文摘
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。大约有40%的颅内肿瘤诊断为神经胶质瘤。困难治疗恶性表型密切相关,它的特点是过度增殖,无情的入侵和血管生成。尽管大脑神经胶质瘤的综合治疗水平不断进步,这一恶性肿瘤的结果并没有大幅改善。因此,新的生物标记的识别这种恶性肿瘤的诊断和治疗是重要的科学和临床价值。FRAT1 Wnt /是一个积极的监管机构β连环蛋白信号通路,在许多人类肿瘤。在目前的研究中,我们调查的表达状态FRAT1 68年人类神经胶质瘤患者和与病理分级的相关性,增殖,入侵,血管生成,和预后意义。这些发现表明,FRAT1可能是神经胶质瘤的肿瘤发生和发展的一个重要因素,潜在生物标志物可以探索病理诊断、预后的指标,和恶性肿瘤生物治疗的目标。
1。介绍
神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。大约有40%的颅内肿瘤诊断为神经胶质瘤(1]。困难治疗恶性表型密切相关,它的特点是过度增殖,无情的入侵和血管生成。尽管大脑神经胶质瘤的综合治疗水平不断进步,这一恶性肿瘤的结果并没有大幅改善。例如,患者最恶性病理亚型,胶质母细胞瘤(GBM),携带最糟糕的预后,少于12个月的平均生存期,尽管经历了手术治疗结合放疗和化疗(2]。因此,新的生物标记的识别这种恶性肿瘤的诊断和治疗是重要的科学和临床价值。
FRAT1(经常重新安排在先进的t细胞lymphomas-1)基因位于人类染色体10 q24.1 [3),编码一个29 kDa蛋白由279个氨基酸组成。FRAT1 Wnt /是一个积极的监管机构β连环蛋白信号通路(4- - - - - -6),在许多人类肿瘤(7- - - - - -11]。最近,我们证明了FRAT1表达式是高架在神经胶质瘤(12,13),其表达与病理分级有关,增殖和凋亡在星形细胞瘤(13]。FRAT1的表达被认为是细胞恶性表型的维护的关键。然而,人们很少知道贡献FRAT1表达神经胶质瘤的预后。在目前的研究中,我们调查的表达状态FRAT1 68年人类神经胶质瘤患者和与病理分级的相关性,增殖,入侵,血管生成,和预后意义。这些结果可能在预测临床预后都有重要意义和理解这些肿瘤的生物学。
2。材料和方法
2.1。肿瘤标本
六十八例胶质瘤患者纳入回顾性研究。所有的例手术治疗的神经外科部门Xijing医院隶属于第四军医大学从2007年6月到2009年8月。病人包括35个男性和29岁的女性年龄在6到76年(平均值±标准偏差(SD))。所有肿瘤组织得到从最初的手术前化疗或放射治疗。切除的区段(总计切除(大于90%)或全切除(60%到90%)被记录的基础上,外科医生的术中术后影像学证实的印象没有或残留病的存在。切除的程度大于60%,所有患者的研究。组织学亚型和肿瘤病理成绩量化根据修改后的世界卫生组织(世卫组织)标准中枢神经系统(1如下:10例年级我,所有pilocytic神经胶质瘤;与二级19例,其中包括16弥漫性神经胶质瘤,2间胶质瘤,1原浆神经胶质瘤;与三级16例,包括12个未分化神经胶质瘤和4未分化间胶质瘤;和第四年级23例,恶性胶质瘤。所有样本的病理成绩由两个病理学家独立证实。五个样品稍微受损脑组织碎片从志愿者脑创伤被用作控制。23例胶质母细胞瘤患者手术治疗,放射治疗,辅助化疗。他们跟踪每2个月至少24个月后治疗。本研究机构审查委员会批准的Xijing医院第四军医大学,西安,中国。所有参与者提供书面知情同意之前,他们的参与。 For participants who lack mental or physical capacity to consent, written informed consent on behalf of the participant was provided by a legal proxy.
