异很大。因此，有效地提出AML亚型的预后模型对于AML亚型的诊断和预后评估非常重要。目前，AML最重要的预后因素是年龄和染色体核型[9,10］．然而，尽管患者年龄相同，染色体核型相同，但预后因其他因素而异，如混合表型急性白血病(MPAL)。对于双表型急性白血病的分类，已经发布了包括EGIL1998标准在内的几种分类系统。虽然近十年来，EGIL1998评分系统在临床实践中得到了广泛应用，但严格按照免疫表型诊断AL亚型，不包括形态学、细胞化学和细胞遗传学，存在一定的局限性。同样重要的是，另一个限制是当免疫表型只通过流式细胞术进行时;很难排除假阴性和假阳性造成的整体偏差。2008年，世界卫生组织提出了新的MPAL分类系统。在新的评分系统中，使用了流式细胞术、免疫组化染色、细胞化学染色、免疫电镜等参数来诊断AL亚型[11,12］．

根据世界卫生组织2008年白血病分类[8.]， MPAL是一个独立的和不寻常的实体。迄今为止，只有两个最大的符合世卫组织2008年标准的MPAL系列已发表，其中包括Yan等人2012年发表的中国经验，共117例患者[4.和Matutes等人于2011年发表的欧洲系列[12]在此，我们根据这些标准对47例MPAL患者进行了回顾性图表回顾。与以前的报告类似[7.,12]MPAL组骨髓母细胞比例及淋巴结、肝脏和脾脏的侵袭率均显著高于Ly组⁺AML和供应⁻AML组。而且，在目前的研究中，诊断时的中位年龄为34岁，且男性占略微优势(63.8%)，与Yan等人的报告相似[4.］．我们的结果也显示MPAL中Philadelphia染色体阳性(21.6%)或BCR-ABL易位(20.6%)的发生率较高，这与Atfy等的报道一致[13]如Matutes等人所报告[12和Bachir等[14]，我们还观察到MPAL中细胞遗传学异常的高发生率，只有少数病例显示正常核型。

先前的研究表明，无论是成人还是儿童，双表型急性白血病患者的生存期都比其他急性白血病患者短[6.,7.,15–17］．根据我们的数据，MPAL、Ly之间OS和RFS存在明显差异⁻AML,供应⁺然而，Ly之间的OS和RFS没有显著差异⁻AML和供应⁺AML患者。这些结果表明MPAL可能是AML的一个不良预后指标。但是，由于MPAL患者中复杂核型的发生率较高，因此需要谨慎行事。因此，仅考虑所有核型正常的患者，并发现MPAL患者的生存率也较低比这更令人兴奋⁺AML和供应⁻同时，使用Cox比例风险回归模型评估与生存相关的因素。因此，在多变量分析中，只有具有复杂核型的患者预测OS和RFS较短。

值得注意的是，在MPAL组中，复杂核型患者的生存期较正常核型患者短。在Ly的OS上也发现了类似的现象⁺AML和供应⁻AML组。这些发现表明，复杂的核型与AML的不良结局密切相关，这与一些早期研究一致[18,19］．这也表明，当混合免疫表型和复杂核型结合时，患者的OS和RFS最短。有趣的是，对于仅具有复杂核型的患者，三组间的OS和RFS均无统计学差异。为什么Ly⁺AML和供应⁻复杂核型AML患者的生存时间与MPAL相似?一种可能的解释是，无论AML患者的免疫表型是哪种亚型，复杂的核型对临床结局的影响都更为显著。一些研究也表明，复杂的核型是预后不良的因素[18,19]，且复杂核型P53突变频率高，这可能与AML预后不良有关[19］．然而，由于病例稀少，复杂的核型信息在MPAL是有限的。需要更大规模的前瞻性研究来证实本研究的发现。虽然有很多关于根据免疫表型或细胞遗传学异常对患者进行分层的结果研究，但这些研究都没有根据不同的遗传特征对预后进行免疫表型分析。

在OS的多变量分析中，除了复杂的核型外，外周血白细胞(WBC)也被发现是危险因素，这在Mikulic等人的报告中也得到了证实[20.］．然而，所有其他研究的临床和生物参数没有显示Ly的之间的任何显著差异⁺AML和供应⁻AML，与Casasnovas等人的研究结果一致[21］．据我们所知，虽然有很多比较MPAL患者与AML患者的研究，但这是首次对MPAL与Ly的临床特征及预后进行分析⁺AML患者。

综上所述，MPAL是一种低危急性白血病亚型，染色体核型正常，而Ly⁺急性髓系白血病并不影响预后。复杂的核型是不同免疫表型AML患者的不利预后因素。此外，混合免疫表型和复杂核型在共存时增加了不良风险。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

丁炳杰和周兰兰对这项工作的贡献不相上下。

参考

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