Vimentin 3，鉴别RCC与嗜酸细胞瘤的新希望

摘要

波形蛋白目前用于鉴别恶性肾癌和良性嗜酸细胞瘤。最近的报告显示波形蛋白阳性嗜酸细胞瘤严重质疑目前诊断方法的有效性。波形蛋白3是一种剪接变体，在外显子7后以一个独特的C-末端结束，这使它不同于具有9个外显子的全长型。因此，蛋白质大小不同；全长波形蛋白版本的蛋白质大小约为57 kDa和~47的截断版本 kDa。我们设计了一种称为Vim3的抗体，对抗波形蛋白3变体独特的C末端。通过免疫组织学、免疫荧光、Western blot和qRT PCR分析，仅在嗜酸细胞瘤中检测到Vim3过度表达，使Vim3检测成为良性肾肿瘤的潜在特异性标记物。该抗体是第一个明确区分良性嗜酸细胞瘤和RCC的模拟嗜酸性变体的抗体。这种区分恶性和良性RCC对于手术计划、后续治疗和患者生存至关重要。在未来，波形蛋白抗体在常规病理学中的应用必须谨慎。必须考虑波形蛋白特异性结合表位，否则可能导致患者肿瘤样本的误诊。

1.介绍

癌细胞是一种上皮细胞，其特征是线粒体过多。Hamperl在1931年以希腊单词“onkousthai”(膨胀)命名它们，并首次将其描述为一种独特的细胞系统，由具有不规则核的大上皮细胞和精细颗粒状、嗜酸性的细胞质组成[1］.癌细胞的基本形态特征，丰富的线粒体，已通过电子显微镜牢固地确立[2］.从那时起，在各种器官(如甲状腺、甲状旁腺和唾液腺)以及不同的肿瘤(如嗜酸细胞瘤、甲状腺Hürthle细胞瘤、甲状旁腺嗜氧腺瘤和唾液腺Warthin肿瘤)中都检测到了癌细胞(Biol Chem百科全书2004)。

肾嗜酸细胞瘤，最初由Zippel于1942年发现[3.，自从Klein和Valensi的第一项研究以来，一直被认为主要是良性的肾脏肿瘤[4]，但偶尔亦有恶性病例报告[5]主要的诊断问题是与其他肾肿瘤的鉴别：（i）嗜酸性或颗粒性透明细胞肾癌（RCC）和（ii）嫌色性肾细胞癌。鉴别诊断目前使用免疫组织学来区分恶性肾细胞癌和嗜酸细胞瘤。对于嫌色性肾细胞癌，claudin 8的阳性和claudin 7的阴性已显示为特征性星座[6］.为了区分嗜色和嗜酸性RCC与嗜酸细胞瘤，结构蛋白Vimentin的阳性被用来鉴别前者[7］.然而，最近报道了一系列嗜酸细胞瘤，在其中观察到波形蛋白阳性，使其分化受到质疑，特别是在术前评估中[8］.Hes等分析了234例嗜酸细胞瘤，其中73%为波形蛋白染色阳性[8］.波形蛋白是一种中等大小的丝，在细胞信号转导、细胞和组织结构完整、粘附和迁移等方面起作用[9］.2007年，克雷格文特尔研究所(NHLBI重测序和基因分型服务(RSG)， N01-NV-48196, J.克雷格文特尔研究所，Rockville, MD 20850)的一个工作组检测到一个具有独特c端末端的Vimentin剪接变体，并在PubMed上在线发表(登录号ACA06103.1)。2011年，Thakkar等人[10]描述了这种变异在胶质瘤中的存在。然而，没有对其作用进行进一步的分析或调查。

基于Vimentin剪切变体比全长变体小35个氨基酸的知识，我们将这两个序列与Vimentin 3B4抗体的详细信息进行了比较。从文献中可知，3B4 Vimentin抗体可以检测杆状结构域[11它是截断的Vimentin变异体3 (Vim3)杆域的同源物。因此，免疫组织学所描述的Vimentin蛋白表达可能不仅是通过全长蛋白的联合检测，而且是通过对Vimentin剪接变体Vim3的联合检测。

大多数商业上可用的抗体(克隆3B4和SP20)是针对位于Vimentin杆状结构域的表位(图)1）.克隆V9直接针对Vimentin的尾部区域。然而，为了检测截断的Vimentin variant 3 (Vim3)，我们使用了Vim3抗体，它是针对独特的c端末端设计的。

如果肾脏肿瘤表现为嗜酸性，类似嗜酸细胞瘤，rcc和嗜酸细胞瘤的鉴别诊断是基于一组不同的抗体。特别是石蜡切片肿瘤标本中是否有波形蛋白染色对区分恶性肿瘤和良性肿瘤非常重要。

