文摘

最近的证据表明,细胞衍生循环microrna可以作为心血管疾病的生物标记物。然而,没有研究调查循环microrna的潜力作为冠状动脉分叉病变的生物标志物。在这项研究中,我们旨在描述microrna的表达谱,可以区分冠状动脉分叉病变和识别潜在的microrna冠状动脉分叉病变的生物标志物。我们使用microrna基因芯片筛选血清microrna的冠状动脉分叉病变患者和冠状nonbifurcation病变。我们确认197 microrna基因差异表达,其中包括150 microrna调节和47个microrna表达下调。我们选择3 microrna在200名患者显著差异进行进一步测试。rt - pcr分析血清样本证实miR30d调节,miR1246冠状动脉分叉病变患者的血清中表达下调与nonbifurcation病变患者。我们的研究表明,这些microrna可能作用在冠状动脉分叉病变的发病机制和可能代表的新生物标志物冠状动脉分叉病变的诊断和预后。

1。介绍

冠状动脉疾病(CAD)是全世界死亡的主要原因之一。CAD的发病机制仍不完全理解和遗传和环境因素都参与了这一复杂的疾病(1,2]。冠状动脉分叉病变中最具挑战性的病变经皮冠状动脉介入医学,因为再狭窄率和主要不良心脏事件明显高于nonbifurcation病变(3]。小分子核糖核酸(microrna)基因表达的关键调节因素,广泛与多种疾病相关(4,5]。最近的证据表明,细胞衍生循环microrna可以作为心血管疾病的生物标记物,包括CAD (6]。然而,没有研究调查循环microrna的潜力作为冠状动脉分叉病变的生物标志物。

在这项研究中,我们旨在描述microrna的表达谱,可以区分冠状动脉分叉病变和识别潜在的microrna冠状动脉分叉病变的生物标志物。

2。方法

2.1。病人

在匹配的病例对照研究中,我们招募5冠状动脉分叉病变患者(平均年龄在45 - 87年5年)和控制患者冠状动脉病变nonbifurcation 46 - 75岁(平均水平年)。对于大样本验证,我们招募了100名冠状动脉分叉病变患者(平均年龄在45 - 88年年)和100年控制患者冠状动脉病变nonbifurcation 40 - 84岁(平均水平年)。所有受试者的血清样本收集。

冠状动脉分叉病变被定义为一个结主要船和侧枝(最小直径为1.5毫米)(7]。冠状动脉分叉病变患者和对照组没有其他伴随疾病,包括严重的心肌病或心脏瓣膜病、肺病、重要的心脏功能障碍或肝脏和肾脏功能障碍,血栓性疾病或血液疾病、结缔组织疾病或恶性肿瘤或主动感染肝炎和结核病等。

2.2。血清样本

血液收集每个主题为EDTA抗凝管和离心10分钟,每分钟3000转,上层清液储存在−80°C。

2.3。RNA提取

总RNA分离使用试剂盒(表达载体)和miRNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。RNA被水溶解在nuclease-free通过几次通过吸管小费。RNA质量和数量是衡量使用nanodrop分光光度计(nd - 1000, nanodrop技术)和RNA完整性决定了凝胶电泳。

2.4。RNA标签

RNA是标签使用miRCURY Hy3 / Hy5电源标签工具包(Exiqon、Vedbaek、丹麦)根据制造商的指导方针。一微克每个样本3′-end-labeled Hy3TM荧光标签,使用T4 RNA连接酶。混合物是孵化为30分钟37°C,和5分钟的反应被孵化终止在95°C。然后,3.0μ1.5 L的标签缓冲区,μ2.0 L的荧光标签(Hy3TM)μL DMSO, 2.0μL标记酶添加到混合物。标签混合物在16°C,孵化1 h和反应被终止孵化15分钟在65°C。

2.5。microrna的微阵列

Hy3TM-labeled样本上的杂化miRCURYTM放大器阵列(v.18.0) (Exiqon)根据制造商的手册。杂交后,幻灯片了,洗了几次使用清洗缓冲工具包(Exiqon),最后在400转离心的干5分钟。然后,幻灯片使用安捷伦芯片扫描仪进行扫描(零件号G2505C)。

2.6。定量rt - pcr

定量PCR进行ABI 7500系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)。RNA与TaqMan反向转录microrna逆转录工具包(ABI)根据制造商的指示。随后,2.5 ul产品是用于检测microrna的表达的定量聚合酶链反应和TaqMan microrna的分析工具(ABI)。

2.7。数据分析

绿色信号的强度计算后背景减法和四个复制相同的每个探测点滑动平均。我们使用中值归一化法获得“规范化数据。”;中位数为50%分位数的microRNA强度大于30背景校正后在所有样本。正常化后,统计学意义的差异表达分析了microrna以及。阈值截止值被设置为1倍变化表明,给定的microrna的表达是统一的病例和对照组。大于1表示的褶皱变化调节microrna,而褶皱的变化小于1表达下调microrna表示。无人监督的层次聚类和关联分析进行microrna的数据。数据表示为平均数±标准差借助SPSS13.0统计软件和分析软件。分类变量进行比较测试和连续变量进行比较以及。的值被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。病人的特点

以microrna的冠状动脉分叉病变的特征,我们招募5冠状动脉分叉病变患者和5患者冠状动脉病变nonbifurcation控制。这些患者中列出的表的特点1。

3.2。识别患者的冠状动脉分叉病变microrna的表达模式

我们进行了微阵列分析来确定患者的冠状动脉分叉病变microrna的表达模式。我们做了一个热图可视化microrna的双向分层聚类的结果(图1)。顶部的颜色比例显示了一个microrna的相对表达水平:红色代表相对表达水平高,而绿色代表相对表达水平较低(8]。