2.2。免疫组织化学
免疫组织化学,4μ米厚的串行部分从石蜡包埋标本被削减,安装在poly-L-lysine-coated幻灯片和孵化隔夜60°C。在二甲苯脱蜡的部分,其次是补液和降低乙醇浓度的解决方案。对常规病理检查,deparaffinized部分所有的块都与苏木精和伊红染色。未发现组织学异常的部分从任何5正常控制大脑组织。燥热引起抗原进行了检索与0.01柠檬酸缓冲(pH值6.0)10分钟。内源性过氧化物酶活性和特异性的结合被封锁H为3%2O2分别和多发地血清。部分被孵化与初级抗体在一夜之间在4°C调湿室。兔子反FRAT1 (U-25)多克隆抗体用于1:50稀释(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。鼠标反PCNA单克隆抗体(PC10),鼠标反MMP-9 (2 c3)单克隆抗体,和鼠标反CD34 (d - 6)单克隆抗体稀释1:100年与磷酸缓冲盐(PBS)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。主要的抗体被发现使用适当的标记Streptavidin-Biotin (LSAB)工具包(Maixin生物技术、福州、中国)根据制造商的指示。Immunolabeled部分可视化有3′,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride(轻拍;σ,圣路易斯,密苏里州,美国),用苏木精复染色。特异性控制,PBS代替主抗体排除非特异性结合的二次抗体。所有免疫染色实验是由一位经验丰富的病理学家评估蒙蔽所有临床数据。数字显微图像捕获与奥林巴斯BX 51显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。
2.3。染色的解释
免疫组织化学染色结果是由两个独立的神经病理学评估没有知识的病理诊断或任何肿瘤标本的临床资料。实验的另一个独立的神经病理学家的身份发言蒙蔽和患者招募了争端的特定部分的得分。褐黄色染色在细胞质中被认为是阳性FRAT1 MMP-9;褐黄色核被认为是PCNA阳性染色;和褐黄色染色在血管内皮细胞被认为是CD34阳性。测量FRAT1免疫反应性分数(IRS),增殖指数(Pi),和侵入性指数(Ii), 10大功率(400 x)字段(约1000个细胞)是随机选择的量化最强烈彩色肿瘤区域的每个部分。的FRAT1免疫反应性得分(FRAT1 IRS)是由半定量的评估根据弗里德里希描述的方法et al。14]。值的百分比FRAT1-positive肿瘤细胞(0 < 1%;1、1 - 25%;2、26 - 50%;3,51 - 75%;4 > 75%)乘以FRAT1染色强度的值(0,没有染色;1、淡黄色;2、浅黄色;3、棕色)计算FRAT1国税局。由于肿瘤细胞的非均匀染色强度,后者值根据大多数细胞的染色强度决定的。 Specimens with an IRS score >1 were considered FRAT1 positive. The percentages of PCNA-positive cells and MMP-9-positive cells were regarded as the Pi and Ii of the specimen, respectively. The average values of the Pi and Ii from two neuropathologists were adopted. The microvessel density (MVD) of gliomas was measured according to the method described previously [15]。简单地说,在最激烈的地区新血管形成,个别微脉管数量在200 x放大。内皮细胞或内皮细胞集群被认为是一个可数微脉管。微血管MVD表达的绝对数量/ 200 x领域针对每种情况。
2.4。统计分析