这种诊断方法必须重新评估，因为剪接波形蛋白亚型存在。这也可以通过目前使用的针对n端序列的抗体检测到;因此波形蛋白阳性不再是恶性rcc的诊断特征。因此，在本文中，我们分析了RCCs中Vim3与全长Vimentin的存在，特别是RCCs与嗜酸性细胞瘤的嗜酸性变异。

我们设计的引物可以检测波形蛋白的全长版本或其剪接变体Vim3。在对不同RCC和嗜酸细胞瘤的石蜡包埋组织进行qRT PCR后，我们确实可以证明Vim3是嗜酸细胞瘤的主要变体。此外，我们还设计了一种抗体，专门检测Vim3独特的C-末端。

这是第一个描述Vim3与全长Vimentin存在和结构差异的报告。我们的数据提供了强有力的证据，证明Vim3是文献中描述的所谓Vimentin阳性嗜酸细胞瘤的亚型。此外，我们还发现V9 Vimentin抗体以及检测Vimentin全长版本的抗体不能不再用于rcc和嗜酸细胞瘤的鉴别诊断，因为这会导致误诊，对患者造成潜在的严重后果。

2.材料和方法

2．1.抗体设计与定量

Vim3抗体是商业设计的(EZbiolab, Inc.)，使用Vim3独特的c端末端作为靶标(详细信息请参阅科隆大学的专利，Brandenstein/Fries，专利号EP 13160876.2-1405)。Vim3与全长Vimentin(克隆V9) (Santa Cruz, Heidelberg)的表达是通过我们的病理档案中石蜡包被结肠黏膜活检的免疫组织学显示的。为了进一步评价和证明新设计的抗体的特异性，我们对隐窝上皮细胞和淋巴细胞的宏观解剖材料进行了Western blot分析(见下文)。

2．2．石蜡包埋组织的免疫荧光

4μM厚石蜡包埋组织切片在二甲苯中孵育1 × 10 min, 100%乙醇1 × 5 min, 70%乙醇1 min，脱蜡后用蒸馏水冲洗。用蛋白酶K在室温下消化30 min。在5%的PBS乳中孵育30分钟后，用特异性一抗(Vim3)在3%的PBS乳中室温孵育1小时。PBS冲洗后，切片用二抗fitc兔抗体(Santa Cruz)孵育。PBS冲洗后，用DAPI安装介质(核染色)对载玻片进行复染，并覆盖滑动。

2．3.石蜡包埋组织的免疫组织学研究

石蜡包埋组织切片(4μM厚)，在二甲苯中孵育2-5分钟，100%乙醇2-3分钟，95%乙醇1分钟，然后用蒸馏水冲洗。玻片与特异性血清阻断剂(抗兔剂)孵育30分钟，以避免非特异性结合。孵育期结束后，用特异性一抗(Vim3, EZBiolab, Inc.)在室温下再培养1小时。Carmel，美国，Vimentin V9, Santa Cruz，海德堡，德国，AMACR和CD117 [12，德国汉堡达科市)。PBS-Tween 20冲洗后，切片用抗兔抗体(Santa Cruz, Heidelberg, Germany)孵育。PBS-Tween 20冲洗后，95%乙醇孵育2分钟，100%甲醇孵育2 ~ 3分钟，H&E复染，盖玻片。

分析的石蜡包埋组织切片来自回顾性肾切除术;尽管如此，我们进行的是盲法研究，所以结果的任何偏差都可以被排除。

２.４.Oncocytic肿瘤

由于使用了人体材料，按照1975年《赫尔辛基宣言》中制定的道德标准遵循了程序，并得到了德国科隆大学医院道德委员会的事先批准（参考号09-232）。

2．5．实时定量PCR (qRT-PCR)

qRT-PCR方法如前所述[13，14］.