此外,我们做了一个火山阴谋说明microrna冠状动脉分叉病变之间的差异表达和冠状动脉病变nonbifurcation(图2)。我们确认197 microrna差异表达在冠状动脉分叉病变和冠状动脉病变nonbifurcation之间,其中包括150 microrna调节和47个microrna表达下调(补充文件1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/351015)。

3.3。确认不同的冠状动脉分叉病变患者的血清microrna

确认我们的结果,我们选择三个最差异表达的microrna,包括2调节(miR30d和miR222)和一个表达下调(miR1246),显示差异超过10次。我们招收了100名分叉病变患者和100例nonbifurcation病变。如表中所示2,两组没有明显差异,包括年龄,性别,吸烟的状态,高血压和糖尿病。

如图3,rt - pcr分析表明,循环血清miR30d水平非常高冠状动脉分叉病变患者相比nonbifurcation病变患者()。循环miR222水平适度但不显著增加冠状动脉分叉病变患者相比nonbifurcation病变患者()。此外,血清miR1246水平显著低于分叉病变患者比nonbifurcation病变患者()。这些数据证实了我们的微阵列分析的结果。

4所示。讨论

冠状动脉疾病(CAD)是一种多因素疾病,可影响多种环境和遗传危险因素。CAD已经严重影响人类的生活和健康。冠状动脉粥样硬化导致CAD是一个主要原因。动脉粥样硬化是一种慢性和进步的病理过程,其特征是脂类的积累和纤维元素在大型动脉,导致许多心血管类疾病。动脉粥样硬化的发展包括以下步骤:泡沫细胞形成、积累脂肪条纹,血管平滑肌细胞的迁移和增殖(VSMCs)和纤维帽的形成。最后,不稳定的纤维帽的破裂引起血栓形成,导致不稳定冠状动脉综合征、心肌梗死和中风。

冠状动脉介入治疗冠心病的有效手段。冠状动脉分叉容易形成动脉粥样硬化斑块是由于湍流血流量和高剪切应力。治疗冠状动脉分叉病变介入心脏病学,但代表一个具有挑战性的领域最新进展在经皮冠状动脉介入(PCI)导致病人的数量显著增加成功的经皮治疗。与nonbifurcation干预措施相比,分岔的干预措施有一个低利率的过程成功,过程成本上升、再住院治疗,和更高的临床和血管造影再狭窄。引入药物洗脱支架(DES)导致了较低的主要血管事件率和减少再狭窄(MV)。然而,侧枝(某人)开口病变残余狭窄和长期的再狭窄仍然是一个问题(9]。

小分子核糖核酸(microrna)是一类短,非编码,单链RNA分子,大约22个核苷酸长度。他们负调节基因的表达通过信使rna抑制翻译或通过促进mRNA退化。新出现的证据表明,microrna是至关重要的监管机构的各种过程包括细胞增殖、分化、凋亡,生存,能动性,形态发生10]。最近,已报告特定的microrna的表达谱作为一种预后因子或疾病进展的一个预测因素。特别是,血清microrna可能被用作生物标志物诊断(6]。在病理过程中,microrna与心肌肥大,心肌纤维化,心力衰竭和心律失常。一系列的microrna参与冠心病的病理过程和疾病的发展中扮演关键的角色(11- - - - - -13]。

霍克斯特拉等人调查microrna的潜在生物标志物为CAD和报道,不稳定心绞痛患者可以从稳定患者歧视基于mir - 134的表达水平相对较高,mir - 198, mir - 370在外周血单核细胞(14]。因此,我们假设在CAD血清microrna的水平可能会改变,这些microrna可以用作生物标记。在这项研究中,我们进行了微阵列分析识别197 microrna基因差异表达与冠状动脉分叉病变患者的血清,其中包括150 microrna调节和47个microrna表达下调。经过严格的选拔,我们筛选3 microrna基因差异表达,包括下调miR1246和调节miR30d miR222。进一步大样本验证200个病人表现出不同的冠状动脉分叉病变患者血清microrna的表达模式;miR30d调节,miR1246表达下调与nonbifurcation病变患者。与我们的结果一致,最近的一项研究报道,miR30d调节在糖尿病心肌病(15]。因此,miR30d可能是一个有前途的标记和各种心血管疾病治疗的目标。miR222可以发挥重要作用在血管炎症的规定(16]。在这项研究中,我们发现循环miR222水平并没有显著增加冠状动脉分叉病变患者相比nonbifurcation病变患者。这将是重要的进一步确认miR222在冠状动脉分叉病变的功能。到目前为止,miR1246主要参与癌症发展报告(17,18]。miR1246在心血管疾病中的作用需要进一步研究。

5。结论

这是第一个研究使用微阵列方法探讨血清microrna和冠状动脉分叉病变之间的关系。评估筛选,并根据他们的目标下调microrna mrna和生物意义会给出一些提示在冠状动脉分叉病变的功能作用。我们的研究表明,这些microrna可能作用在冠状动脉分叉病变的发病机制和可能代表的新生物标志物冠状动脉分叉病变的诊断和预后。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

刘燕和陈Shaoliang设计研究,写论文。俊杰,Shoujie山、梁,荣王,静菅直人和徐天进行实验和分析数据。所有作者阅读和批准了期末论文。

确认

这项研究是由江苏省特殊项目的医学科学(BL2013001)。作者感谢患者以极大的热情参与了这项研究,临床医生和护士,吴杰(上海Kangcheng生物技术公司)和张磊(上海英杰公司生物技术公司)的技术援助。

补充材料