所有统计分析使用SAS统计分析系统,版本9.3 (SAS研究所Inc .卡里,数控,美国)。数据被表示为平均数±标准差。FRAT1国税局的差异,π,Ii, MVD在不同病理成绩首次分析了使用单向方差分析(方差分析);然后每个两组之间的差异被Student-Newman-Keuls进一步对比测试(SNK测试)。之间的差异π,二世和MVD FRAT1-positive和FRAT1-negative团体使用学生的比较t以及。相关系数的FRAT1国税局π,Ii, MVD使用皮尔逊相关性分析进行评估。斯皮尔曼等级测试是用于建立与FRAT1国税局组织学成绩的相关性,π,Ii, MVD。kaplan meier生存分析的概率进行评估病人生存,测量的时候,“绿带运动”的诊断是由随后的手术切除死于任何原因。生存率较是用来比较FRAT1-positive和消极之间的平均存活时间表达式组。单变量和多变量分析是用来定义预后因素,存活时间的影响。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。FRAT1是神经胶质瘤中
我们之前的结果表明,在神经胶质瘤中FRAT1是过表达的评估通过rt - pcr、免疫印迹和免疫组织化学(12,13]。来验证这些发现68年组的神经胶质瘤患者在这项研究中,我们评估了FRAT1彩色部分的免疫反应性。Immunopositive主要胞质标签在光学显微镜下肿瘤细胞显示。FRAT1的阳性表达率为58.82%(40/68),意思是FRAT1国税局68年肿瘤标本;然而,5正常脑组织标本有极其薄弱或缺乏这种蛋白质的免疫反应性。这些结果验证我们之前发现FRAT1是神经胶质瘤中。代表性的图片FRAT1疣状图所示1,相关结果表1。
3.2。FRAT1与病理相关年级,增殖指数,侵入性指数和神经胶质瘤微血管密度
我们之前证明FRAT1表达与肿瘤分级和增殖,病理评估ki - 67染色(13]。在这项研究中,FRAT1国税局积极,明显与增加谁的成绩(,)(图2(一个);表1)。增殖细胞核抗原表达的所有细胞增殖标记肿瘤标本(图1),所有肿瘤标本的π范围从0.8到85.3% (%)。与胶质瘤病理分级的增加,π显著增加(,)(图2 (b);表1)。细胞标记MMP-9入侵的阳性表达率为86.76%(59/68)在肿瘤标本(图1)。肿瘤标本的二世范围从0.0到69.0% (%)。神经胶质瘤的病理分级的增加伴随着显著增加二世(,)(图2 (c);表1)。在所有肿瘤微血管观察标本(图1)。大脑神经胶质瘤的MVD范围从14到145 (),显著增加的大脑神经胶质瘤病理分级的增加(,)(图2 (d);表1)。这些结果验证我们之前发现FRAT1表达与肿瘤分级和扩散和扩展的结果表明FRAT1也涉及恶性神经胶质瘤的其他属性,包括侵袭性和微血管的形成。
(一)
(b)
(c)
(d)
评估之间的相关性恶性肿瘤的FRAT1国税局和其他措施,我们进行皮尔逊的回归分析。π(,),二世(,)和MVD (,)都与FRAT1国税局呈正相关(图3)。来证实这些结果,我们68年的神经胶质瘤标本分为两组基于FRAT1积极性。π,Ii, MVD FRAT1-positive组均显著地高于FRAT1-negative组(表2)。总的来说,这些结果表明,FRAT1表达式可以作为生物标志物不同病理等级和不同的神经胶质瘤恶性肿瘤的特征。
(一)
(b)
(c)
3.3。FRAT1表达状态与GBM的预后有关
确定FRAT1表达式可能预后价值,我们比较23 GBM患者的预后在我们的研究中根据FRAT1状态的肿瘤。FRAT1-positive组患者2年总体生存率较低(5.56%;比FRAT1-negative GBM患者(1/18)40%;2/5)。此外,平均存活时间(12和18个月)减少FRAT1-positive与FRAT1-negative组。kaplan meier生存情节显示统计学意义之间的联系正FRAT1表达式和糟糕的结果GBM患者(;图4)。