定量分析,肌动蛋白测定。所有样本归一化为-肌动蛋白作为内参基因。所有实验都有三个重复。如用户公告2 (PE Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)所述，使用ΔΔ-CT方法计算相对荧光。不同时间点qPCR值的统计学意义通过Student配对进行评估以及。表格2提供引物信息。

2.6。rna提取石蜡包埋组织和RT-PCR

采用福尔马林固定和石蜡化(FFPE)人体组织样本，来自德国科隆大学医院病理科的档案，以及德国伍珀塔尔大学医院Helios诊所伍珀塔尔的病理科。

采用RNeasy FFPE试剂盒(Qiagen, Germany)从FFPE组织中提取RNA。利用NanoDrop技术完成RNA定量。

根据制造商的协议(Invitrogen公司，达姆施塔特，德国)，使用随机引物和SuperScript III逆转录酶从250 ng RNA中获得cDNA。

2.7。统计分析

统计分析使用GraphPad Prism 5程序。进行方差分析(ANOVA)，计算显著差异，并用星号表示(，,）.无指征的差异均无统计学意义。

2.8。免疫印迹

如前所述，所有Western blot均为三次重复(gersting等[13])。-actin作为加载控制(Santa Cruz, Heidelberg, Germany)。Vimentin 3抗体按1:50 0稀释，V9抗体(Santa Cruz)按供应商推荐的1:10 0稀释。如Ikeda等人所述，从石蜡组织中提取蛋白质[15］.4μ石蜡组织标本在二甲苯中孵育15秒，混匀后全速室温离心2分钟。在球团中加入100%乙醇2 min，混合后再次全速室温离心2 min。仔细地丢弃上清液后，将球团风干。50μ加入L的RIPA buffer，在100°C孵育20 min，然后在60°C孵育2小时。随后在4°C全速离心20分钟。上清液保存在−80°C，直到进一步使用。如前所述进行蛋白质定量[13］.

3.结果

３．１．抗体的评估

由于波形蛋白主要是一种间充质标记物，因此我们使用含有上皮、间充质和淋巴组织成分的阑尾组织冰冻切片来表征Vim3抗体2结果显示，Vim3在结肠隐窝上皮中表达，特别是在隐窝再生活性部分、间充质细胞和淋巴细胞中表达。Western blot验证了Vim3剪接形式的预期大小为47 kDa(图2)，而全长分子可预测为57 kDa(数据未显示)。

我们还建立了肾组织中Vim3抗体结合模式。波形蛋白全长分子在不同类型的间充质细胞（如成纤维细胞和平滑肌细胞）以及近端小管细胞中都很明显。

３.２．Vimentin和Vim3的mRNA检测

Vimentin全长分子被用作鉴别良性嗜酸细胞瘤(阴性)和恶性肾细胞癌Vimentin阳性的标记物。我们对肾脏肿瘤的qRT-PCR评估证实了这一发现，同时证明Vim3的全长表达在(表)1) Onco(嗜酸性)。RCC亚型的Vim3 mRNA表达水平较低。

３．３．RCCs中Vim3与全长Vimentin的蛋白检测

通过对肾肿瘤石蜡切片的免疫组织学分析，发现全长波形蛋白在透明细胞rcc和乳头状rcc中强烈表达。嫌色rcc与抗体反应弱，嗜酸细胞瘤则无反应。相比之下，Vim3在嗜酸细胞瘤中表达强烈，而三种恶性RCCs亚型均为阴性(图)4）.

因此，使用免疫荧光分析不同的RCC亚型和嗜酸细胞瘤，Vim3的明确表达只能在嗜酸细胞瘤中检测到。模拟RCC的嗜酸细胞瘤变异，即嗜酸性变异，Vim3阴性(图5）.

3．4．碰撞肿瘤

为了进一步证明新的Vim3抗体的适用性，我们使用了由两种不同肿瘤亚型组成的碰撞瘤。数字6H&E染色显示其乳头状RCC分化。由于病人患有胸膜转移，因此确定其来源是很重要的。因此，我们对Vimentin FL阳性(V9)和Vim3进行了免疫荧光染色。提示V9阳性、Vim3阴性的第一种肿瘤类型为恶性成分。在组织样本中发现的第二种肿瘤的组织发生是可疑的，可能是“真正的”嗜酸细胞瘤。Vimentin FL (V9)和Vim3免疫荧光后，只有Vim3染色显示阳性区域，说明第2种肿瘤确实是嗜酸细胞瘤。

4.讨论

在这篇文章中，我们描述了一个Vimentin剪接亚型，称为Vimentin 3 (Vim3)，作为一个潜在的重要的细胞结构蛋白。其独特的结构导致10 kDa小的蛋白质(图)1)，它比其全长对应物更广泛地表达，特别是在上皮细胞和淋巴细胞中(图2）.

为了进一步研究Vim3对肾小管细胞的重要性，我们通过qRT-PCR分析了Vim3与Vimentin全长在肾肿瘤中的表达(图)3.)令人惊讶的是，尽管RCC有大量转录的全长波形蛋白，但它们几乎是Vim3阴性。相反，嗜酸细胞瘤的情况正好相反：尽管全长波形蛋白的阴性并不令人惊讶（这也是鉴定它们的标准），但Vim3的水平出乎意料地高。乳头状RCC亚型（Pap）的波形蛋白全长和Vim3 mRNA水平较低，可通过qRT PCR检测到。

然而，由于一些转录后修饰，Vim3信号无法被免疫组织学检测到(图)4)，而强烈的波形蛋白（全长）染色很容易检测到。在嗜酸细胞瘤的情况下，可检测到关于Vim3的唯一阳性信号，而Vim3的“正常”组织切片为阴性（图1）4）.

这一结果以及免疫荧光结果(图5)确定Vim3是肾嗜酸细胞瘤的潜在免疫组织学标记物。

目前，在常规病理学中，通过细胞角蛋白和波形蛋白的免疫组织学来区分肾细胞癌和组织遗传学上不同来源的癌仍然是常见的做法。特别是，波形蛋白阳性不仅被视为肾细胞癌的主要标志，而且被视为区别于良性肿瘤的主要标志。自从Hes等人[8]据报道，在所有检测的嗜酸细胞瘤中，73%的肿瘤呈波形蛋白阳性，这种诊断方法存在疑问，但其潜在机制尚不清楚。

从我们的结果来看，我们声称，通过使用针对Vim3独特的c端序列的抗体，可以明确地识别“真正的”嗜酸细胞瘤。

“波形蛋白阳性嗜酸细胞瘤”的确切性质和机制需要进一步澄清。我们的结果表明，这些肿瘤必须被分类为透明细胞rcc的嗜酸性变种。由于其在H&E切片上的形态学表现与“真正的”嗜酸细胞瘤相同，我们对Vim3进行免疫荧光检查(图)5）.这导致这些被认为是“真正的”嗜酸细胞瘤的肿瘤Vim3明显阴性。

然而，这项研究对于“波形蛋白阳性嗜酸细胞瘤”之谜的常规病理诊断的重要性支持我们目前的解释。

迄今为止，Vim3在细胞内的作用尚未确定，而全长Vimentin分子在细胞内的作用已在文献中描述为细胞核的锚定分子[16］.通过了解其全长对等体的相互作用，我们可以推测Vim3在细胞内的重要性。由于n端结构域和杆状结构域没有改变，结合伙伴如锚蛋白[17]和与胶凝集素的相互作用[18]应该仍然是可能的。而缺失的尾巴及其c端独特的氨基酸则可能导致c端相互作用的差异。目前，尾部结构域已被报道为F-actin的结合和交互位点[19]和lamin B [17］.然而，由于Vim3中c端缺失的主要部分，而且两个分子的确切相互作用位点目前还不清楚，因此，为了充分阐明Vim3与其他结构结合伙伴之间潜在的相互作用或其缺失，还需要进行进一步的研究。该蛋白可区分良性嗜酸细胞瘤和恶性RCC变异，特别是嗜酸性RCC变异，它通过免疫组织学和免疫荧光模拟嗜酸细胞瘤。

为了加强我们的解释，我们将Vim3抗体应用于碰撞瘤(图)6)，其中Vim3阴性的转移组分属于乳头状分化，另一部分Vim3阳性的转移组分属于嗜酸细胞瘤。CD117表达是区分嗜酸细胞瘤和嫌色细胞癌的标志[20.］.在检查碰撞瘤时，CD117阳性可能是一个问题，因为嫌色的RCC是恶性肿瘤，嗜酸细胞瘤是良性肿瘤，所以碰撞瘤的转移成分的分化仍然有问题(图)6）.进一步使用α -甲基辅酶a消旋酶(AMACR)抗体也可用于区分嫌色RCC和嗜酸细胞瘤[21］.AMACR阳性见于乳头状肾细胞癌[22]，可作为原发性和转移性肾细胞癌的标记物[21］.

数字6显示两种肿瘤类型，并且由于使用我们的Vim3抗体，RCC亚型，即肿瘤的乳头状部分和良性部分有了明确的区分。

总之，我们在这里提出了一个独特的Vimentin亚型，Vim3，作为恶性rcc和嗜酸细胞瘤的鉴别标记。我们坚信，这种良性和恶性肾肿瘤类型的明确区分，在未来对患者的治疗、手术计划、随访治疗和患者的生存都是至关重要的。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

Melanie von Brandenstein得到了科隆大学科隆财富计划/医学院的支持，科隆大学和DFG资助了博士后奖学金和卓越集群倡议。作者感谢Susanne Sattler在免疫组织学上的支持，海克-格贝尔博士为她提供了帮助。抗体定量和论文的批判性阅读，以及克劳迪娅·里克特出色的技术帮助。

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