FRAT1是否可以作为一个独立的预后因子,我们使用Cox回归分析FRAT1表达和其他几个临床病理的变量对病人的存活率。年龄、FRAT1积极性和肿瘤大小都表示是重要的预后因素单变量Cox回归分析(表3)和多变量Cox回归分析(表4测试),而其他变量(性别、切除程度和Karnofsky性能状态)与总体存活率没有显著关联。这些结果表明,FRAT1表达式可能表明贫穷GBM患者总生存期。
4所示。讨论
Wnt /β连环蛋白信号据报道是一种进化保守后生动物动物的分子机制。这条通路在胚胎发生中起着至关重要的作用,细胞增殖,分化,生存,神经发育,和血管生成16- - - - - -19]。大量研究表明,异常激活Wnt /β连环蛋白信号通路与广泛的人类癌症有关,包括乳腺癌、急性白血病和结肠癌7- - - - - -11,20.- - - - - -22]。研究人员还证实,Wnt /β连环蛋白信号通路与起始,增殖,入侵,病理性血管生成,神经胶质瘤的预后23- - - - - -28]。
FRAT1是首次发现protooncogene导致小鼠t细胞淋巴瘤的发展(29日]。英镑的隔离,FRAT1同族体非洲爪蟾蜍(5),FRAT1逐渐被视为一种有效的催化剂的Wnt /β连环蛋白通路。FRAT1由Dvl招募和竞争GSK-3轴蛋白的结合位点β,导致GSK-3的离解β从一个脚手架复杂的包含APC和轴蛋白。的离解GSK-3β反过来,防止的磷酸化和间接降解β连环蛋白(6,30.- - - - - -32]。因此,磷酸化β连环蛋白在细胞质中积累并且把原子核。在细胞核中,β连环蛋白结合t细胞因子(TCF) / lymphoid-enhancing因子(LEF);然后形成一个转录复杂可增加致癌目标基因的表达(33]。这个途径被认为是导致肿瘤恶化。因此,它是合理的,FRAT1发现惊人的过表达在一些人类癌症,包括食道癌,宫颈癌,乳腺癌,卵巢癌,和非小细胞肺癌7- - - - - -11]。
众所周知,恶性肿瘤的主要特征是无限增殖,入侵和血管生成。在当前的研究中,我们证实FRAT1通常是在神经胶质瘤的表达水平FRAT1都随着呈极显著的正相关关系,谁的成绩。我们证实神经胶质瘤的π增加增加年级使用另一种标记扩散,我们还展示了一个神经胶质瘤协会年级二世和MVD。此外,我们表明,与πFRAT1表达呈正相关,第二,MVD各种统计技术。重要的是,过度FRAT1被证明与贫穷GBM患者的总生存期。我们所知,这是第一次评估的贡献FRAT1表达神经胶质瘤患者的生存。
总的来说,这些观测表明,FRAT1可能发挥关键作用的开发和发展神经胶质瘤由于其多个生物活动参与促进增殖、入侵和血管生成。我们建议FRAT1可能是一个有用的生物标记分子诊断,神经胶质瘤的预后的指标,和一个有趣的候选人神经胶质瘤治疗的目标。因为关键遗传、表观遗传和环境因素与gliomagenesis仍不完全定义,我们的发现不仅提供更多知识的角色Wnt /β连环蛋白通路发挥在神经胶质瘤的肿瘤发生,也有助于小说治疗神经胶质瘤患者的治疗策略。有研究报道,FRAT1可能增加的磷酸化的沉默β连环蛋白,导致下降β连环蛋白水平(22]。超表达的详细机制FRAT1 Wnt在神经胶质瘤和它的确切作用β连环蛋白通路仍有待进一步调查。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
耿郭元立著的构思和设计实验和起草。Cheng-liang钟和霁金参与研究的设计和执行统计分析。耿郭、杨刘、毛Xing-gang,郑张Jing,刘洋,虹宇Jin-ming毛,郭先生进行了实验。所有作者阅读和批准了期末论文。耿郭,Cheng-liang钟,杨和刘贡献同样这项工作。
确认
作者欣赏李娜Wu博士(病理学系,第一医院、山西医科大学)和李Ya-qin博士(病理学系,山西大邑医院)的病理诊断证实本研究中使用的所有样品,并帮助进行微观分析。他们也谢谢陈Meng-na, Ting Liu Ting Lv,鑫Lv,鑫荣为本研究做准备。这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81201991),中国山西省基础研究项目(没有。2012021035 - 5),程序的优秀创新团队的高等学习机构山西、和山西省卫生厅科研课题(没有。201301066)。